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Biology

गुर्दे में प्रोटीन के गैर वायरल अभिव्यक्ति के लिए Hydrodynamic गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन

Published: January 8, 2018 doi: 10.3791/56324
Automatic Translation
1,2,3, 2, 2, 2, 3, 1,2,3
1Department of Veterans Affairs, Tennessee Valley Healthcare System, 2Departments of Medicine and Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Medicine, Baylor University College of Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन करने के लिए गुर्दे के माध्यम से माउस गुर्दे में प्लाज्मिड डीएनए सुई श्रोणि के लिए विशेष रूप से गुर्दे में transgene अभिव्यक्ति का उत्पादन ।

Abstract

Hydrodynamic इंजेक्शन प्लाज्मिड डीएनए और अन्य पदार्थों के साथ विभिन्न ऊतकों को transfect करने के लिए एक स्थानीय, उच्च दबाव वातावरण बनाता है । Hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन, उदाहरण के लिए, एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है जिसके द्वारा जिगर transfected किया जा सकता है । इस पांडुलिपि का वर्णन एक आवेदन माउस गुर्दे के इंजेक्शन द्वारा hydrodynamic सिद्धांतों सीधे गुर्दे के लिए प्लाज्मिड डीएनए विशेष जीन अभिव्यक्ति के साथ । चूहों anesthetized रहे हैं और गुर्दे एक पार्श्व चीरा द्वारा एक प्लाज्मिड डीएनए के एक तेजी से इंजेक्शन के बाद से उजागर होता है-सीधे गुर्दे श्रोणि में समाधान युक्त. सुई दस सेकंड के लिए जगह में रखा जाता है और चीरा साइट टांका है । अगले दिन, जीना पशु इमेजिंग, पश्चिमी दाग, या immunohistochemistry के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है परख जीन अभिव्यक्ति, या अंय पसंद की transgene के लिए उपयुक्त परख ब्याज की प्रोटीन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है । प्रकाशित तरीकों को लंबा जीन अभिव्यक्ति transposon-मध्यस्थता transgene एकीकरण और cyclophosphamide उपचार transgene को प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बाधित शामिल हैं ।

Introduction

hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन तकनीक माउस जिगर में जीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए एक सामान्य रूप से इस्तेमाल किया तरीका बन गया है1,2. गुर्दे भी इस तकनीक से काफी निचले स्तर पर transfected हैं, लगभग १००-गुना कम3. hydrodynamic गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन यहाँ वर्णित एक सरल तरीके से शारीरिक अर्थ के माध्यम से अंग अभिव्यक्ति की विशिष्टता को नियंत्रित करने के लिए एक ही hydrodynamic सिद्धांतों है कि पहले जिगर में स्थापित किया गया है का उपयोग कर प्रदान करता है4,5 , मांसपेशी6, और अन्य अंगों7,8. इस विधि vivo में जीवित पशुओं में कोशिकाओं transfects दबाव और गति का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं में तरल पदार्थ युक्त डीएनए बल, एक साथ अंग है कि जल्दी से हल है9को नुकसान उत्प्रेरण द्वारा । अच्छी तरह से स्थापित सर्जिकल तकनीक का उपयोग एक पार्श्व के माध्यम से गुर्दे की कल्पना करने के लिए10 साथ ही इंसुलिन सिरिंज द्वारा एक इंजेक्शन के साथ, हम गुर्दे की कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के सफल अभिकर्मक पाया है, मुख्यतः मध्यवर्ती fibroblasts, नलिकाओं, और वाहिनी11इकट्ठा । इन चूहों के विच्छेदन से पता चला है कि अंय अंगों के स्तर पर पर्याप्त उच्च luciferase इमेजिंग तकनीक द्वारा कल्पना को transfected नहीं कर रहे है11। के बाद से तकनीक गैर वायरल है, अभिकर्मक के लिए प्लाज्मिड डीएनए का उपयोग तेजी से और इंजेक्शन के लिए आवश्यक एजेंट की आसान तैयारी परमिट ।

