Summary
Iniezione della tintura del blu di metilene nella pelvi renale facilita la valutazione dei difetti di ostruzione delle vie urinarie giunzione durante lo sviluppo embrionale dell'apparato urinario del mouse. Qui, un protocollo per l'iniezione della tintura del blu di metilene nella pelvi renale è descritto.
Abstract
Difetti di ostruzione delle vie urinarie giunzione sono anomalie congenite inducendo idronefrosi e hydroureter. Difetti di ostruzione giunzione murino delle vie urinarie possono essere valutati da monitorando il flusso di colorante blu di metilene all'interno del sistema urinario. Blu di metilene colorante viene iniettato nella pelvi renale dei reni embrionali perinatale e flusso di tintura è monitorato dalla pelvi renale del rene attraverso l'uretere e nel lume della vescica dopo l'applicazione di pressione idrostatica. Accumulo di colorante sarà evidente nel lume della vescica dell'apparato urinario perinatale normale, ma sarà vincolata tra pelvi renale e il punto finale di un uretere anormale, in caso di ostruzioni delle vie urinarie. Questo metodo facilita la conferma delle ostruzioni di giunzione delle vie urinarie e visualizzazione di idronefrosi e hydroureter. Questo manoscritto descrive un protocollo per l'iniezione della tintura del blu di metilene nella pelvi renale per confermare ostruzioni di giunzione delle vie urinarie.
Introduction
Il sistema urinario è costituito da una coppia di reni e ureteri e un comune della vescica e dell'uretra. La funzione principale del sistema urinario è di mantenere l'omeostasi corporea gestendo l'equilibrio di acqua ed elettroliti del sangue. I reni filtrano il sangue per controllo di concentrazione di elettroliti e l'equilibrio acido-base e producono urina per espellere l'acqua in eccesso e rifiuti tra cui soluti e metaboliti. Urina viene quindi trasportato attraverso l'uretere dalla pelvi renale del rene per la bladderin un modo unidirezionale dove viene immagazzinata e infine eliminata attraverso l' uretra1.
Gli ureteri sono tubi dritti che proviene dal dotto nephric. Dopo in erba dal dotto nephric al giorno embrionale 10.5 (e 10.5) nel topo, il gambo di uretere si allunga e differenzia in una struttura multistrata denominata urothelium che è impermeabile tra mouse 12.5 ed E16.5. Le cellule mesenchimali che circondano il gambo dell'uretere sono anche differenziate in tre strati composto da cellule stromali interne, cellule di muscolo liscio spessore intermedio e fibroblasti adventitial esterni. Le onde peristaltiche ureterale avvio nella pelvi renale vengono propagate attraverso lo strato di muscolo liscio della parete dell'uretere alla vescica per il trasporto di urine2,3, che è prodotto a partire da E16.5 in mouse1.
Anomalie congenite del rene e delle vie urinarie (CAKUT) sono tra le più frequenti malattie genetiche, presente in circa 1% dei feti umani1,4e composto di una varietà di fenotipi compreso idronefrosi e hydroureter. L'abnorme accumulo di urina nel rene e uretere provoca hydronephrotic del rene e hydroureter formazione. Una causa di formazione di idronefrosi e/o hydroureter è un'ostruzione delle vie urinarie. Ureteropelvic della giunzione (UPJO) è causato dal flusso di urina aberrante a causa di un blocco tra l'uretere prossimale e la pelvi renale, con conseguente idronefrosi e prossimale hydroureter restringimento con angolazione o persistente pieghevole5, 6. Inoltre, l'inserimento ectopica dell'uretere distale nella parete della vescica o del tratto riproduttivo viene chiamato ostruzione giunzione ureterovesical (UVJO). UVJO può anche indurre l'idronefrosi e hydromegaureter formazione7,8. Un difetto di giunzione (UVJ) ulteriori ureterovesical è reflusso vesicoureteric (RVU). VUR è caratterizzata da flusso retrogrado dell'urina dalla vescica verso il rene presso UVJ. Rispetto al UVJO, perinatali embrioni con VUR non distintamente mostrano un rene hydronephrotic dilatato o grave hydroureter fenotipo9.
