Summary
Metylenblått dye injektion i njurbäckenet underlättar bedömning av urinvägarna junction obstruktion brister under mus embryonala urinvägarna utveckling. Här beskrivs ett protokoll för metylenblått dye injektion in i njurbäckenet.
Abstract
Urinvägarna junction obstruktion defekter är medfödda missbildningar förmå hydronefros och hydroureter. Murina urinvägarna junction obstruktion defekter kan bedömas genom att spåra metylenblått dye flöde inom urinvägarna. Metylenblått färgämne sprutas in i njurbäckenet perinatal embryonala njurar och färgämne flöde övervakas från njurbäckenet i njuren genom urinledaren och urinblåsan lumen efter applicering hydrostatiska trycket. Dye ackumulering kommer att framgå i urinblåsan lumen normala perinatal urinvägsinfektion, men kommer att begränsas mellan njurbäckenet och slutpunkten för en onormal urinledaren, om urinvägarna hinder uppstår. Denna metod underlättar bekräftelsen av urinvägarna junction hinder och visualisering av hydronefros och hydroureter. Detta manuskript beskriver ett protokoll för metylenblått dye injektion i njurbäckenet bekräfta urinvägarna junction hinder.
Introduction
Urinvägarna består av ett par av njurar och urinledare och en gemensam urinblåsan och urinröret. Den huvudsakliga funktionen av urinvägarna är att upprätthålla kroppens homeostas genom att hantera vatten och elektrolyt balansen i blodet. Njurarna filtrerar blodet att kontrollkoncentrationer elektrolyt- och syra-bas balansen och producera urin för att utsöndra överflödigt vatten och avfall inklusive koncentrationsfördelningen och metaboliter. Urinen transporteras sedan genom urinledaren från njurbäckenet av njure till bladderin en enkelriktad sätt där det lagras och slutligen elimineras via urinröret1.
Urinledarna är raka rör med ursprung från nephric kanalen. Efter spirande från nephric kanalen vid embryonala dag 10.5 (E10.5) i musen, urinledaren stjälken förlänger och gör åtskillnad mellan in i ett mångbottnat struktur som kallas urotel som är ogenomtränglig mellan mus E12.5 och E16.5. Mesenkymala cellerna kring urinledaren stjälken är också differentierade i tre lager bestående av inre stromaceller, mellanliggande tjock glatta muskelceller och yttre adventitial fibroblaster. Uretär peristaltiska vågor inleda i njurbäckenet som sprids via det glatta muskulatur lagret av väggens urinledaren till urinblåsan att transportera urin2,3, som är producerad start på E16.5 i mus1.
Medfödda missbildningar i njurar och urinvägar (CAKUT) är bland de mest frekventa genetiska sjukdomarna, närvarande i omkring 1% av mänskliga foster1,4, och består av en mängd olika fenotyper inklusive hydronefros och hydroureter. Onormal ansamling av urin i njurar och urinledare leder hydronephrotic njure och hydroureter bildandet. En orsak till hydronefros och/eller hydroureter bildandet är ett hinder i urinvägarna. Ureteropelvic junction obstruktion (UPJO) orsakas av avvikande urinflöde på grund av en blockering mellan proximala urinledaren och renalt bäckenet, vilket resulterar i hydronefros och proximala hydroureter förträngning med vinkling eller ihållande fällbara5, 6. Dessutom har ektopisk införandet av distala urinledaren till blåsväggen eller fortplantningsorganen kallas ureterovesical junction obstruktion (UVJO). UVJO kan också inducera hydronefros och hydromegaureter bildande7,8. En ytterligare ureterovesical junction (UVJ) defekt är vesicoureteric reflux (VUR). VUR kännetecknas av retrograd urinflödet från urinblåsan mot njurarna på UVJ. Jämfört med UVJO, visar perinatal embryon med VUR inte tydligt en utspänd hydronephrotic njure eller svår hydroureter fenotyp9.
I laboratoriet musen, kan urinflöde undersökas genom injektion av ett färgämne, såsom metylenblått, i njurbäckenet9. Injectedmethylene blå lösningen kommer att spåra urin banan från njurbäckenet genom urinledaren och in i urinblåsan. Hydronefros kan erkännas av en utvidgning av färgämnet i njuren. UPJO kan upptäckas som en blockering av färgämne flöde vid proximala urinledaren med utspänd njurbäckenet5. Någon utvidgning av urinledaren indikeras av en breddad diameter visar ett exempel på hydroureter. Slutligen, färgämne ackumulering på blåsväggen eller på platsen av fortplantningsorganen indikerar UVJO med utspänd hydronephrotic njure och vidgade hydromegaureter7,10. För att upptäcka VUR, färgämne lösningen sprutas in i urinblåsan och efterföljande retrograd flöde övervakas i njure9.