हम स्थानीयकृत hydrodynamic इंजेक्शन का इस्तेमाल किया है एंटीऑक्सीडेंट glutathione एस-ट्रांस्फ़्रेज़ A4 व्यक्त करने के लिए, इंसुलिन जैसे विकास कारक-1 रिसेप्टर, और गुर्दे में हार्मोन erythropoietin, सभी की उम्मीद जैविक प्रभाव के साथ11, 12 , 13. प्रशासन के मार्ग का विस्तृत मूल्यांकन, इंजेक्शन की मात्रा, डीएनए खुराक, और प्रमोटर च्वाइस11प्रदर्शन किया गया है । इसके अतिरिक्त, दोनों piggyBac transposon प्रणाली और/या cyclophosphamide उपचार transgene को प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को दबाने के लिए लंबी अवधि के जीन अभिव्यक्ति परिणाम11सुधार दिखाया गया है । अंय जांचकर्ताओं चूहे में सफलता के साथ एक गुर्दे की नस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है, एक से अधिक की समय अवधि के लिए उच्च अभिकर्मक दक्षता प्राप्त करने के14महीने । हालांकि, phenotypes नकल उतार मानव रोग के आनुवंशिक सुधार आमतौर पर सबसे स्तनधारी आनुवंशिक मॉडल माउस मॉडल है के बाद से एक सबूत की अवधारणा के रूप में पहले चूहों में प्रदर्शन कर रहे हैं । हम गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन के लिए गुर्दा नस इंजेक्शन की तुलना में और पाया कि इंजेक्शन गुर्दे श्रोणि में जीन अभिव्यक्ति के लिए गुर्दे की नस के लिए बेहतर था (लगभग दस गुना अधिक) और अस्तित्व11। गुर्दे श्रोणि में प्रवेश का एक आदर्श मार्ग है क्योंकि यह पर्याप्त लचीला मूत्र उत्पादन में उतार चढ़ाव बर्दाश्त है और अक्सर अपनी संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने में सक्षम है, जब भी hydronephrosis के दौरान फैली हुई है । इसके अतिरिक्त, गुर्दे श्रोणि में इंजेक्शन गुर्दा कैप्सूल भेदी बिना गुर्दे के लिए उपयोग की अनुमति दी, इंजेक्शन द्रव दिख intraparenchymal इंजेक्शन से बेहतर गुर्दे द्वारा बनाए रखा जा करने के लिए अनुमति देता है । अंय माउस अंगों vasculature के अलावा अंय प्रवेश का एक मार्ग नहीं है, लेकिन गुर्दे के मूत्र अंतरिक्ष एक आदर्श इंजेक्शन साइट है । इसके अतिरिक्त, गुर्दे की नस में इंजेक्शन उदर गुहा में रक्त के रिसाव के परिणामस्वरूप । जंगली प्रकार के माउस गुर्दे की कुल गुर्दे की मात्रा लगभग ०.२ सेमी3होने के लिए चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग द्वारा अनुमान लगाया गया है, तो एक ही गुर्दा की मात्रा तरल गुर्दे श्रोणि द्वारा इंजेक्शन की मात्रा के लगभग बराबर है hydrodynamic इंजेक्शन (१०० µ l)15. इस के साथ साथ, हम hydrodynamic गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन प्रोटोकॉल की विस्तृत बारीकियों के सभी उपलब्ध कराई है गुर्दे के प्रतिलिपि अभिकर्मक प्राप्त करने के लिए ।

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Protocol

सभी विधियां यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों (IACUCs) Baylor कॉलेज ऑफ मेडिसिन और वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. इंजेक्शन के लिए डीएनए समाधान तैयार करें

  1. अभिकर्मक दक्षता और transgene अभिव्यक्ति में सुधार करने के लिए वांछनीय विशेषताओं को अधिकतम करने के लिए transgene (ओं) को ध्यान से व्यक्त करने के लिए प्लाज्मिड (ओं) का चयन करें ।
    नोट: Hydrodynamic गुर्दे plasmids की श्रोणि इंजेक्शन फ्लोरोसेंट मार्कर TdTomato व्यक्त करने के लिए, हार्मोन erythropoietin (ईपीओ), और जुगनू luciferase पहले11वर्णित किया गया है । अगर वहां transgene के लिए अभिकर्मक क्षमता के लिए एक अच्छी तरह से विकसित परख नहीं है, luciferase के 10 µ जी शुरू करने से luciferase के जीवित पशु इमेजिंग प्रदर्शन-व्यक्त प्लाज्मिड जैसे बढ़ाया जुगनू luciferase इंजेक्शन के लिए पतला डीएनए के लिए ।
    1. सबसे छोटी प्लाज्मिड है कि आवेदन करने के लिए व्यावहारिक है चुनें ।
      नोट: छोटे plasmids आम तौर पर transfect कोशिकाओं से बेहतर बड़े plasmids । उदाहरण के लिए, zeomycin प्रतिरोध जीन और R6K प्रतिकृति के मूल के छोटे हैं, इसलिए प्लाज्मिड रीढ़ में इन तत्वों का उपयोग प्लाज्मिड आकार में कमी होगी ।
    2. एक स्तनधारी प्रवर्तक से transgene व्यक्त करते हैं.