Nel topo di laboratorio, il flusso di urina può essere esaminato tramite l'iniezione di un colorante, come il blu di metilene, nel bacino renale9. La soluzione di injectedmethylene blu si traccia la traiettoria di urina dalla pelvi renale attraverso l'uretere e la vescica. Idronefrosi possono essere riconosciuto da un'espansione del colorante nel rene. UPJO può essere rilevato come un blocco del flusso di tintura all'uretere prossimale con pelvi renale dilatata5. Qualsiasi dilatazione dell'uretere indicato da un diametro allargato di seguito viene illustrato un esempio di hydroureter. Infine, accumulo di colorante alla parete della vescica o presso il sito del tratto riproduttivo indica UVJO con rene hydronephrotic dilatato e dilatato hydromegaureter7,10. Per rilevare VUR, la soluzione colorante viene iniettata nella vescica e conseguente flusso retrogrado è monitorato nel rene9.
Qui, un protocollo per l'iniezione di colorante blu di metilene nella pelvi renale di un embrione perinatale è presentato. Questo protocollo permette l'analisi del flusso di urina dalla pelvi renale attraverso l'uretere e la vescica e verifica potenziali ostacoli di giunzione delle vie urinarie come UPJO o UVJO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
topi (Wnt5a flox / flox topi (Wnt5a tm1.1Tpy) e Dll1Cre linea, modello murino UVJO) 7 erano gestiti secondo le linee guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio Studiò con un protocollo approvato dal comitato di uso e NCI-Frederick Animal Care.
1. preparazione della soluzione di colorante blu di metilene
- misura 0,1 g di blu di metilene polvere.
- Sciogliere completamente il blu di metilene in salino normale 10 mL o 1 x tamponato fosfato salino (PBS) nel Vortex.
- Filtrare la soluzione di blu di metilene 10 mg/mL con un siringa filtro (dimensione dei pori di membrana 0.45µm) per eliminare l'intasamento durante l'iniezione.
- Montare un sterile del cuoio capelluto vena set (27GX3/4 ″) con una siringa monouso da 3 mL e riempire la siringa con 3 mL di filtrato soluzione di blu di metilene.
Nota: Per evitare successive tintura flusso e pressione idrostatica, posizionare la punta dell'ago sopra la siringa riempita con soluzione di blu di metilene.
2. Dissezione di embrioni prenatale
- pulito di dissezione Forbici e pinze con etanolo al 70%.
- Per raccogliere embrioni perinatali a E18.5 o e 19.5, eutanasia topi incinti prima mediante inalazione di CO 2 e quindi eseguire dislocazione cervicale secondo linee guida NIH.
Nota: Il mouse femmina incinto solitamente dà vita a partire da E18.5, tuttavia, i reni più grandi sono più facili da manipolare. Di conseguenza, reni a e 19.5 più vicino alla nascita sono più facili da eseguire questa analisi su. Tuttavia, cuccioli con bilaterale delle vie urinarie ostruzioni muoiono dopo la nascita. A seconda delle caratteristiche di topi sperimentali, una raccolta appropriata giorno e ora dovrebbe essere determinata empiricamente. - Spray etanolo al 70% sulla superficie addominale ventrale e quindi aprire la cavità addominale ventrale utilizzando pinze e forbici per dissezione.
- Sollevare l'intero utero e separarla dal corpo di taglio con forbici alle punte dei corni uterini di dissezione.
- Sciacquare l'intero utero con PBS 1X in una capsula Petri.
- Tagliare l'utero segmentally con forbici di dissezione e rimuovere placenta decidua con forcipe per esporre gli embrioni nei sac di tuorlo di dissezione.
