Summary
亚甲蓝染料注射入肾盂有助于评估尿路结肠梗阻的缺陷, 在小鼠胚胎泌尿道发育。在这里, 一个协议的亚甲蓝染料注射到肾盂是描述。
Abstract
尿路结肠梗阻是先天性异常, 诱发肾积水和 us。小鼠泌尿道结肠梗阻的缺陷可以通过跟踪在泌尿系统内的亚甲基蓝染料流动来评估。将亚甲蓝染料注入围产期胚胎肾脏的肾盂中, 在应用静水压后, 通过输尿管肾脏的肾盂和膀胱腔内的染料流进行监测。在正常围产期泌尿道的膀胱腔内, 染料堆积明显, 但在肾盂与输尿管异常的终点之间, 如果出现尿路梗阻, 则会受到限制。该方法可促进尿路结肠梗阻的确诊和肾积水和 us 的可视化。这份手稿描述了一个协议的亚甲蓝染料注射液进入肾盂, 确认泌尿道交界处的障碍。
Introduction
泌尿系统包括一对肾脏和输尿管和一个共同的膀胱和尿道。泌尿系统的主要功能是通过管理血液的水和电解质平衡来维持身体的稳态。肾脏过滤血液以控制电解质浓度和酸碱平衡, 并产生尿液排出过量的水和废物, 包括溶质和代谢物。然后, 尿液通过输尿管从肾脏的肾盂转移到 bladderin 的单向的方式, 它是储存和最终消除通过尿道1。
输尿管是来自肾导管的直管。在小鼠胚胎日 10.5 (E10.5) 的肾导管萌芽后, 输尿管柄拉长并分化成一种称为膀胱的多层结构, 在小鼠 E12.5 和 E16.5 之间是不透水的。输尿管柄周围的间充质细胞也被分为三层, 包括内基质细胞、中层粗平滑肌细胞和外外成纤维细胞。输尿管蠕动波起始于肾盂, 通过输尿管壁的平滑肌层传播至膀胱以传输尿液2,3, 它是在鼠标1中从 E16.5 开始生成的。
先天性异常的肾脏和泌尿道 (CAKUT) 是最常见的遗传性疾病, 目前在大约1% 的人类胎儿1,4, 并组成的各种表型包括肾积水和 us。肾脏和输尿管的尿液异常积累导致积水肾和 us 的形成。肾积水和/或 us 形成的一个原因是尿路梗阻。肾盂结肠梗阻 (UPJO) 是由于在近端输尿管和肾盂之间的堵塞造成的尿流异常, 导致肾积水和近端 us 狭窄与角度或持续折叠5, 6。此外, 远端输尿管的异位插入膀胱壁或生殖道称为输尿管结肠梗阻 (UVJO)。UVJO 还可诱发肾积水和 hydromegaureter 形成7,8。另外的输尿管结 (UVJ) 缺陷是膀胱回流 (VUR)。VUR 的特点是逆行尿流从膀胱向肾脏在 UVJ。与 UVJO 相比, 围产期胚胎与 VUR 不明显显示肿胀积水肾或严重 us 表型9。
在实验小鼠, 尿液流动可以通过注射染料, 如亚甲蓝, 进入肾盂9。injectedmethylene 蓝溶液将从肾盂经输尿管进入膀胱, 追踪尿液轨迹。肾积水可以通过在肾脏中的染料的膨胀来识别。UPJO 可被检测为堵塞的染料流在近端输尿管与肿胀肾盂5。经加宽的直径所示的输尿管的任何扩张都显示了 us 的一个例子。最后, 染料堆积在膀胱壁或在生殖道的站点表明 UVJO 与膨胀的积水肾脏和扩张的 hydromegaureter7,10。为了检测 VUR, 染料溶液注入膀胱, 随后的逆行流在肾脏的9中被监测。
在这里, 提出了一个协议的亚甲蓝染料注射到肾盂的围产期胚胎。这项协议允许追踪尿液从肾盂通过输尿管和进入膀胱, 并验证潜在的泌尿道交界处的障碍, 如 UPJO 或 UVJO。
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Protocol
鼠标 ( Wnt5a flox / flox 小鼠 (Wnt5a tm1.1Tpy ) 和 Dll1Cre 线, UVJO 小鼠模型) 7 是根据 NIH 关于实验室动物护理和使用的指导方针进行管理的。并根据由动物保护和使用委员会批准的议定书进行研究.
