Summary
メチレン ブルー色素を注入、腎盂マウス胚性尿路開発中に尿路ジャンクション閉塞欠陥の評価が容易になります。ここでは、腎盂にメチレン ブルー色素液を注入するためのプロトコルを説明します。
Abstract
尿路ジャンクション閉塞奇形は、水腎症や水尿管を誘導する先天異常です。マウス尿路ジャンクション閉塞奇形は、尿中のシステム内のメチレン ブルー色素の流れを追跡することによって評価できます。周産期の萌芽期の腎臓の腎盂にメチレン ブルー色素を注入し、静水圧を適用した後尿管と膀胱内腔に腎臓の腎盂から色素の流れを監視します。色素の蓄積は正常周産期尿路膀胱内腔で明らかになりますが、尿路通過障害が発生した場合に, 腎盂と異常な尿管の終了点の間拘束します。このメソッドは、尿路ジャンクション障害物の確認と水腎、水尿管の可視化を促進します。本稿では、メチレン ブルー色素を注入腎盂尿路接合の障害物を確認するためのプロトコルについて説明します。
Introduction
泌尿器系は、腎臓、尿管および一般的な膀胱と尿道のペアで構成されます。泌尿器系の主な機能は、血液の水分・電解質のバランスを管理することによって体の恒常性を維持することです。腎臓はコントロール電解質濃度、酸塩基平衡、血液をろ過し、余分な水分と溶質と代謝産物などを含む廃棄物を排泄する尿を生成します。Bladderin 一方向方法で保存および尿道1で最終的には排除する腎臓の腎盂から尿管を尿後転送します。
尿管がストレート管 nephric 管から発生しました。マウスの萌芽期の日 10.5 (E10.5) で nephric のダクトから出芽後、尿管茎を延長し、E12.5 と E16.5 マウス間透水性である尿路上皮と呼ばれる多層構造に区別します。尿管茎を取り巻く間葉系細胞はまた間質細胞の内側、中間厚い平滑筋細胞と外側の外繊維芽細胞から成る 3 つの層に区別されます。尿2,3マウス1E16.5 でから作り出されるを輸送するため膀胱に尿管壁の平滑筋層を通って腎盂で開始する尿管の蠕動波が反映されます。
腎臓や尿路 (先天) の先天異常は最も頻繁に遺伝的疾患、胎児1,4の約 1% に存在の中で、さまざまな水腎症や水尿管などの表現型から成る。腎臓と尿管の尿の異常な蓄積, 水腎・水尿管の形成で起因します。水腎症や水尿管形成の原因の 1 つは、尿路の閉塞です。腎盂尿管移行部狭窄 (UPJO) は近位尿管と腎盂、腎と湾曲または永続的な折り畳み式5、近位尿管狭窄の結果との間の閉塞が原因の異常尿の流れによって引き起こされる 6。また、膀胱壁や生殖器官に遠位尿管異所挿入尿管移行部狭窄 (UVJO) と呼びます。UVJO することができますも水腎症および hydromegaureter の形成7、8を誘発します。その他尿管ジャンクション (UVJ) 欠陥が度逆流症 (VUR です)。VUR は UVJ で腎臓への膀胱からの逆行性尿の流れによって特徴付けられます。UVJO と比較して、vur が認められた周産期胚はっきりと示さない膨張, 水腎または尿管の深刻な表現型9。
実験室マウスの腎孟9へのメチレン ブルーなどの色素の注入によって尿の流れを調べることができます。青 injectedmethylene ソリューションは、腎盂、尿管、膀胱からの尿軌道がトレースされます。水腎症は、腎臓で色素の展開によって認識できます。UPJO 色素近位尿管腎盂が膨張した5流の閉塞として検出できます。尿管の拡大径によって示される任意の拡張は、尿管の例を示します。最後に、色素蓄積膀胱壁、または生殖管のサイトでは膨張した, 水腎と UVJO を示し、hydromegaureter7,10を拡張します。膀胱に VUR を検出する色素溶液を注入し、腎臓9以降の逆行フローを監視します。
ここでは、周産期胎児の腎孟にメチレン ブルー色素注入のプロトコルが表示されます。このプロトコルにより、腎盂尿管、膀胱からの尿の流れのトレースと UPJO や UVJO など潜在的な尿路接合の障害物を確認します。
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Protocol
マウス (Wnt5a flox/flox マウス (Wnt5a tm1.1Tpy) と Dll1Cre ライン、UVJO マウス モデル) 7 ケアと実験動物の使用のための NIH のガイドラインに従って管理していましたNCI フレデリック ・動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに師事
。1 メチレン ブルー色素溶液の調製
- 0.1 g メチレン ブルー粉を測定。 。