Här presenteras ett protokoll för metylenblått dye injektion i njurbäckenet av en perinatal embryo. Detta protokoll tillåter spårning av urinflödet från njurbäckenet genom urinledaren och in i urinblåsan och verifierar potentiella urinvägarna junction hinder såsom UPJO eller UVJO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
möss (Wnt5a flox / flox möss (Wnt5a tm1.1Tpy) och Dll1Cre linje, UVJO musmodell) 7 sköttes enligt NIH riktlinjer för skötsel och användning av försöksdjur och studerade under ett protokoll som godkänts av NCI-Fredrik djur vård och användning kommittén.
1. beredning av metylenblått Dye lösning
- mäta 0,1 g metylenblått pulver.
- Lös metylenblått i 10 mL fysiologisk koksaltlösning eller 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) helt genom att vortexa.
- Filtrera 10 mg/mL metylenblåttlösningen med en spruta filter (membran porstorlek 0.45µm) för att eliminera igensättning under injektion.
- Montera en steril hårbotten ven uppsättning (27GX3/4 ″) med en 3 mL engångsspruta och Fyll sprutan med 3 mL filtreras lösning av metylenblått.
Obs: För att förhindra hydrostatiskt tryck och efterföljande dye flöde, placera nålspetsen ovanför den sprutan som är fylld med lösning av metylenblått.
2. Dissektion av Prenatal embryon
- ren dissekera sax och pincett med 70% etanol.
- Att samla perinatal embryon på E18.5 eller E19.5, eutanasi dräktiga möss först använda CO 2 inandning och sedan utföra cervikal dislokation enligt NIH riktlinjer.
Obs: Gravid kvinna musen föder oftast start på E18.5, dock större njurar är lättare att manipulera. Njurarna på E19.5 närmare till födelse är därför lättare att utföra denna analys på. Dock PUP med bilaterala urinvägarna hinder dör efter födseln. Beroende på vad som kännetecknar experimentella möss, en lämplig samling/tid empiriskt bestämmas. - Spray 70% etanol på ventrala buken ytan och sedan öppna bukhålan ventralt använder dissekera sax och pincett.
- Lyft hela livmodern och skilja det från kroppen genom att skära med dissekera saxen på tips av livmoderns horn.
- Skölj hela livmodern med 1 x PBS i en petriskål.
- Klippa livmodern segmentally med dissekera sax och ta bort moderkakan decidua med dissekera pincett för att exponera embryona i äggula sacs.
- Ta bort gulesäcken först och sedan fostervatten membranet med dissekera pincett för att befria perinatal embryona.
- Halshugga ett embryo med dissekera saxen. Torka bort överflödigt blod med steril gasbinda kuddar. Fästa embryot med dess ventrala yta upp på dissekera Mikroskop utrustat med en digital kamera för avbildning. Samla in svansen för genotypning om nödvändigt.
Obs: Utföra injektioner ett embryo i taget. - Öppna försiktigt bukhålan av ett embryo med tången genom att riva huden. Sedan, ta försiktigt bort överflödigt organ och vävnader såsom levern, magen och tarmen med tången genom att skära dem eller dra dem ut för att exponera njurarna, urinledarna och urinblåsan som är belägen dorsalt ( figur 1A). Absorbera överflödigt blod från dissekerade embryot med steril gasbinda kuddar om nödvändigt.
Obs: Överskott blod stör med identifiering av njurbäckenet för dye injektion.
3. Injektion av metylenblått färgämne in i njurbäckenet och övervakning Dye Flow
- ta bort bubblor i nålen och slangen genom att utvisa från kanylspetsen lösning av metylenblått av hydrostatiskt tryck. Lyft den spruta som innehåller färgämnet lösningen ovanför kanylspetsen att starta flödet, och sedan sänka sprutan för att stoppa flödet.
- För in nålen i njurbäckenet nära proximala urinledaren, noga med att inte störa en gång placerat. Utföra dye injektion i en njure att avgöra dess urinvägarna obstruktion.