1. 亚甲基蓝染料溶液的制备
- 测量 0.1 g 亚甲蓝粉.
- 在10毫升生理盐水或1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中完全由涡流溶解亚甲基蓝.
- 用注射器过滤器 (膜孔径0.45 和 #181; m) 过滤10毫克/毫升亚甲基蓝溶液, 以消除注射过程中的堵塞.
- 组装一个无菌头皮静脉集 (27GX3/4 和 #8243;) 与3毫升一次性注射器和填充注射器3毫升过滤亚甲蓝溶液.
注意: 为了防止静水压和随后的染料流动, 将针尖放在装有亚甲基蓝溶液的注射器上.
2。产前胚胎解剖
- 用70% 乙醇清洗解剖剪刀和镊子.
- 在 E18.5 或 E19.5 中收集围产期胚胎, 先使用 CO 2 吸入, 然后根据 NIH 指南执行宫颈脱位.
注意: 怀孕的雌性老鼠通常从 E18.5 开始分娩, 但是, 较大的肾脏更容易操作。因此, 在 E19.5 接近出生的肾脏更容易进行这一分析。然而, 有双侧尿路阻塞的幼崽在出生后死亡。根据实验小鼠的特点, 应该经验地确定适当的收集日/时间. - 在腹腹表面喷洒70% 乙醇, 然后用解剖剪刀和镊子打开腹腔腹.
- 抬起整个子宫, 用解剖剪刀在子宫角上切开, 将它与身体分开.
- 在培养皿中用 1x PBS 冲洗整个子宫.
- 用解剖剪刀切开子宫分段, 用解剖钳切除胎盘蜕膜, 将胚胎暴露在卵黄囊中.
- 先取下蛋黄囊, 然后用解剖钳取出羊膜, 释放围产期胚胎.
- 用解剖剪刀斩首胚胎。用无菌纱布擦拭多余的血液。在解剖显微镜上, 用数码相机进行成像, 将胚胎从腹面上固定下来。如果需要, 收集它的基因分型的尾巴.
注: 一次进行一次胚胎注射. - 通过撕裂皮肤小心地打开一个胚胎的腹腔。然后, 通过切割或拔出它们来暴露肾脏、输尿管和位于背的膀胱 ( 图 1A ), 小心地清除多余的器官和组织, 如肝脏、胃和肠道。如有必要, 从解剖胚中吸收多余的血液, 用无菌纱布垫.
注: 过量的血液会影响到对染料注射的肾盂识别.
3。注射亚甲基蓝染料到肾盂和监测染料流
- 通过将亚甲基蓝溶液从针尖上排出, 通过静水压来除去针头和油管中的气泡。提起含有染料溶液的注射器, 在针尖的水平以上开始流动, 然后放下注射器停止流动.
- 将针插入靠近输尿管近端的肾盂, 注意不要在放置后再将其干扰。在肾脏中进行染料注射以确定其尿路梗阻.
注: 将染料注射到任何异常的肾脏 7 首先遵循同样的方法来确定其尿路梗阻. - 抬起注射器约20厘米, 以提供静水压, 并让15和 #181; l 60 和 #181; 染料溶液流动的 l。流速将是大约3和 #181; 如果注射器是上升到这个高度在胚胎之上.
- 监测染料的蓝色颜色首先在肾盂中开始, 然后在输尿管的长度, 最后在膀胱腔.
注: 如果将输尿管正确插入膀胱内, 则需要大约5秒才能看到在膀胱腔中出现微弱的染料颜色。如果没有染料的颜色出现在膀胱腔中, 允许染料在被堵塞的地方堆积十五年代. - 将注射器放下以停止染料流并从肾脏中取出针头.
- 使用与显微镜连接的照相机和成像程序, 将肾脏、输尿管和膀胱的图像与染料溶液一起跟踪.
- 将肾脏、us 和染料溶液的最终位置记录在实验室笔记本中.
- 执行3.1 节中描述的对侧肾脏的注射) 到 3.5), 并允许染料流在二十年代总.