- 10 mL 生理食塩水入りのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 メチレン ブルーをボルテックスによって完全に分解します 。
- 注入時に詰まりを除去するためにシリンジ フィルター (膜孔径 0.45 μ m) で 10 mg/mL メチレン ブルー溶液をフィルター処理します 。
- アセンブル滅菌頭皮静脈セット (27GX3/4 ″) フィルターのメチレン ブルー溶液を 3 mL シリンジ 3 ml シリンジの塗りつぶしと
。 注: 静水圧と後続の染料の流れを防ぐためには、上記のメチレン ブルー溶液で満たされた注射器の針の先端を配置します 。
2。出生前の胎児の解剖
- 解剖はさみおよび 70% エタノールでピンセットをクリーンします 。 E18.5 または E19.5、周産期の胚を収集する
- は、妊娠マウスを安楽死させる最初に CO 2 吸入を使用し、NIH のガイドラインに従って頚部転位を実行します
。 注: 妊娠中の雌マウス通常出産 E18.5 で開始、しかし、大きい腎臓が操作しやすくなります。したがって、出産に近い E19.5 で腎臓はでこの分析を実行しやすくなります。しかし、出生後両側尿路障害物金型で子犬します。実験的マウスの特性に応じて適切なコレクションの日/時刻を経験的に決定されるべき 。
- 腹部腹側で 70% エタノールをスプレーし、腹解剖はさみや鉗子を使用して腹腔内を開きます 。
- 子宮全体を持ち上げ、解剖子宮角の先端にはさみで切断することによって、体からそれを分離します 。
- シャーレの 1x PBS で子宮全体をすすぎします 。
- はさみを解剖前に子宮を切り取って、卵黄嚢胚を公開する鉗子を解離性大胎盤脱落膜を削除します 。
- 卵黄嚢を最初に削除し、周産期の胚を解放するために鉗子を解剖と羊膜を削除します 。
- 解剖はさみを持つ胚の首をはねます。滅菌ガーゼパッドで余分な血を拭き取る。胚その腹側表面にピン イメージングのデジタル カメラを搭載した解剖顕微鏡。必要に応じて遺伝子型の尾を収集します
。 注: 一度に注射 1 つの胚を実行します 。
- は慎重にピンセットで皮膚を引き裂くことによって胎児の腹部キャビティを開きます。その後、慎重に削除過剰な臓器や肝臓、胃、腸などの組織鉗子でそれらを切断または背部にある膀胱、尿管、腎臓を公開するそれらを引き出すことによって ( 図 1 a)。必要に応じて滅菌ガーゼパッドで切り裂かれた胚から過剰の血液を吸収です
。 注: 過剰血干渉色素注入の腎盂の識別と 。
3。腎盂と色素の流れの監視にメチレン ブルー色素の注入
- 針とチューブ静水圧によって針の先端からメチレン ブルー溶液を排除することで泡を削除します。フローを開始する針の先端のレベルの上の色素溶液の入った注射を持ち上げ、それから降ろしての流れを停止する注射器です 。
- は、いったんそれを邪魔しないように世話、近位尿管近く腎盂に針を挿入します。色素を注入、尿路通過障害を判断するための腎臓を実行します
。 : 注以下の尿路通過障害を決定する同じ方法で任意の異常な腎臓 7 注入の最初を染める 。
- は、静水圧を提供し、15 μ L - 染料水溶液流の 60 μ L 約 20 cm を注射器を持ち上げて取り外します。この高さ、胚の上に注射器が発生した場合、流量は約 3 μ L/s になります 。
- を監視し、腎盂、尿管の長さでまず色素の青の色、最終的に膀胱内腔にします
。 注: かかる約 5 s 場合は、尿管が膀胱内に正しく挿入されて膀胱腔内に出てくる弱い染料の色を表示します。約 15 のブロックのサイトで蓄積する色素を許可する s 膀胱内腔に染料の色が表示されない場合します 。
- 色素フローを止めるまで注射器を置き、針を腎臓から削除します 。
- カメラを使用して、プログラムをイメージング顕微鏡に接続されている染料の解決とトレース膀胱、尿管、腎臓を取るイメージ 。
- 、実験室のノートで、腎臓、尿管、および染料の解決の最後の位置の水腎症のレコード 。 対側腎の
- 実行注射の説明に従ってセクション 3.1) 3.5) ができ、染料の流れ約 20 合計で s
。 注: 膀胱内腔を染料の解決、尿管が膀胱内腔に正しく挿入されている場合に強い青色で示された塗りつぶされます。尿路移行部狭窄を評価した後、尿管と膀胱を区分のため固定することができます 。
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Representative Results