      नोट: गुर्दा कोशिका प्रकार transfected, जीन अभिव्यक्ति की लंबाई, और जीन अभिव्यक्ति की ताकत सभी प्रमोटर पसंद से प्रभावित हो जाएगा । देखें Woodard एट अल। cytomegalovirus (सीएमवी; गठित वायरल) की तुलना के लिए, बढ़ाव फैक्टर-1 अल्फा (EF-1α; गठित अंतर्जात), गामा-glutamyl ट्रांस्फ़्रेज़ (γGT; tubule-विशिष्ट), और podocin (NPHS2; podocyte-विशिष्ट)11.
    3. ऐसे transposons के रूप में एक गैर वायरल घालमेल प्रणाली को रोजगार अगर उच्च दीर्घकालिक जीन अभिव्यक्ति स्तर11,16वांछनीय हैं । जल्दी readouts से कम 5 दिनों के बाद इंजेक्शन के साथ अध्ययन के लिए, transgene के एकीकरण अनावश्यक है ।
  2. इस तरह के एक endotoxin मुक्त maxiprep किट के रूप में एक वाणिज्यिक विधि का उपयोग इंजेक्शन के लिए प्लाज्मिड डीएनए तैयार । ध्यान से labware के माध्यम endotoxins शुरू करने से बचें ।
    नोट: डीएनए समाधान में endotoxins की उपस्थिति विषय पशु में एक गंभीर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में लाना होगा, प्रयोग समझौता और संभवतः पशु हत्या ।
    1. के बाद पिछले डीएनए अलगाव धोने कदम पूरा हो गया है, सुनिश्चित करें कि कोई इथेनॉल दृश्य निरीक्षण और गंध द्वारा छोड़ दिया है । दृश्य बूंदों को हटाने के लिए जेल लोड करने वाले सुझावों का उपयोग करें । डीएनए गोली युक्त ट्यूब शुष्क कमरे के तापमान पर नाजुक कार्य वाइपर ऊतकों या लगातार निगरानी के साथ एक 37-60 डिग्री सेल्सियस ओवन में उल्टा । गोली तुरंत अवशिष्ट इथेनॉल के बाद फिर से निलंबित गोली के सूखने को रोकने के लिए सुखाया है ।
      नोट: अवशिष्ट इथेनॉल डीएनए एकाग्रता और गुर्दा परिचय के spectrophotometer पढ़ने के साथ हस्तक्षेप वांछनीय नहीं है ।
    2. एक ही बफर में डीएनए गोली reसस्पेंड के रूप में इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा (hydrodynamic वितरण बफर; 100-300 µ एल) समूहों के बीच डीएनए बफर समाधान की रासायनिक संरचना में भिन्नता को सीमित करने के लिए.