- Rimuovere il sacco vitellino prima e poi rimuovere la membrana amniotic con forcipe per liberare gli embrioni perinatali di dissezione.
- Decapitare un embrione con forbici di dissezione. Pulire il sangue in eccesso con compresse di garza sterile. L'embrione pin con la sua superficie ventrale up in un microscopio per dissezione equipaggiato con una fotocamera digitale per l'imaging. Raccogliere la sua coda per genotipizzazione se necessario.
Nota: Eseguire un embrione iniezioni alla volta. - Aprire con cautela la cavità addominale di un embrione con forcipe strappando la pelle. Quindi, rimuovere con delicatezza in eccesso organi e tessuti quali fegato, stomaco e intestino con forcipe tagliandoli o tirarle fuori per esporre i reni, ureteri e vescica che sono situati dorsalmente ( Figura 1A). Assorbire il sangue in eccesso dall'embrione dissecata con compresse di garza sterile se necessario.
Nota: Il sangue in eccesso interferisce con identificazione della pelvi renale per l'iniezione di colorante.
3. Iniezione di colorante blu di metilene nella pelvi renale e monitoraggio del flusso di tintura
- Rimuovi bolle nell'ago e la tubazione espellendo soluzione di blu di metilene dalla punta dell'ago dalla pressione idrostatica. Sollevare la siringa contenente la soluzione di colorante sopra il livello della punta dell'ago per avviare il flusso e quindi abbassare la siringa per interrompere il flusso.
- Inserire l'ago nella pelvi renale vicino l'uretere prossimale, facendo attenzione a non per disturbare una volta posizionati. Eseguire l'iniezione della tintura in un rene per determinare la sua ostruzione dell'apparato urinario.
Nota: Eseguire la tintura prima iniezione in qualsiasi renale anormale 7 seguendo allo stesso modo per determinare la sua ostruzione dell'apparato urinario. - Sollevare la siringa fino a circa 20 cm per fornire pressione idrostatica e lasciare 15 µ l - 60 µ l del flusso di soluzione del colorante. La portata sarà circa 3 µ l/s se la siringa è aumentata a questa altezza sopra l'embrione.
- Monitorare il colore blu della tintura a partire prima nella pelvi renale, poi nella lunghezza dell'uretere e infine nel lume della vescica.
Nota: Si impiegano circa 5 s per vedere un colore tintura debole emergono all'interno del lumen della vescica se l'uretere è correttamente inserito nella vescica. Consentire il colorante ad accumularsi nel sito bloccato circa 15 s se nessun colore tintura compare nel lume della vescica. - Posizionare la siringa fino a fermata tintura flusso e rimuovere l'ago dal rene.
- Foto per scattare foto di rene, uretere e vescica tracciata con soluzione colorante con la fotocamera e programma di imaging collegato a uno stereomicroscopio.
- Fare un record di idronefrosi del rene, hydroureter e la posizione finale della soluzione colorante in un quaderno di laboratorio.
- Eseguire l'iniezione di rene controlaterale come descritto nelle sezioni 3.1) a 3.5) e consentire il flusso di tintura circa 20 s in totale.