腎臓と泌尿器系が肝臓や腸などの他のほとんどの臓器に背側に位置します。これら他の内臓を除去した後は、単一膀胱と尿管腎臓のペアは、表示されている (図 1 a) をします。成功術には、尿管から膀胱に腎臓から腎盂に注入された色素を流れます。腎盂は腎臓の尿管の漏斗のような拡張した近位部分です。したがって、色素注入ポイントは黒い矢印 (図 1 b・1 C) で示される腎臓と接続して可視近位尿管近くです。1 つの腎臓にメチレン ブルー溶液を注入後、染料に腎盂、尿管、膀胱の尿路通過障害が存在しない場合、尿管と膀胱の内腔に目に見える青色の結果 (図 1 b から流れる).色素溶液通常通常尿管ですぐに消える画像、前にも、尿管に染料の色が弱いので通常の尿管が細い管。ただし、染料流尿管を解剖顕微鏡で観察できます。約 20 の長い流れの結果として表示される膀胱内腔で強い青色色素溶液 (図 1) と両方の腎臓を注入した後の合計で s。対側の注射後膀胱内色素の蓄積は、2 番目の尿システムに接合する、尿路の閉塞がないことを示します。
尿路ジャンクション異物を確認最初に明らかに異常な腎臓を注入するが妥当です。異常なアデニンは彼らのより大きいサイズまたは広がり腎盂と薄い透明な表面によって認識できます。膨張した後、例の腎臓と異常拡張した尿管は、図 2 aに描かれています。拡張した尿管通常その拡張ボリュームは、通常、細い尿管よりもはるかに多くの色素溶液を保持するための多くの強力な可視化の結果します。腎臓や尿管が解剖中に破損した場合、染料が破損したサイトで異常漏れ出すので尿路通過接点障害の検討をことはできません。たとえば、図 2 aで異常な水尿管がその真ん中に破損していた、したがって、色素溶液の最終的な位置は不明、膀胱内腔 (図 2 a) で染料の不在にもかかわらず UVJO を確認できません。ただし、この周産期の尿システム拡張した尿管と膨張した, 水腎は尿管がその長さに沿って拡大し、腎臓が膨張するはっきりと UVJO あります。対側腎尿路系が薄い尿管があり染料その後 (図 2 b) 膀胱内腔に入ると通常表示されます。
図 1。メチレン ブルー色素を注入通常の尿システムの例です。(A)から余分な組織を除去した後の周産期胚 (E19.5) 泌尿器系の典型的なイメージです。二つの腎臓、2 つの尿管、膀胱は、生殖器官、ここ精巣(B)通常腎臓への色素注入の例と見られています。(黒矢印) 腎臓の腎盂に挿入ポイントを見ることができます。弱い染料の色は、5 s. (C)色素蓄積膀胱内腔に両方正常腎の注入後のフローに染料を可能にした後、尿管と膀胱の内腔に表示されます。色は 20 のための流れに染料を可能にした後膀胱内腔で色素溶液の蓄積から強くなる s。腎盂は腎臓の弱い染料の色で表示されますも。B: 膀胱、k: 腎臓、t: 精巣、u: 尿管。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。メチレン ブルーの例は片側尿管に尿路系への注入を染める。(A) 、水尿管と 15 の染料流れと新生女性の子犬の, 水腎尿路系への色素注入の例 s。水腎は対側腎より明らかに大きいです。対応する尿管の拡張し染料の色は強く認識が、体腔内に色素溶液の漏れによって観測された、尿管が明らかに破損しています。(B)正常な腎臓に 20 s. 注入色素溶液の染料流片側尿管に尿路系の対側腎への色素注入は異常が一方的であることを確認する膀胱内腔に蓄積されます。B: 膀胱、HK:, 水腎、胡: 尿管 k: 腎臓、u: 尿管、Ut: 子宮角。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
マウス腎臓機能の先頭 E16.5 で、色素注入試験はこの時点から理論的に可能です。しかし、腎臓は色素溶液を注入するのには小さすぎる、これらの表現型は、尿異常尿搬送による構築の二次的効果によって水腎症や水尿管などの表現型が明瞭に観察されません。UPJO または UVJO などの障害物からのこれらの表現型は膨張した腎臓と尿管で E18.5 で明白であります。E19.5 または新生児子犬で胚の大きい腎臓が E18.5 で胚のそれらより操作を容易にまたはより若いです。しかし、出生後両側尿路障害物金型で子犬します。したがって、周産期胚または実験的マウスの特徴によって子犬を適切に選択して先天表現型を検証する実験を行います。
潜在的な欠陥を調べるための造影剤の注入を実行する前にそのまま尿システムを維持するために慎重に解剖します。これは、異常なアデニン腎臓と尿管、腎臓と尿路を公開する余分な組織の削除時に、非常に膨張したと簡単に破損のため本質的に重要です。解剖時にこれらの器官の損傷と、本当の欠陥を完全に把握ができなくなります。たとえば、図 2は、尿管の拡張を示していますが、色素漏出が遠位尿管の終点を示すことができなかった。