      नोट: इस किट के साथ आता है कि रेफरेंस बफर समाधान में डीएनए गोली reसस्पेंड नहीं है । chelating एजेंट EDTA सामांयतः में पाया "ते" बफर तैयारी गुर्दे और हृदय समारोह को प्रभावित कर सकते हैं । गोली के आकार पर निर्भर करता है, hydrodynamic वितरण बफर के 100-300 µ एल में elute एक उच्च एकाग्रता प्राप्त करने के लिए । पूरी तरह से पतला डीएनए के अंतिम एकाग्रता के बीच होगा १०० एनजी/µ एल (10 µ जी/माउस खुराक) और ५०० एनजी/µ एल (५० µ जी/माउस खुराक) तो शेयर डीएनए एकाग्रता इस से अधिक होना चाहिए ।
    3. पूरी तरह बफर में डीएनए गोली reसस्पेंड । एक बाँझ microfuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरित करने से पहले यह सुनिश्चित करें कि डीएनए पूरी तरह से भंग हो गया है के लिए कमरे के तापमान पर मूल ट्यूब में hydrodynamic डिलीवरी बफर में गोली छोड़ दो या रात के स्तर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
    4. एक spectrophotometer पर या किसी अन्य विधि द्वारा स्थापित प्लाज्मिड डीएनए एकाग्रता पढ़ें ।
      नोट: रीडिंग अतिरिक्त प्रतिकृति यदि आवश्यक हो तो डुप्लिकेट में किया जाना चाहिए । 260/280 अनुपात १.८ के नीचे है, तो तैयारी आरएनए या किसी अन्य पदार्थ के साथ दूषित है तो इसे त्याग और डीएनए फिर से तैयार.
    5. स्टोर प्लाज्मिड डीएनए में इंजेक्शन बफर में reसस्पैंड-20 ° c एक बॉक्स के अंदर एक मैनुअल ठंढ फ्रीजर में डीएनए के क्षरण से बचने के लिए ।
      नोट: इस तरह से संग्रहीत, डीएनए की तैयारी कई वर्षों तक चलेगी । प्रतिबंध डाइजेस्ट और agarose जेल ट्रो द्वारा डीएनए की अखंडता की जांच करें । डीएनए है कि नीचे लेन नीचा है अपमानित किया है और जबकि डीएनए है कि सही आकार के कुरकुरा बैंड पैदा करता है इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. गुर्दे श्रोणि में इंजेक्शन के लिए पतला प्लाज्मिड डीएनए समाधान तैयार करें ।
    नोट: नियंत्रण समूहों ध्यान से विचार करें । कई अध्ययनों के लिए, भोली और बफर इंजेक्शन ही नियंत्रण शामिल हैं, क्योंकि इंजेक्शन ही नुकसान का कारण बनता है और प्रयोगात्मक परिणाम11को प्रभावित कर सकते हैं ।
    1. बेंच पर कमरे के तापमान पर hydrodynamic डिलीवरी बफर में endotoxin मुक्त डीएनए eluted को कम करना ।
    2. इंजेक्शन के लिए आवश्यक डीएनए की मात्रा की गणना और प्रत्येक समूह के लिए पतला डीएनए तैयार करते हैं । प्रशासन 10-50 प्लाज्मिड डीएनए के µ जी प्रति माउस hydrodynamic वितरण बफर के साथ १०० µ एल की कुल मात्रा में लाया ।
      नोट: एक उदाहरण के लिए, ०.५ µ g/µ l की एकाग्रता है कि एक डीएनए प्लाज्मिड के 10 µ g/माउस के साथ 3 चूहों सुई करने के लिए गणना इस प्रकार हैं ।
      1. पर्याप्त डीएनए समाधान तैयार लगभग 20% सुई में सीरिंज और मृत अंतरिक्ष लदान के लिए अतिरिक्त है । 3 चूहों के लिए, 3.5 x पर एक मिश्रण तैयार करें । µ जी में डीएनए के द्रव्यमान की गणना कि समाधान में होना चाहिए. यहां यह 10 µ g x ३.५ = ३५ µ g होगा ।
      2. माउस प्रति १०० µ एल इंजेक्शन के लिए वांछित समाधान की कुल मात्रा की गणना । इस मामले में, यह १०० µ एल x ३.५ = ३५० µ एल कुल मात्रा होगी ।
      3. समाधान में जोड़ने के लिए स्टॉक प्लाज्मिड डीएनए की मात्रा की गणना करें । इस मामले में, यह ३५ µ g/०.५ µ g/µ l = ७० µ l का स्टॉक प्लाज्मिड डीएनए होगा ।
      4. बफर की मात्रा की गणना शेयर डीएनए की मात्रा घटा कर पतला डीएनए समाधान में जोड़ने के लिए (कदम 1.3.2.2) वांछित है कि पतला डीएनए की कुल मात्रा से (चरण 1.3.2.3) जोड़ा । इस मामले में, यह ३५० µ एल ७० µ एल = २८० µ एल hydrodynamic वितरण बफर होगा ।
    3. लैब बेंच पर बाँझ तकनीक के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फिल्टर पिपेट सुझावों का उपयोग बाँझ microfuge ट्यूबों में समाधान तैयार.
