Summary
Injection de colorant de bleu de méthylène dans le bassinet facilite l’évaluation des voies urinaires junction obstruction défauts au cours du développement embryonnaire des voies urinaires chez la souris. Ici, un protocole pour l’injection de colorant de bleu de méthylène dans le bassinet est décrite.
Abstract
Défauts d’obstruction des voies urinaires junction sont des anomalies congénitales induisant une hydronéphrose et hydroureter. Murine urinaires junction obstruction défauts peuvent être évaluées grâce au suivi des flux de colorant de bleu de méthylène au sein du système urinaire. Colorant de bleu de méthylène est injecté dans le bassinet des reins embryonnaires périnatales et flux de colorant est contrôlée depuis le bassinet du rein par le biais de l’uretère et dans la lumière de la vessie après l’application de la pression hydrostatique. Accumulation de colorant se manifesteront dans la lumière de la vessie du tractus urinaire normal périnatale, mais sera limitée entre le bassinet et le point final d’un uretère anormale, obstruction des voies urinaires en cas. Cette méthode facilite la confirmation des obstructions de jonction des voies urinaires et la visualisation de l’hydronéphrose et hydroureter. Ce manuscrit décrit un protocole pour l’injection de colorant de bleu de méthylène dans le bassinet pour confirmer les obstructions de jonction des voies urinaires.
Introduction
Le système urinaire se compose d’une paire de reins et uretères et une commune la vessie et l’urètre. La fonction principale du système urinaire est de maintenir l’homéostasie de l’organisme de gestion de l’équilibre de l’eau et d’électrolytes du sang. Les reins filtrent le sang pour contrôle électrolyte concentrations et équilibre acido-basique et produisent de l’urine pour excréter les excès d’eau et des déchets, y compris des solutés et métabolites. Urine est ensuite transporté par le biais de l’uretère du bassinet du rein à la bladderin de manière unidirectionnelle, où elle est stockée et finalement éliminé par l' urètre1.
Les uretères sont des tubes droits provenant de la gaine de réserves. Après bourgeonnement de la gaine de réserves à jour embryonnaire 10,5 (E10.5) chez la souris, la tige de l’uretère s’allonge et différencie en une structure multicouche appelée urothélium imperméable entre souris E12.5 et E16.5. Les cellules mésenchymateuses entourant la tige de l’uretère sont aussi différenciés en trois couches, consistant en des cellules stromales internes, fibres musculaires lisses intermédiaires épais et fibroblastes adventitiels externes. Les ondes péristaltiques urétérales initier dans le bassinet sont propagées à travers la couche de muscles lisses de la paroi de l’uretère jusqu'à la vessie pour transporter l’urine2,3, qui est produit à partir de E16.5 dans la souris1.
Anomalies congénitales du rein et des voies urinaires (CAKUT) sont parmi les maladies génétiques les plus fréquentes, présentes chez environ 1 % des foetus humains1,4et composé d’une variété des phénotypes y compris hydronéphrose et hydroureter. L’accumulation anormale de l’urine dans le rein et l’uretère conduit à la formation de rein et hydroureter hydronephrotic. Une cause de formation de l’hydronéphrose ou hydroureter est une obstruction des voies urinaires. Obstruction de jonction Ureteropelvic (UPJO) est causée par l’écoulement de l’urine anormale causée par un blocage entre l’uretère proximal et le bassinet, entraînant une hydronéphrose et hydroureter proximal rétrécissement avec angulation ou persistants pliant5, 6. En outre, l’insertion ectopique de l’uretère distal dans la paroi de la vessie ou de l’appareil génital est appelée obstruction de jonction ureterovesical (UVJO). UVJO peut également induire une hydronéphrose et hydromegaureter formation7,8. Un défaut de jonction (UVJ) ureterovesical supplémentaires est reflux vésicourétérique (RVU). VUR se caractérise par l’écoulement de l’urine rétrograde de la vessie vers le rein à UVJ. Par rapport à UVJO, embryons périnatales avec VUR ne distinctement montrent un rein hydronephrotic distendu ou de phénotype sévère hydroureter9.