Obs: Utföra färga injektion i någon onormal njur 7 första genom att följa samma sätt att bestämma dess urinvägarna obstruktion. - Lyft sprutan upp ca 20 cm att ge hydrostatiskt tryck och låt 15 µL - 60 µL av färgämne lösning flödet. Flödet blir ca 3 µL/s om sprutan höjs till denna höjd ovanför embryot.
- Övervaka den blå färgen på färgen börjar först i njurbäckenet, sedan i längden på urinledaren, och slutligen i urinblåsan lumen.
Obs: Det tar ungefär 5 s att se en svag färg färg framträder inom urinblåsan lumen om urinledaren är ordentligt isatt i urinblåsan. Tillåta färgämnet ackumuleras på den blockerade webbplatsen ca 15 s om ingen färgämne färg visas i urinblåsan lumen. - Placera sprutan ner till stopp dye flöde och ta bort nålen från njuren.
- Ta bilder av njurarna, urinledaren och urinblåsan spåras med dye-lösning med hjälp av kamera och bildhantering program ansluten till ett stereomikroskop.
- Antecknar hydronefros njuren, hydroureter och slutpositionen för dye lösningen i ett lab notebook.
- Utför injektion av den kontralaterala njuren som beskrivs i avsnitt 3.1) till 3,5) och tillåta dye ca 20 s totalt.
Obs: Urinblåsan lumen kommer att fyllas med dye lösning, indikeras av en stark blå färg, om urinledaren är ordentligt isatt i urinblåsan lumen. Efter bedömning av urinvägarna junction obstruktion, urinledarna och urinblåsa kan fastställas för snittning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Njurarna och nedre urinvägarna är placerade rygg till de flesta andra inre organ såsom levern och tarmen. Efter bort dessa andra inre organ, ett par av njurar och urinledare och en enda blåsa är synlig (figur 1A). Vid lyckad dissektion, kommer färgen sprutas in i njurbäckenet flöde från njuren in i urinblåsan via urinledaren. I njurbäckenet är den tratt-liknande vidgade proximala delen av urinledaren i njuren. Dye insprutningspunkten är därför nära synliga proximala urinledaren ansluten med njuren som anges med svarta pilar (figur 1B-1 C). Efter injektion med lösning av metylenblått färgämne i en njure, färgen flödar från njurbäckenet genom urinledaren och in i urinblåsan resulterar i en synlig blå färg i urinledaren och urinblåsan lumen, om urinvägarna hinder inte finns (figur 1B ). Dye lösningen försvinner vanligtvis i en normal urinledaren snabbt redan innan imaging och färgämne färgen i urinledaren är svag eftersom den normala urinledaren är en tunn slang. Dye flöde i urinledaren kan dock observeras med dissekera Mikroskop. En stark blå färg i urinblåsan lumen visas som resultatet av en längre flöde på ca 20 s totalt efter injektion av båda njurarna med dye-lösningen (figur 1 c). Dye ackumulering i urinblåsan efter den kontralaterala injektionen indikerar att andra urinvägarna inte har någon urinvägsinfektion junction obstruktion.
Det är rimligt att injicera en uppenbarligen onormal njur först för att bekräfta urinvägarna junction hinder. Onormala hydronephrotic njurarna kan kännas igen genom sin större storlek eller tunn genomskinlig yta med en breddad njurbäckenet. Ett exempel utspänd hydronephrotic njure och en onormalt vidgade hydroureter avbildas i figur 2A. En dilaterad hydroureter resulterar vanligen i en mycket starkare visualisering eftersom dess utökade volymen behåller mycket mer färgämne lösning än en normal, tunn urinledaren. Om njurarna eller urinledarna förstörs under dissektion, är undersökning av urinvägarna junction hinder omöjligt eftersom färgämnet kommer att läcka ut aberrantly på den skadada platsen. Till exempel den onormala hydroureter i figur 2A var skadad i mitten och, därför, slutpositionen för dye lösningen är oklart och UVJO inte kan verifieras trots avsaknaden av färgämnet i urinblåsan lumen (figur 2A). Denna perinatala urinvägarna med dilaterade hydroureter och utspänd hydronephrotic njure kan dock ha UVJO som urinledaren vidgas längs dess längd och njurarna är utpräglat utspänd. Kontralaterala urinvägarna visas normalt eftersom den har en tunn urinledaren och färgämnet därefter träder urinblåsan lumen (figur 2B).