注: 膀胱腔内将充满染料溶液, 以强烈的蓝色表示, 如果输尿管被正确插入膀胱腔。经尿路结肠梗阻评估, 输尿管和膀胱可固定切片.
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Representative Results
肾脏和下泌尿系统位于背部的大多数其他内脏器官, 如肝脏和肠道。取出这些其他内脏器官后, 可看到一对肾脏和输尿管和一个膀胱 (图 1A)。成功解剖后, 注入肾盂的染料将通过输尿管从肾脏流向膀胱。肾盂是肾中输尿管的漏斗状扩张的近端部分。因此, 染料注射点附近的可见近端输尿管与肾脏连接, 用黑色箭头表示 (图 1B-1C)。注射后用亚甲基蓝染料溶液进入一个肾脏, 染料从肾盂流过输尿管而进入膀胱, 在输尿管和膀胱腔内产生可见的蓝色, 如果尿路障碍物不存在 (图1B).染料溶液通常在正常的输尿管中迅速消失, 甚至在成像之前, 在输尿管的染料颜色是微弱的, 因为正常的输尿管是薄管。然而, 在输尿管内的染料流动可以用解剖显微镜观察。一个强的蓝色在膀胱流明出现作为一个更长的流动的结果大约二十年代在总和以后注射两个肾脏与染料解答 (图 1C)。对侧注射后膀胱内的染料积累表明, 第二泌尿系统没有任何泌尿道结肠梗阻。
合理地注射一个明显异常的肾脏, 以确认任何泌尿道结阻塞。不正常的积水肾脏可以通过其更大的大小或薄透明的表面, 以扩大肾盂。图 2A中描述了肿胀积水肾脏和异常扩张的 us 的例子。扩张的 us 通常会导致更强的可视化, 因为其膨胀的体积比正常的、薄的输尿管保留更多的染料溶液。如果肾脏和/或输尿管在解剖过程中受损, 检查泌尿道交界处的障碍物是不可能的, 因为染料会泄漏 aberrantly 在受损的地点。例如,图 2A中的异常 us 在其中间损坏, 因此, 染料溶液的最终位置不清楚, 尽管在膀胱腔中没有染料 (图 2A), 但 UVJO 无法验证。然而, 这个围产期泌尿系统扩张 us 和肿胀积水肾可能有 UVJO 随着输尿管扩大沿其长度和肾脏明显肿胀。对侧泌尿系统出现正常, 因为它有一个薄的输尿管和染料随后进入膀胱腔 (图 2B)。
图1。亚甲蓝染料注射到正常泌尿系统的例子。(a)从围产期胚胎 (E19.5) 去除多余组织后的典型泌尿系统图像。两个肾脏, 两个输尿管, 和一个膀胱看到生殖器官, 这里睾丸(B)一个例子, 染料注射到正常肾脏。一个射入点入肾脏的肾盂 (黑箭头) 可以被看见。在允许染料流动5秒后, 在输尿管和膀胱腔内可见弱染料颜色. (C)在正常肾脏注射后, 在膀胱腔内的染料积聚。颜色变得强从染料解答的积累在膀胱流明在允许染料以后流动二十年代。肾脏中的弱染料颜色也能显示肾盂。膀胱, 克: 肾, T: 睾丸, U: 输尿管。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。以亚甲蓝染料注入单侧 us 的泌尿系统的例子.(a)一个例子染料注入到泌尿系统与 us 和积水肾脏的新生儿雌性幼崽的染料流十五年代。积水肾脏明显大于对侧肾脏。相应的输尿管扩张, 染料颜色是强烈的可辨认的, 但 us 是明显损坏的, 通过泄漏染料溶液在体腔中观察到。(B)将染料注入到二十年代的单侧 us 的泌尿系统的对侧肾脏. 注入染料溶液进入正常肾脏积聚在膀胱腔内, 证实异常是单边的。B: 膀胱, 香港: 积水肾脏, HU: us K: 肾脏, U: 输尿管, Ut: 子宫角。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
老鼠肾脏是功能开始在 E16.5 和染料射入测试从理论上可能从这个时间点。然而, 肾脏太小, 不能被注射的染料溶液和表型, 如肾积水和 us 没有清楚地观察到, 因为这些表型是由于尿液转运异常而产生的二次作用。这些表型, 从障碍, 如 UPJO 或 UVJO, 是明显的 E18.5 肿胀肾脏和输尿管。E19.5 或新生幼崽的胚胎肾脏比 E18.5 或更年轻的胚胎更容易操作。然而, 有双侧尿路阻塞的幼崽在出生后死亡。因此, 根据实验小鼠的特点, 通过适当选择围产期胚胎或幼崽, 进行实验验证 CAKUT 表型。