Chez la souris de laboratoire, écoulement de l’urine peut être examiné par l’injection d’un colorant, comme le bleu de méthylène, dans le bassinet9. La solution de bleu d’injectedmethylene retracera le trajet de l’urine du bassinet par le biais de l’uretère et la vessie. Hydronéphrose se distingue par une expansion du colorant dans le rein. UPJO peut être détecté comme un blocage de l’écoulement de la teinture à l’uretère proximal avec bassinet dilaté5. Toute dilatation de l’uretère par un diamètre élargi montre un exemple de hydroureter. Enfin, accumulation de colorant à la paroi de la vessie ou sur le site de l’appareil génital indique UVJO rein hydronephrotic distendu et dilatées hydromegaureter7,10. Pour détecter les VUR, la solution de colorant est injectée dans la vessie et flux rétrograde subséquente est contrôlée dans le rein9.
Ici, un protocole pour l’injection de colorant de bleu de méthylène dans le bassinet d’un embryon de périnatale est présenté. Ce protocole permet le suivi du flux d’urine le bassinet par le biais de l’uretère et la vessie et vérifie les potentiels obstacles de jonction des voies urinaires tels que UPJO ou UVJO.
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Protocol
souris (Wnt5a flox / souris flox (Wnt5a tm1.1Tpy) et Dll1Cre ligne, modèle de souris UVJO) 7 étaient gérés selon les directives des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et a étudié sous un protocole approuvé par le Comité de l’emploi et de la NCI-Frederick animalier.
1. préparation de Solution de colorant bleu de méthylène
- mesurer la poudre de bleu de méthylène de 0,1 g.
- Dissoudre le bleu de méthylène dans 10 mL de soluté physiologique ou 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) complètement vortexer.
- Filtrer la solution de bleu de méthylène de 10 mg/mL avec une seringue-filtre (taille des pores membranaires 0.45µm) pour éliminer l’obstruction pendant l’injection de. Ensemble des veines
- Assemble un cuir chevelu stérile (27GX3/4 ″) avec une seringue de 3 mL et remplir la seringue de 3 mL filtré la solution de bleu de méthylène.
Remarque : Pour empêcher la pression hydrostatique et flux teinture ultérieure, placez la pointe de l’aiguille au-dessus de la seringue remplie de solution de bleu de méthylène.
2. Dissection des embryons prénatal
- propre disséquant les ciseaux et pinces avec l’éthanol à 70 %.
- Pour recueillir les embryons périnatales au E18.5 ou E19.5, euthanasier souris enceintes tout d’abord à l’aide de CO 2 par inhalation, puis effectuez une dislocation cervicale selon les lignes directrices des NIH.
Remarque : La souris femelle enceinte habituellement donne naissance à partir de E18.5, mais plus gros reins sont plus faciles à manipuler. Par conséquent, les reins à E19.5 plus près à la naissance sont plus faciles à réaliser cette analyse sur. Cependant, chiots avec die obstruction bilatérale des voies urinaires après la naissance. Selon les caractéristiques des souris de laboratoire, une date et heure de collecte approprié devrait être empiriquement déterminée. - Spray éthanol à 70 % sur la surface ventrale abdominale et puis ouvrez la cavité abdominale sur le ventre à l’aide de ciseaux et pinces de dissection.
- Lever tout l’utérus et le séparer du corps par une coupe avec les ciseaux à l’extrémité des cornes utérines de dissection.
- Rincer tout l’utérus avec du PBS 1 x dans une boîte de Pétri.
- Couper l’utérus bandes avec ciseaux de dissection et enlever decidua placentaire avec dissection forceps pour exposer les embryons en sacs vitellins.
- Enlevez d’abord le sac vitellin et puis enlever la membrane amniotique avec dissection forceps pour libérer les embryons périnatales.
- Décapiter un embryon avec ciseaux de dissection. Essuyer l’excès de sang avec tampons de gaze stérile. Cerner l’embryon avec sa face ventrale vers le haut sur un microscope à dissection équipé d’un appareil photo numérique pour l’imagerie. Sa queue pour le génotypage de recueillir si nécessaire.
Remarque : Effectuez un embryon d’injections à la fois. - Ouvrez avec précaution la cavité abdominale d’un embryon avec une pince en déchirant la peau. Ensuite, retirez soigneusement excès organes et tissus tels que le foie, estomac et l’intestin avec une pince en les coupant ou en les tirant pour exposer les reins, les uretères et la vessie qui se trouvent sur le dos ( Figure 1 a). Absorber le sang excédentaire de l’embryon disséqué avec tampons de gaze stérile si nécessaire.