Figur 1. Exempel på metylenblått dye injektion i en normala urinvägar. (A) en typisk bild av urinvägarna från en perinatal embryo (E19.5) efter att ta bort överflödig vävnad. Två njurar, två urinledare och en urinblåsa ses med fortplantningsorganen, här testiklarna (B) ett exempel på dye injektion i en normal njure. En injektion punkt in i njurbäckenet i njuren (svart pil) kan ses. En svag färg färg syns i urinledaren och urinblåsan lumen efter att låta färgen rinna för 5 s. (C) färgämne ackumulering i urinblåsan lumen efter injektion av både normala njurar. Färgen blir starkt från ansamling av färgämne lösningen i urinblåsan lumen efter att låta färgen rinna för 20 s. I njurbäckenet är också synlig med svag färg färg i njuren. B: urinblåsan, K: njure, T: testis, U: urinledaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Exempel på metylenblått dye injektion i en urinvägarna med ensidiga hydroureter. (A) ett exempel på dye injektion i en urinvägarna med en hydroureter och en hydronephrotic njure av en neonatal kvinnliga pup med dye flöde 15 s. Hydronephrotic njuren är klart större än den kontralaterala njuren. Motsvarande urinledaren är vidgade och färgämne färgen är starkt igenkännbara men hydroureter är klart skadad såsom läckande dye lösning i kroppen hålighet. (B) färgämne injektion i den kontralaterala njuren av en urinvägarna med ensidiga hydroureter med dye flöde av 20 s. Injected dye lösning i den normala njuren ansamlas i urinblåsan lumen bekräftar att abnormitet är ensidiga. B: urinblåsa, HK: hydronephrotic njure, HU: hydroureter K: njure, U: urinledaren, Ut: livmoderns horn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mus njurar är funktionella början på E16.5 och ett färgämne injektion test är teoretiskt möjligt från denna tidpunkt. Dock njuren är för liten för att injiceras med dye lösningen och fenotyper såsom hydronefros och hydroureter tydligt iakttas inte eftersom dessa fenotyper är en sekundär effekt av urin byggt upp på grund av onormal urin transport. Dessa fenotyper, från hinder som UPJO eller UVJO, är uppenbara vid E18.5 av utspänd njurar och urinledare. Större njurar av embryon vid E19.5 eller neonatala valpar är lättare att manipulera än de embryon på E18.5 eller yngre. Dock PUP med bilaterala urinvägarna hinder dör efter födseln. Därför utföra experiment för att verifiera CAKUT fenotyper genom att på lämpligt sätt välja perinatal embryon eller pups beroende på experimentell mus egenskaper.
Dissekera försiktigt för att bibehålla en intakt urinvägarna innan du utför dye injektion för att undersöka potentiella defekter. Detta är i huvudsak viktigt för onormala hydronephrotic njurar och urinledare, som är mycket utspänd och lätt skadade under borttagning av extra vävnad att exponera njurar och urinvägar. Skadar dessa organ under dissektion kommer att förhindra en fullständig bestämning av verkliga defekter. Exempelvis figur 2 visar tydlig dilatation av en urinledare, men dye läckaget inte visar terminal peka av den distala hydroureter.
Alltid vara säker på att ta bort luftbubblor från slangen och injektionsnålen före injektion som dessa bubblor blockerar korrekt dye vattenflödet. Efter framgångsrika dissektion är den kritiska steget att undersöka urinvägarna obstruktion införandet av nålens spets in i njurbäckenet. Införandet av nålen i den övre halvan av njure, nära proximala urinledaren, är bra att rikta nålens spets in i njurbäckenet. Nålens spets ska peka mot proximala urinledaren. Eftersom nedsatt blodkärl ligger nära proximala urinledaren, kan färgen rinna längs nedsatt blodkärl såvida nålens spets pekar mot proximala urinledaren. I detta fall bör nålens spets justeras i njurbäckenet mot proximala urinledaren. Vidare kan nålen passerar njurarna om det sitter för djupt, orsakar färgämnet att läcka ut ur njurarna och i kroppen hålighet. Försiktig insättning av nålens spets i njurbäckenet och övervakning nålens spets inom njurbäckenet kan bidra till att undvika detta misslyckande. Nålen kommer ibland blockeras av njure vävnad under injektion om den inte sätts in i njurbäckenet. I detta fall ta bort vävnad från nålen, återställa dye flöde genom att starta om hydrostatiskt tryck och omdirigera nålens spets mot njurbäckenet. Dessutom, kan fenotyper som är associerad med CAKUT vara ensidiga eller bilaterala. Se därför till att injektionen utförs separat för vänster och höger urinvägar system. Optimalt, utför injektionen först med en uppenbarligen onormal njure att kontrollera om UVJO är ensidiga.