仔细解剖, 以保持一个完整的泌尿系统之前, 执行染料注射检查潜在的缺陷。这是非常重要的异常积水肾脏和输尿管, 这是非常膨胀和容易损坏, 在去除额外的组织暴露肾脏和泌尿道。在解剖过程中破坏这些器官将阻止对真正缺陷的完全测定。例如,图 2显示了明显的输尿管扩张, 但染料泄漏无法显示远端 us 的终点。
一定要在注射前从油管和针头中除去气泡, 因为这些气泡会堵塞适当的染料流。解剖成功后, 检查尿路梗阻的关键步骤是将针尖插入肾盂。将针插入肾脏的上半部, 靠近输尿管近端, 有助于引导针尖进入肾盂。针尖应指向近端输尿管。由于肾血管位于近端输尿管附近, 染料可能沿着肾脏血管流动, 除非针尖指向近端输尿管。在这种情况下, 针尖应调整在肾盂向近端输尿管。此外, 针可能通过肾脏, 如果插入太深, 导致染料泄漏出肾脏和进入体腔。小心地将针尖插入肾盂, 并在肾盂内监测针尖, 有助于避免这种失败。有时, 针头会被肾脏组织阻断, 如果没有插入肾盂。在这种情况下, 从针中取出组织, 重新启动液体静压, 重定向针尖朝向肾盂的染料流。此外, 与 CAKUT 相关的表型可能是单边或双边的。因此, 确保对左、右泌尿系统分别进行注射。优选地, 先用明显异常的肾脏进行注射, 以验证 UVJO 是否是单边的。
图像后, 立即注射测试, 因为染料从肾盂通过输尿管迅速。在正常输尿管的成像过程中, 很难看到正常的输尿管, 因为通常是一个薄管, 但在解剖显微镜下可以监测染料的流动。作为一个替代亚甲蓝, 1% 快速绿色在 1x PBS 也可以使用, 并会显示为深绿色的颜色9。除染料注射外, 肾脏的组织学切片和输尿管后 #38; E 染色将证实肾脏和输尿管的缺陷。此外, 影像的部分与输尿管特定的记者是一个额外的方式来确认 UVJO7。然而, 这些部分应该是完整的, 并进行序列切片是必要的, 以避免误报。与传统的泌尿系统 section-based 分析相比, 这种染料注射协议是观察肾脏和专利输尿管完整性的即时方法, 并能直观地显示 UPJO 或 UVJO 等障碍物。
该协议提供了一个简单明了的方法 toquickly 可视化泌尿道结构在后期小鼠的发展, 这使得分析泌尿系统的发展。此处描述的方法可用于评估导致发育性泌尿道缺损的突变, 作为鉴别泌尿道成熟或输尿管发育变化的手段。
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Disclosures
作者没有什么要透露的。
Acknowledgments
我感谢 Dr. 艾伦· o. Perantoni (CDBL/国立卫生研究院/NIH) 支持这份手稿的提交。我还要感谢 Dr. 迈克尔霍尔 (CDBL/国立卫生研究院/nih) 和尼玛拉夏尔马 (CDBL/国立卫生研究院/nih) 编辑这篇手稿。我很感谢赖昌星 (SAIC) 的出色的鼠标饲养。这项工作得到了国立卫生研究院、国家癌症研究所和癌症研究中心的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML | Fisherscientific | 50-983-204 | |
| 3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip | BD | 309657 | |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall corporation | 4614 | |
| Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12" | EXELINT | 26709 | |
| Delicate Operating Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6702 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5135 | |
| Dumont Tweezers; Pattern #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2" | BD | 305106 |
References
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