NOTE : Sang excès interfère avec identification du bassinet pour l’injection de colorant.
3. Injection de colorant de bleu de méthylène dans le bassinet et le suivi des flux de colorant
- enlever des bulles dans l’aiguille et le tube en l’expulsant de solution de bleu de méthylène de l’extrémité de l’aiguille de pression hydrostatique. Soulevez la seringue contenant la solution de colorant au-dessus du niveau de la pointe de l’aiguille pour faire couler souhaitée et puis abaissez la seringue pour arrêter l’écoulement.
- Insérer l’aiguille dans le bassinet près de l’uretère proximal, en prenant soin de ne pas pour le déranger une fois placé. Effectuer l’injection de colorant dans un rein pour déterminer son obstruction des voies urinaires.
Remarque : Effectuez teindre injection dans n’importe quel rein anormal 7 premier par suite de la même manière pour déterminer son obstruction des voies urinaires. - Lever la seringue jusqu'à environ 20 cm pour fournir la pression hydrostatique et laisser 15 µL - 60 µL de l’écoulement de solution de colorant. Le débit sera environ 3 µL/s si la seringue est portée à cette hauteur au-dessus de l’embryon.
- Surveiller la couleur bleue du colorant partant en premier dans le bassinet, puis dans la longueur de l’uretère et enfin dans la lumière vésicale.
Remarque : Il faut environ 5 s pour voir une couleur de teinture faible à émerger dans la lumière vésicale si l’uretère est correctement inséré dans la vessie. Permettre le colorant s’accumuler sur le site bloqué environ 15 s si aucune couleur de teinture apparaît dans la lumière vésicale. - Placer la seringue jusqu'à coule de colorant de stop et de retirer l’aiguille du rein.
- Prendre des images du rein, l’uretère et la vessie tracée avec la solution de colorant à l’aide de l’appareil photo et imagerie programme relié à un stéréomicroscope.
- Faire un compte rendu de l’hydronéphrose du rein, hydroureter et la position finale de la solution de colorant dans un cahier de laboratoire.
- Perform injection du rein controlatéral comme décrit dans les sections 3.1) à 3,5) et permettent l’écoulement de colorant environ 20 s Autotal.
NOTE : La lumière de la vessie sera remplie de solution de colorant, indiquée par une couleur bleue, si l’uretère est correctement insérée dans le lumen de la vessie. Après évaluation de l’obstruction de jonction des voies urinaires, les uretères et la vessie peuvent être fixés pour le sectionnement.
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Representative Results
Les reins et le système urinaire inférieur sont trouvent dorsal à la plupart des autres organes internes comme le foie et les intestins. Après avoir retiré ces autres organes internes, une paire de reins et uretères et la vessie unique sont visibles (Figure 1 a). Après dissection réussie, le colorant injecté dans le bassinet coulera du rein dans la vessie par l’uretère. Le bassinet est l’entonnoir dilatée partie proximale de l’uretère du rein. Par conséquent, le point d’injection de colorant est près de l’uretère proximal visible connecté avec le rein, comme il est indiqué avec des flèches noires (Figure 1 b-1C). Après l’injection de solution de colorant de bleu de méthylène dans un rein, le colorant découle le bassinet par le biais de l’uretère et la vessie, ce qui entraîne une coloration bleue visible dans le lumen de l’uretère et la vessie, si il n’existe pas d’obstruction des voies urinaires (Figure 1 b ). La solution de colorant disparaît généralement dans un uretère normale rapidement avant même que l’imagerie et la couleur du colorant dans l’uretère est faible car l’uretère normal est un tube mince. Toutefois, les flux de colorant dans l’uretère peut être observée avec un microscope à dissection. Une forte couleur bleue dans la lumière de la vessie apparaît comme le résultat d’un écoulement plus long d’environ 20 s au total après l’injection de deux reins avec la solution de colorant (Figure 1). Accumulation de colorant dans la vessie après l’injection controlatérale indique que le deuxième système urinaire n’a pas d’obstruction de jonction des voies urinaires.