Nota: Il lume della vescica sarà riempito di soluzione colorante, indicata da un colore blu forte, se l'uretere è inserito correttamente nel lume della vescica. Dopo la valutazione dell'ostruzione della giunzione delle vie urinarie, ureteri e vescica può essere fissate per sezionamento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I reni e il sistema urinario inferiore si trovano dorsale alla maggior parte degli altri organi interni come il fegato ed intestino. Dopo la rimozione di questi altri organi interni, una coppia di reni e ureteri e vescica una singola sono visibili (Figura 1A). Al momento di successo dissezione, il colorante iniettato nella pelvi renale fluirà dal rene nella vescica tramite l'uretere. La pelvi renale è la parte prossimale dilatata imbuto dell'uretere nel rene. Pertanto, il punto di iniezione del colorante è vicino l'uretere prossimale visibile collegato con il rene come indicato con frecce nere (Figura 1B-1C). Dopo l'iniezione con soluzione colorante blu di metilene in un rene, il colorante scorre dalla pelvi renale attraverso l'uretere e nella vescica causando una colorazione blu visibile nel lume dell'uretere e della vescica, se non sono presenti ostruzioni delle vie urinarie (Figura 1B ). La soluzione colorante di solito scomparirà in un uretere normale rapidamente anche prima di formazione immagine e il colore della tintura nell'uretere è debole perché l'uretere normale è un tubo sottile. Tuttavia, flusso di tintura nell'uretere può essere osservata con un microscopio per dissezione. Un forte colore blu nel lume della vescica appare come il risultato di un flusso più lungo di circa 20 s in totale dopo l'iniezione di entrambi i reni con la soluzione di colorante (Figura 1). Accumulo di colorante nella vescica dopo l'iniezione controlaterale indica che il secondo sistema urinario non dispone di alcuna ostruzione della giunzione delle vie urinarie.
È ragionevole iniettare un rene ovviamente anormale prima per confermare eventuali ostruzioni di giunzione delle vie urinarie. Reni hydronephrotic anormali possono essere riconosciuti dai loro più grande la dimensione o la superficie sottile trasparente con un esteso bacino renale. Un rene hydronephrotic dilatato di esempio e un hydroureter anormalmente dilatate sono raffigurati nella Figura 2A. Un hydroureter dilatata provoca solitamente una visualizzazione molto più forte perché il suo volume espanso conserva soluzione colorante molto di più rispetto a un normale, sottile dell'uretere. Se i reni e/o gli ureteri sono danneggiati durante la dissezione, l'esame delle ostruzioni di giunzione delle vie urinarie è impossibile perché il colorante colerà aberrante al sito danneggiato. Ad esempio, il hydroureter anormale nella Figura 2A è stato danneggiato nel suo centro e, di conseguenza, la posizione finale della soluzione colorante è chiara e UVJO non può essere verificato nonostante l'assenza del colorante nel lume della vescica (Figura 2A). Tuttavia, questo sistema urinario perinatale con hydroureter dilatata e rene hydronephrotic dilatato può avere UVJO come l'uretere è allargato lungo la sua lunghezza e il rene è dilatato distintamente. Il sistema urinario controlaterale appare normale ha un uretere sottile ed il colorante entra successivamente il lume della vescica (Figura 2B).
Figura 1. Esempi di iniezione della tintura del blu di metilene in un normale sistema urinario. (A) un'immagine tipica del sistema urinario da un embrione perinatale (e 19.5) dopo la rimozione del tessuto in eccesso. Due reni, due ureteri e vescica sono visti con gli organi riproduttivi, qui testicoli (B) un esempio di inserimento del tracciante in un rene normale. Un punto di iniezione nella pelvi renale del rene (freccia nera) può essere visto. Un colore tintura debole è visibile nell'uretere e il lume della vescica dopo consentendo la tintura a fluire per 5 s. accumulo di colorante (C) nel lume della vescica dopo l'iniezione di entrambi i reni normali. Il colore diventa forte dall'accumulazione della soluzione colorante nel lume della vescica dopo consentendo la tintura di fluire per 20 s. La pelvi renale è anche visibile con il colore della tintura debole nel rene. B: vescica, t: testicolo, k: rene, uretere u:. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Esempi di blu di metilene tingono iniezione in un sistema urinario con unilaterale hydroureter. (A) un esempio di inserimento del tracciante in un sistema urinario con un hydroureter e un rene hydronephrotic di un cucciolo femmina neonatale con flusso di tintura di 15 s. Il rene hydronephrotic è chiaramente più grande di rene controlaterale. L'uretere corrispondente è dilatata e il colore della tintura è fortemente riconoscibile ma il hydroureter è chiaramente danneggiato come osservato da fuoriuscite di soluzione colorante nella cavità del corpo. (B) l'iniezione della tintura nel rene controlaterale di un sistema urinario con unilaterale hydroureter con flusso di tintura di 20 s. soluzione colorante iniettato in rene normale si accumula nel lume della vescica che conferma che l'anomalia è unilaterale. B: vescica, HK: rene hydronephrotic, HU: hydroureter k: rene, uretere u:, Ut: corno uterino. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I reni mouse sono inizio funzionale alle E16.5 e una prova di iniezione della tintura è teoricamente possibile da questo punto di tempo. Tuttavia, il rene è troppo piccolo per essere iniettato con la soluzione colorante e fenotipi quali idronefrosi e hydroureter non si osservano chiaramente dal momento che questi fenotipi sono un effetto secondario di urina accumulato a causa del trasporto delle urine anormali. Questi fenotipi, da ostruzioni quali UPJO o UVJO, sono evidenti alle E18.5 di dilatato reni e ureteri. Reni più grandi degli embrioni e 19.5 o cuccioli neonatali sono più facili da manipolare rispetto a quelle degli embrioni a E18.5 o più giovani. Tuttavia, cuccioli con bilaterale delle vie urinarie ostruzioni muoiono dopo la nascita. Pertanto, eseguire esperimenti per convalidare fenotipi CAKUT scegliendo opportunamente gli embrioni perinatali o cuccioli a seconda delle caratteristiche sperimentale del topo.
Sezionare con cura per mantenere un sistema urinario intatto prima di eseguire l'iniezione della tintura per esaminare potenziali difetti. Questo è essenzialmente importante per anormale hydronephrotic reni e ureteri, che sono molto dilatato e facilmente danneggiati durante la rimozione del tessuto supplementare per esporre i reni e vie urinarie. Danneggiare questi organi durante la dissezione impedirà una determinazione completa dei difetti reali. Ad esempio, la figura 2 Mostra la dilatazione distinta di un uretere, ma la perdita della tintura non riesce a mostrare il punto terminale del hydroureter distale.
Sempre essere sicuri di rimuovere le bolle d'aria dalla tubazione e l'ago prima dell'iniezione, come queste bolle si bloccheranno il flusso corretto. Dopo la dissezione del successo, il passaggio fondamentale per esaminare l'ostruzione delle vie urinarie è inserimento della punta dell'ago nella pelvi renale. L'inserimento dell'ago nella metà superiore del rene, vicino l'uretere prossimale, è utile per dirigere la punta dell'ago nella pelvi renale. La punta dell'ago deve puntare verso l'uretere prossimale. Poiché i vasi sanguigni renali si trovano vicino l'uretere prossimale, la tintura può essere flusso lungo i vasi sanguigni renali a meno che la punta dell'ago rivolta verso l'uretere prossimale. In questo caso, la punta dell'ago deve essere regolata nella pelvi renale verso l'uretere prossimale. Ulteriormente, può passare l'ago attraverso il rene se inserito troppo in profondità, causando la tintura a fuoriuscire fuori del rene e nella cavità del corpo. Attenzione inserimento della punta dell'ago nella pelvi renale e la punta dell'ago all'interno della pelvi renale di monitoraggio può aiutare a evitare questo errore. A volte, l'ago verrà bloccata dal tessuto del rene durante l'iniezione se non è inserita nella pelvi renale. In questo caso, rimuovere il tessuto dall'ago, reimpostare tintura flusso riavviando pressione idrostatica e reindirizzare la punta dell'ago verso la pelvi renale. Inoltre, fenotipi associati con CAKUT possono essere unilaterali o bilaterali. Pertanto, assicurarsi che l'iniezione viene eseguita separatamente per sistemi di sinistro e destra delle vie urinari. In modo ottimale, eseguire l'iniezione prima con un rene ovviamente anormale per verificare se il UVJO è unilaterale.