Bilden omedelbart efter injektion testet eftersom färgen passerar från njurbäckenet genom urinledaren snabbt. Det är svårt att se färgen under avbildning av en normal urinledaren eftersom en normal urinledaren är en tunn slang, fast dye flöde kan övervakas under mikroskopet dissekera. Som ett alternativ till metylenblått, 1% snabb grön i 1 x PBS kan också användas och visas som en mörkgrön färg9. Förutom färgen injektion, histologiska sektioner av njurar och urinledare efter H & E färgning kommer att bekräfta defekterna i njurar och urinledare. Dessutom är avbildning av sektioner med urinledaren specifika reporter ytterligare ett sätt att bekräfta UVJO7. Men dessa avsnitt ska vara intakt och seriell sektionering är nödvändigt att undvika falsklarm. Detta färgämne injektion protokoll jämfört med traditionella avsnitt-baserade analyser av urin-system, och är ett instant sätt respektera integriteten av njure och patent urinledaren och visualisera hinder såsom UPJO eller UVJO.
Detta protokoll ger en enkel och okomplicerad metod toquickly visualisera urinvägarna struktur i sent skede mus utveckling, vilket gör att analysen av urinvägarna utveckling. Den metod som beskrivs här kan användas för att bedöma mutationer som orsakar utvecklingstoxicitet urinvägarna defekter, som ett sätt att identifiera förändringar i urinvägarna mognad eller urinledaren utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har något att avslöja.
Acknowledgments
Jag tackar Dr Alan O. Perantoni (CDBL/NCI/NIH) för att stödja inlämnande av detta manuskript. Jag tackar också Dr Michael Hall (CDBL/NCI/NIH) och Nirmala Sharma (CDBL/NCI/NIH) för att redigera Detta manuskript. Jag är tacksam att Lai Thang (SAIC) för hans utmärkta mus djurhållning. Detta arbete stöds av de National institutionerna of Health, National Cancer Institute och centrum för cancerforskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML | Fisherscientific | 50-983-204 | |
| 3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip | BD | 309657 | |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall corporation | 4614 | |
| Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12" | EXELINT | 26709 | |
| Delicate Operating Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6702 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5135 | |
| Dumont Tweezers; Pattern #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2" | BD | 305106 |
References
- Rasouly, H. M., Lu, W. Lower urinary tract development and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).
- Kispert, A. T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract. Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).
- Bohnenpoll, T., Kispert, A. Ureter growth and differentiation. Semin Cell Dev Biol. 36, 21-30 (2014).
- Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H., Knoers, N. V. Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT. Nat Rev Nephrol. 11, 720-731 (2015).
- Tripathi, P., Wang, Y., Casey, A. M., Chen, F. Absence of canonical Smad signaling in ureteral and bladder mesenchyme causes ureteropelvic junction obstruction. J Am Soc Nephrol. 23, 618-628 (2012).
- Aoki, Y., et al. Id2 haploinsufficiency in mice leads to congenital hydronephrosis resembling that in humans. Genes Cells. 9, 1287-1296 (2004).
- Yun, K., Perantoni, A. O. Hydronephrosis in the Wnt5a-ablated kidney is caused by an abnormal ureter-bladder connection. Differentiation. 94, 1-7 (2017).
- Uetani, N., Bouchard, M. Plumbing in the embryo: developmental defects of the urinary tracts. Clin Genet. 75, 307-317 (2009).
- Murawski, I. J., Watt, C. L., Gupta, I. R. Assessing urinary tract defects in mice: methods to detect the presence of vesicoureteric reflux and urinary tract obstruction. Methods Mol Biol. 886, 351-362 (2012).
- Weiss, A. C., et al. Nephric duct insertion requires EphA4/EphA7 signaling from the pericloacal mesenchyme. Development. 141, 3420-3430 (2014).