      नोट: डीएनए समाधान तैयार किया जा सकता है और उस दिन होने के लिए सेट इंजेक्शन के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत । यह उनके शरीर का तापमान कम हो जाएगा के रूप में एक ठंड समाधान के साथ चूहों सुई मत करो, लेकिन वार्मिंग अनावश्यक है ।

2. hydrodynamic गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन सर्जरी प्रदर्शन

  1. चूहों का चयन सावधानी से सर्जरी के लिए ।
    नोट: तनाव-विशिष्ट अंतर अभी तक नहीं देखा गया है, लेकिन संभव हो सकता है । अधिकांश इंजेक्शन C57BL/6 या FVB पृष्ठभूमि पर किया गया है । गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन 6-12 सप्ताह पुराना है कि चूहों में सबसे अच्छा काम करते हैं । चूहों में अधिक से अधिक 16 सप्ताह, अप करने के लिए एक ५०% विफलता दर luciferase इमेजिंग द्वारा स्पष्ट कारणों के लिए संभव है. एक ही उंर से संबंधित विफलता दर जिगर को hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन के लिए मनाया गया है तो यह एक सामांय hydrodynamic इंजेक्शन के सिद्धांत से संबंधित सीमा हो सकती है । एक ही लाइनों के साथ, दूसरों को पता चला है कि fibrotic चूहा जिगर में hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन स्वस्थ जिगर के रूप में के रूप में प्रभावी नहीं है, तो यह गुर्दे फाइब्रोसिस की सेटिंग में गुर्दे श्रोणि hydrodynamic इंजेक्शन के रूप में प्रभावी नहीं होगा कि संभव हो सकता है, लेकिन इस पर सीधे17की जांच नहीं की गई ।
  2. सर्जरी के लिए चूहे और डीएनए सीरिंज तैयार करें ।
    1. चूहों को ketamine और xylazine से Anesthetize ।
      1. इस तरह के डिस्पोजेबल प्रयोगशाला एप्रन, शल्य चेहरा मुखौटा, और नाइट्राइल दस्ताने के रूप में पशु सुविधा, द्वारा आवश्यक सही निजी सुरक्षात्मक उपकरणों पर रखो ।
      2. एक समय में 2-4 चूहों के साथ कार्य करना, एक ५०० मिलीलीटर प्लास्टिक चोंच में प्रत्येक माउस का वजन एक पैमाने पर है कि ०.१ g करने के लिए सही है पर 24 मिलीग्राम/एमएल ketamine और 2 मिलीग्राम/मिलीलीटर की सही मात्रा की गणना xylazine सामांय ०.९% खारा में पतला intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा प्रत्येक माउस को व्यवस्थापित करने के लिए (intraperitoneal इंजेक्शन पर अधिक के लिए संदर्भित वीडियो देखें) 18. फार्मूला (५० µ एल + ((5 µ एल) एक्स (वजन (जी))) का प्रयोग करें, या वैकल्पिक रूप से स्थानीय पशुचिकित्सा टीम और IACUC के साथ परामर्श के बाद एक और सूत्र के अनुसार गणना ।
      3. मानक तकनीक द्वारा intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा माउस सुई । माउस को एक कागज की बाल्टी में रखें जब तक माउस को मोबाइल न हो ।
        नोट: चूहों सर्जरी के लिए तैयार कर रहे हैं जब वे अब पैर की अंगुली चुटकी परीक्षण करने के लिए जवाब. चूहे कि पैर की अंगुली-चुटकी परीक्षण 20-30 मिनट के बाद प्रारंभिक इंजेक्शन 20-60 µ एल अधिक संवेदनाहारी, प्रतिक्रिया की शक्ति के आधार पर जवाब देने के लिए जारी रखें ।
      4. corneal सुखाना को रोकने के लिए दोनों आंखों में एक नीले पैड और जगह पशु चिकित्सक मरहम के साथ कवर एक पानी परिचालित गर्मी पैड पर माउस प्लेस ।
    2. कंधे से माउस के पीछे की बाईं तरफ दाढ़ी और एक पालतू सौंदर्य के लिए डिज़ाइन किया गया शेविंग के साथ रीढ़ की हड्डी को पार्श्व । ढीले बाल और मलबे निकालें ।
    3. प्रत्येक anesthetized माउस के लिए पतला डीएनए के १०० µ एल युक्त एक अलग सिरिंज तैयार करें, यकीन है कि वहाँ कोई हवा बुलबुले बना रही है.