Il est raisonnable d’injecter un rein évidemment anormal tout d’abord pour confirmer toute obstruction de jonction des voies urinaires. Hydronephrotic anormale reins sont reconnaissables par leur plus grande taille ou de la mince surface transparente avec un bassinet élargie. Un rein de hydronephrotic distendu exemple et un hydroureter anormalement dilatée sont représentés dans la Figure 2 a. Un hydroureter dilatée se traduit généralement par une beaucoup plus forte visualisation car son volume expansé conserve beaucoup plus solution de colorant qu’un uretère normale, mince. Si les reins ou les uretères sont endommagés au cours de la dissection, l’examen des obstacles de jonction des voies urinaires est impossible car le colorant fuira aberrantly sur le site endommagé. Par exemple, l’hydroureter anormale dans la Figure 2 a a été endommagé en son milieu et, par conséquent, la position finale de la solution de colorant n’est pas claire et UVJO ne peut être vérifiée malgré l’absence du colorant dans la lumière de la vessie (Figure 2 a). Cependant, ce système urinaire périnatal avec hydroureter dilatée et distendu hydronephrotic rein peut avoir UVJO comme l’uretère est élargi sur toute sa longueur et le rein est distinctement distendu. Le système urinaire contralatéral semble normal car il a un uretère mince et le colorant pénètre ensuite dans la lumière de la vessie (Figure 2 b).
Figure 1. Exemples d’injection de colorant de bleu de méthylène dans un système urinaire normal. (A) une image typique du système urinaire d’un embryon périnatal (E19.5) après avoir enlevé l’excès de tissu. Deux reins, deux uretères et la vessie sont vus avec des organes reproducteurs, testicules ICIS (B) un exemple d’injection de colorant dans un rein normal. Un point d’injection dans le bassinet du rein (flèche noire) peut être vu. Une couleur de teinture faible est visible dans l’uretère et la lumière de la vessie après avoir laissé le colorant s’écouler pendant 5 s. accumulation de colorant (C) dans la lumière de la vessie après l’injection de deux reins normaux. La couleur devient forte de l’accumulation de la solution de colorant dans la lumière de la vessie après avoir laissé le colorant s’écouler pendant 20 s. Le bassinet est également visible avec la couleur du colorant faible dans le rein. B : vessie, reins K:, T: testicule, sup : uretère. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Exemples de bleu de méthylène teignent injection dans un système urinaire avec unilatéral hydroureter. (A) un exemple d’injection de colorant dans un système urinaire avec un hydroureter et un rein de hydronephrotic d’un chiot femelle néonatale avec débit de colorant de 15 s. Le rein hydronephrotic est nettement plus grand que le rein controlatéral. L’uretère correspondant est dilaté et la couleur de la teinture est fortement reconnaissable mais le hydroureter est clairement endommagé tel qu’observé par une fuite de solution de colorant dans la cavité du corps. (B) injection de colorant dans le rein controlatéral d’un système urinaire avec hydroureter unilatérale avec débit de colorant de 20 s. solution de colorant Injected dans le rein normal s’accumule dans la vessie de lumen confirmant que l’anomalie est unilatérale. B : vessie, HK : hydronephrotic rein, HU : hydroureter k : rein, sup : uretère, Ut : corne utérine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les reins de souris sont fonctionnelles en commençant à E16.5 et un test d’injection de colorant est théoriquement possible à partir de ce point dans le temps. Toutefois, le rein est trop petit pour être injectés avec la solution de colorant et phénotypes comme hydronéphrose et hydroureter ne sont pas clairement respectées puisque ces phénotypes sont un effet secondaire de l’urine accumulée dues au transport de l’urine anormale. Ces phénotypes, des obstructions telles que UPJO ou UVJO, sont visibles à E18.5 par distendu reins et uretères. Les reins plus d’embryons au E19.5 ou les chiots nouveau-nés sont plus faciles à manipuler que ceux des embryons au E18.5 ou moins. Cependant, chiots avec die obstruction bilatérale des voies urinaires après la naissance. Par conséquent, réaliser des expériences pour valider des phénotypes CAKUT en choisissant convenablement les embryons périnatales ou petits selon caractéristiques expérimentales de souris.
Disséquer attentivement afin de maintenir un système urinaire intact avant d’effectuer l’injection de colorant pour examiner les défauts potentiels. C’est essentiellement important pour anormale hydronephrotic reins et uretères, qui sont très distendu et facilement endommagées lors de l’ablation du tissu supplémentaire pour exposer les reins et les voies urinaires. Abîmer ces organes au cours de la dissection permettra d’éviter une totale détermination des défauts réels. Par exemple, la Figure 2 montre une dilatation distincte d’un uretère, mais la fuite du colorant ne parvient pas à afficher le point terminal de la hydroureter distale.