Immagine immediatamente dopo la prova di iniezione poiché il colorante passa dalla pelvi renale attraverso l'uretere rapidamente. È difficile vedere il colore durante la formazione immagine di un uretere normale perché un uretere normale è un tubo sottile, anche se il flusso di tintura può essere monitorato sotto il microscopio per dissezione. Come alternativa a blu di metilene, 1% veloce verde in PBS 1X può anche essere usato e apparirà come un colore verde scuro9. Oltre a iniezione della tintura, le sezioni istologiche dei reni e ureteri seguendo H & E macchiatura confermerà i difetti all'interno del reni e ureteri. Inoltre, imaging delle sezioni con un reporter specifico dell'uretere è un altro modo per confermare UVJO7. Tuttavia, queste sezioni devono essere intatte e sezionamento seriale è necessaria per evitare falsi positivi. Rispetto ai tradizionali basati su sezione analisi di sistemi urinario, questo protocollo di iniezione di tintura è un modo immediato per osservare l'integrità del rene e dell'uretere brevetto e visualizzare ostruzioni quali UPJO o UVJO.
Questo protocollo fornisce un semplice e semplice metodo ognimodello visualizzare struttura delle vie urinarie in tarda fase di sviluppo del mouse, che permette l'analisi dello sviluppo delle vie urinarie. Il metodo qui descritto può essere utilizzato per valutare le mutazioni che causano i difetti inerenti allo sviluppo delle vie urinarie, come mezzo di identificazione delle modifiche nello sviluppo di maturazione o uretere del tratto urinario.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L'autore non ha nulla di divulgare.
Acknowledgments
Ringrazio il dottor Alan O. Perantoni (NIH/NCI/CDBL) per sostenere la presentazione di questo manoscritto. Ringrazio anche il Dr. Michael Hall (NIH/NCI/CDBL) e Nirmala Sharma (NIH/NCI/CDBL) per la modifica di questo manoscritto. Sono grato a Lai Thang (SAIC) per il suo allevamento eccellente mouse. Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di salute, National Cancer Institute e centro per la ricerca sul cancro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML | Fisherscientific | 50-983-204 | |
| 3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip | BD | 309657 | |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall corporation | 4614 | |
| Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12" | EXELINT | 26709 | |
| Delicate Operating Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6702 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5135 | |
| Dumont Tweezers; Pattern #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2" | BD | 305106 |
References
- Rasouly, H. M., Lu, W. Lower urinary tract development and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).
- Kispert, A. T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract. Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).
- Bohnenpoll, T., Kispert, A.
- Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H., Knoers, N. V. Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT. Nat Rev Nephrol. 11, 720-731 (2015).
- Tripathi, P., Wang, Y., Casey, A. M., Chen, F. Absence of canonical Smad signaling in ureteral and bladder mesenchyme causes ureteropelvic junction obstruction. J Am Soc Nephrol. 23, 618-628 (2012).
- Aoki, Y., et al. Id2 haploinsufficiency in mice leads to congenital hydronephrosis resembling that in humans. Genes Cells. 9, 1287-1296 (2004).
- Yun, K., Perantoni, A. O. Hydronephrosis in the Wnt5a-ablated kidney is caused by an abnormal ureter-bladder connection. Differentiation. 94, 1-7 (2017).
- Uetani, N., Bouchard, M. Plumbing in the embryo: developmental defects of the urinary tracts. Clin Genet. 75, 307-317 (2009).
- Murawski, I. J., Watt, C. L., Gupta, I. R. Assessing urinary tract defects in mice: methods to detect the presence of vesicoureteric reflux and urinary tract obstruction. Methods Mol Biol. 886, 351-362 (2012).
- Weiss, A. C., et al. Nephric duct insertion requires EphA4/EphA7 signaling from the pericloacal mesenchyme. Development. 141, 3420-3430 (2014).