      1. एक बाँझ 29G एक्स ½ "०.५ एमएल यू-१०० इंसुलिन एक सुरक्षा के बिना एक स्थायी रूप से संलग्न सुई के साथ सिरिंज का उपयोग करें.
        नोट: सिरिंज प्रकार महत्वपूर्ण महत्व का है. यह गेज तेजी से इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है । स्थाई रूप से संलग्न सुई बाहर लीक होने से समाधान को रोकता है । एक सुरक्षा की उपस्थिति गुर्दे श्रोणि के लिए उपयोग में बाधा होगी । सामग्री तालिका में निर्दिष्ट सीरिंज अंय ब्रांडों की तुलना में इंजेक्शन के दौरान अधिक समान रूप से फिसलना परीक्षण किया ।
      2. ~ १२० µ एल करने के लिए सिरिंज लोड और शीर्ष पर एक स्थान बनाने के लिए नीचे सवार खींचो. सभी हवाई बुलबुले शीर्ष करने के लिए वृद्धि जब तक एक कलम के साथ टैप करें । सुई पकड़े, ध्यान से सुई की नोक पर एक छोटी बूंद रूपों तक सभी हवा को दूर करने के लिए सवार दबाना । वहाँ किसी भी दिखाई बुलबुले मौजूद नहीं होना चाहिए, के रूप में इन एक हवा शल्यता कि पशु को मार देंगे कारण हो सकता है ।
      3. समाप्त सवार निराशाजनक जब तक वहां १०० µ एल मूल microfuge ट्यूब में अतिरिक्त डीएनए समाधान खाली द्वारा सिरिंज में है । ध्यान से लेबल यदि आवश्यक हो और एक बाँझ कपड़ा पर भरी हुई सीरिंज जगह बाँझ बनाए रखने के लिए अगर सुविधा जहां काम किया जा रहा है सुइयों की पुनर्छाया की अनुमति नहीं है.
  3. इंजेक्शन सर्जरी करते हैं ।
    1. सर्जरी के लिए साइट तैयार करते हैं । उन्हें छूने के बिना बाँझ कपड़ा पर गर्मी पैड और खाली बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों पर एक बाँझ कपड़े प्लेस । माउस उठाओ और इसे देखने के क्षेत्र में जगह है । क्षेत्र को रोशन करने के लिए प्रकाश समायोजित करें ।
    2. तीन ३.१५% chlorhexidine gluconate और ७०% isopropyl अल्कोहल त्वचा एंटीसेप्टिक झाड़ू संकुल और पशु के पास जगह से निकालें ।
    3. बाँझ सर्जिकल दस्ताने में बदलें । चीरा साइट पर शुरुआत एक परिपत्र गति में कार्य करना, एक नया chlorhexidine के साथ पशु झाड़ू/
    4. चित्र 1aमें दिखाए गए के रूप में चीरा साइट का पता लगाएँ । चिमटी के साथ त्वचा चुटकी, त्वचा की परत को एक कट बनाने के लिए कैंची का उपयोग लगभग 1 सेमी रीढ़ की हड्डी से और ribcage नीचे । एक बार कट साइट लगभग 1 सेमी लंबी है, मांसपेशी परत में, नीचे एक समान कटौती साइट बनाते हैं ।
      नोट: चीरा सही लंबाई करने के लिए सिर्फ मुश्किल से चीरा के माध्यम से आते हैं और फिर ही चीरा द्वारा जगह में रखा जा करने के लिए गुर्दे की अनुमति बनाने के लिए । बहुत छोटा एक चीरा और गुर्दे उजागर नहीं किया जा सकता; बहुत बड़ा है और गुर्दे लगातार उदर गुहा में वापस फिसल जाएगा ।
    5. गुर्दे की स्थिति जानें ।
      नोट: यह सफेद वसा ऊतक के बीच दिखाई जा सकती है । तिल्ली भी पशु के बाईं ओर स्थित है । इन अंगों के रंग नेत्रहीन विभेदित किया जा सकता है, के रूप में तिल्ली एक डार्क मरून है जबकि गुर्दे एक गहरे लाल नारंगी है । यह आसानी से टूटना हो सकता है के रूप में तिल्ली में हेरफेर करने के लिए वांछनीय नहीं है ।