Toujours s’assurer de retirer les bulles d’air du tube et l’aiguille avant l’injection, car ces bulles peut bloquer les flux de teinture adéquate. Après dissection réussie, l’étape critique pour examiner l’obstruction des voies urinaires est l’insertion de la pointe de l’aiguille dans le bassinet. L’insertion de l’aiguille dans la moitié supérieure du rein, près de l’uretère proximal, est utile pour diriger la pointe de l’aiguille dans le bassinet. La pointe de l’aiguille doit être orientée vers l’uretère proximal. Étant donné que les vaisseaux sanguins rénaux sont situés près de l’uretère proximal, la teinture peut couler le long des vaisseaux sanguins rénaux à moins que la pointe de l’aiguille pointe vers l’uretère proximal. Dans ce cas, la pointe de l’aiguille doit être ajustée dans le bassinet du rein vers l’uretère proximal. De plus, l’aiguille peut passer par les reins si inséré trop profondément, provoquant le colorant à fuir hors du rein et dans la cavité du corps. Attention, insertion de la pointe de l’aiguille dans le bassinet et le suivi de la pointe de l’aiguille dans le bassinet du rein peut aider à éviter cet échec. Parfois, l’aiguille va se bloquer de tissu rénal pendant l’injection si elle n’est pas insérée dans le bassinet. Dans ce cas, retirer le tissu de l’aiguille, zéro colorant flux en relançant la pression hydrostatique et rediriger la pointe de l’aiguille vers le bassinet. En outre, les phénotypes associés avec CAKUT peuvent être unilatérale ou bilatérale. Par conséquent, veiller à ce que l’injection est effectuée séparément pour les systèmes urinaires droite et gauche. Exécuter de manière optimale, l’injection d’abord avec un rein évidemment anormal pour vérifier si le UVJO est unilatérale.
Image immédiatement après l’essai d’injection car le colorant passe du bassinet par l’uretère rapidement. Il est difficile de voir la couleur au cours de l’imagerie d’un uretère normal car un uretère normal est un tube mince, bien que les flux de colorant peut être surveillée sous le microscope à dissection. Comme alternative au bleu de méthylène, 1 % dans du PBS 1 x vert peut également être utilisé et apparaîtra comme une couleur vert foncé9. En plus de l’injection de colorant, des coupes histologiques des reins et des uretères après H & E coloration confirmera les irrégularités dans les reins et les uretères. Aussi, l’imagerie des sections avec un journaliste spécifique de l’uretère est un moyen supplémentaire pour confirmer UVJO7. Cependant, ces sections doivent être intactes, et le sectionnement de série est nécessaire pour éviter les faux positifs. Par rapport aux traditionnelles analyses axées sur les section des systèmes urinaires, ce protocole d’injection de colorant est un chemin immédiat de respecter l’intégrité du rein et l’uretère brevet et de visualiser les obstructions telles que UPJO ou UVJO.
Ce protocole prévoit un simple et simple méthode toquickly visualiser les voies urinaires structure en développement de souris stade tardif, qui permet l’analyse du développement de l’appareil urinaire. La méthode décrite ici peut être utilisée pour évaluer les mutations qui causent des anomalies du développement des voies urinaires, comme un moyen d’identifier les changements dans le développement de maturation ou l’uretère des voies urinaires.
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Disclosures
L’auteur n’a rien à divulguer.
Acknowledgments
Je remercie le Dr Alan O. Perantoni (CDBL/NCI/NIH) pour appuyer la présentation de ce manuscrit. Je remercie également m. Michael Hall (CDBL/NCI/NIH) et Nirmala Sharma (CDBL/NCI/NIH) pour l’édition de ce manuscrit. Je suis reconnaissant à Lai Thang (SAIC) pour son élevage de souris excellent. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health, National Cancer Institute et le centre de recherche sur le Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML | Fisherscientific | 50-983-204 | |
| 3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip | BD | 309657 | |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall corporation | 4614 | |
| Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12" | EXELINT | 26709 | |
| Delicate Operating Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6702 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5135 | |
| Dumont Tweezers; Pattern #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2" | BD | 305106 |
References
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