これらの気泡は、適切な染料の流れをブロックが、常にチューブと注射の前に針から空気の泡を削除してください。成功した郭清後尿路通過障害を調べるための重要なステップは、腎盂に針の先端を挿入です。近位尿管近くの腎臓の上半分に、針の挿入は、腎盂に針の先端を直接に便利です。針の先端は、近位尿管に向けてポイント必要があります。腎の血管に近位尿管近く、ので染料は、針の先端が近位尿管に向かって指していない限り、腎血管に沿って流れる可能性があります。この場合、針の先端はに向かって近位尿管腎盂で調整する必要があります。さらに、針が腎臓と体の空洞内にリークが発生する色素の原因とあまりにも深く挿入されている場合、腎臓を通過します。慎重に腎盂と腎孟内針の先端を監視に針の先端を挿入は、この失敗を防ぐことができます。時に、針がによってブロックされる腎臓組織注入中に腎盂に挿入されていない場合。この場合、針から、組織を除去、静水圧を再起動することにより色素の流れをリセットし、腎盂へ針先をリダイレクトします。また、片側または両側に表現型先天に関連付けられている可能性があります。そのため、左と右の尿システムの注入が別々 に実行されることを確認します。最適な UVJO が一方的であるかどうかを確認する明らかに異常な腎臓と最初注射を実行します。
以来、染料通過腎盂から尿管すばやく注入試験直後後の画像。解剖顕微鏡の下で染料のフローを監視できますが、通常尿管が細い管には通常尿管のイメージング中に色を参照してくださいするは難しいです。メチレン ブルーの代替、1 %1 × PBS で高速グリーンは使えます、濃い緑9として表示されます。色素液を注入、腎臓と尿管の次の H の組織学的セクションに加えて & 染色、腎臓と尿管内に欠陥を確認します。また、尿管特定記者とのセクションの画像は UVJO7を確認する補助的な方法です。ただし、これらのセクションはそのままにする必要があります、シリアル断面が偽陽性を避ける必要があります。尿中のシステムの伝統的なセクションに基づく分析と比較して、この色素注入プロトコルは腎臓と尿管の特許性を観察する UPJO や UVJO などの障害物を可視化するためのインスタント方法です。
このプロトコルを提供する簡単な簡単なメソッドへの接続は、後半ステージ マウスの開発、尿路の開発の分析を可能にする尿路構造を視覚化します。ここで説明する方法は、尿路の成熟や尿管の開発の変更を識別するための手段として発達尿路奇形を引き起こす突然変異を評価するために使用できます。
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Disclosures
著者は、何を開示します。
Acknowledgments
この原稿の提出を支援博士アラン o. Perantoni (CDBL、NCI、NIH) をありがちましょう。私もこの原稿を編集の博士マイケル ホール (CDBL、NCI、NIH) とニルマラ シャルマ (CDBL、NCI、NIH) に感謝します。私は彼の優れたマウス飼育のライ タン (SAIC) に感謝しています。この作品は、癌研究のための健康、国立癌研究所とセンターの国立衛生研究所によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML | Fisherscientific | 50-983-204 | |
| 3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip | BD | 309657 | |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall corporation | 4614 | |
| Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12" | EXELINT | 26709 | |
| Delicate Operating Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6702 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5135 | |
| Dumont Tweezers; Pattern #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2" | BD | 305106 |
References
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