    6. गुर्दे को छूने के बिना, धीरे से पेट पर स्थिर, कोमल दबाव को उंगलियों (चित्रा 2c) के साथ डाल कर उदर गुहा से इसे बेनकाब । बंद चिमटी का प्रयोग धीरे अवांछित अंगों को वापस पेट में धक्का यदि आवश्यक हो । ओपन संदंश का इस्तेमाल न करें क्योंकि इससे किडनी या अन्य अंगों को नुकसान पहुंच सकता है ।
    7. एक बार गुर्दे पेट से बाहर है, धीरे से यह आसपास के वसा से अलग बस गुर्दे श्रोणि कल्पना करने के लिए पर्याप्त, एक छोटे से सफेद डॉट (चित्र 1b) । एक तरफ अतिरिक्त वसा पुश या यदि आवश्यक निकालें । अधिवृक्क ग्रंथि, गुर्दे के शीर्ष पोल के पास स्थित है, या गुर्दे कैप्सूल को दूर करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें ।
    8. बंद संदंश का उपयोग करने के लिए गुर्दे की दाहिनी ओर नीचे धक्का इतना है कि गुर्दे श्रोणि देखने में रहता है, सही हाथ से लोड इंसुलिन समझ और सुई के साथ काम कर रहे सतह के समानांतर पकड़ यह गुर्दे श्रोणि में बताया (चित्रा 2E) । चित्रा 1bमें दिखाया गया के रूप में मैटीरियल गुर्दे की गुर्दे श्रोणि में सुई ध्यान से डालें.
    9. तीन एस के भीतर जल्दी से समाधान इंजेक्षन । के बारे में एक तिहाई गुर्दे साफ हो सकता है और सफेद करने के लिए रंग बदल जाते हैं ।
      नोट: यह इंजेक्शन के बाद गुर्दे के कैप्सूल में द्रव buildup का पालन आम है और साथ ही एक रक्तगुल्म के गठन । कुछ नुकसान पता लगाने के लिए डीएनए अभिकर्मक के लिए पर्याप्त स्तर प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।
    10. लगभग 10 एस के लिए जगह में सुई रखने के लिए समाधान के backflow को रोकने के । फिर ध्यान से और धीरे से सुई निकाल लें । धीरे चीरा साइट खींच और बंद संदंश का उपयोग करके उदर गुहा के लिए अंग वापस ।
    11. सीवन 5-0 अवशोषित टांके के साथ पशु की मांसपेशी परत, 2-4 स्वतंत्र समुद्री मील की डाल ।
    12. टांका 5-0 या 6-0 गैर अवशोषित नायलॉन टांके के साथ पशु की त्वचा की परत, 2-4 स्वतंत्र समुद्री मील रखने ।
      नोट: सर्जिकल उपकरण एक बाँझ मनका स्नान में रखने के बाद फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है और नीचे ठंडा ।

Figure 1
चित्र 1. सही चीरा साइट और hydrodynamic गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन के लिए सुई नियुक्ति । क) चीरा (लाल रेखा) लगभग रीढ़ से 1 सेमी और माउस के ribcage के नीचे लगभग 1 सेमी स्थित होना चाहिए । बी) के बाद गुर्दे पार्श्व चीरा के माध्यम से अवगत कराया है, गुर्दे श्रोणि एक छोटे से पीले रंग के रूप में स्थित होना चाहिए स्पष्ट/ इंजेक्शन गुर्दे की नस, गुर्दे की धमनी, या यूरेटर परेशान नहीं करना चाहिए । इंसुलिन सिरिंज की सुई सीधे गुर्दे श्रोणि में डाला जाता है के रूप में लगभग ०.५ सेमी की गहराई करने के लिए दिखाया गया है और जल्दी से 2-3 एस में उदास. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. शल्य कदम गुर्दे श्रोणि प्लाज्मिड डीएनए के hydrodynamic इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए । क) संदंश त्वचा चुटकी सर्जन बनाने के लिए एक ~ 1 सेमी पार्श्व एक स्केलपेल के साथ चीरा, पहले त्वचा की परत के माध्यम से, तो मांसपेशी परत के माध्यम से अनुमति देते हैं । ख) बंद संदंश के दो जोड़ों का प्रयोग शल्य घाव खोलने के लिए, गुर्दे पेट के भीतर अगर संभव visualized है । ग) पेट पर कोमल दबाव के साथ, किसी भी अंगों को सीधे स्पर्श किए बिना, पार्श्व चीरा के माध्यम से गुर्दे उजागर होता है । घ) वसा धीरे गुर्दे से विच्छेदित है, यह परेशान के रूप में कम के रूप में गुर्दे श्रोणि के लिए उपयोग को प्राप्त करने के लिए संभव है । ई) गुर्दे श्रोणि कल्पना करने के लिए छोड़ दिया गुर्दे के दाईं ओर दबाने, सिरिंज अवसादग्रस्तता पर अंगूठे के साथ आयोजित किया जाता है और सुई ध्यान से है, लेकिन दृढ़ता से गुर्दे श्रोणि में रखा. च) < 3 स इंजेक्शन के बाद, समाशोधन गुर्दे के उन क्षेत्रों में देखा जा सकता है जो इंजेक्शन के थोक में मिले थे । छ) बाँझ बैंगनी vicryl अवशोषित टांके मांसपेशियों की परत में 2-4 स्वतंत्र समुद्री मील बनाने के लिए उपयोग किया जाता है । ज) बाँझ नीले नायलॉन गैर अवशोषित टांके त्वचा की परत में 2-4 स्वतंत्र समुद्री मील बनाने के लिए उपयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. सर्जरी और पोस्ट ऑपरेटिव मॉनिटरिंग से रिकवरी ।
    1. दर्द नियंत्रण के लिए संस्था की IACUC आवश्यकताओं के अनुसार एनाल्जेसिक के साथ चूहों प्रदान करते हैं । उदाहरण के लिए, उपचर्म इंजेक्शन द्वारा buprenorphine प्रशासन ४८ एच पोस्ट के लिए हर 8-12 ज ऑपरेटिव अगर NSAID-संबंधित गुर्दे की क्षति के अध्ययन के लिए बचा जा करने के लिए है ।
    2. एक गर्मी पैड पर चूहों रखें और जांचकर्ता द्वारा भाग लिया जब तक पूरी तरह से स्टर्नल recumbency के साथ मोबाइल । जब पूरी तरह से बरामद, एक साफ अपने घर पिंजरे से बिस्तर की एक छोटी राशि युक्त पिंजरे में चूहों को तनाव को कम करने के लिए वापस । घर चूहों भोले चूहों के साथ सर्जरी के अधीन नहीं है ।
      नोट: चूहों की हालत जल्दी में सुधार होगा, 24-48 एच के भीतर सामान्य व्यवहार करने के लिए प्रकट हो रहा है.
    3. खारा तरल पदार्थ और बढ़ी हुई analgesia चूहों कि उनकी हालत में सुधार करने के लिए जोर दिया दिखाई देते हैं । चूहों जल्दी से ठीक नहीं है, तो माउस वजन को मापने, और euthanize चूहों कि उनके प्रारंभिक शरीर के वजन के 20% से अधिक खो दिया है. Euthanize चूहों को प्रकट uremic या अन्यथा मरणासन्न. संभावित स्वास्थ्य समस्याएं तालिका 1में विस्तृत हैं ।
      नोट: चूहे कभी-कभार अपने बाहरी टांके निकालते हैं या टांके बंद करने से पहले ढीले हो जाते हैं । एक बरकरार त्वचा परत के साथ मांसपेशी परत के गरीब suturing चीरा साइट पर एक हर्निया में परिणाम कर सकते हैं, उभार द्वारा संकेत दिया । ऐसे मामलों में, संज्ञाहरण के तहत माउस जगह (isoflurane ketamine/xylazine से अधिक तेजी से है) और जितनी जल्दी हो सके नए टांके के साथ शल्य साइट की मरंमत । यदि गैर अवशोषित त्वचा टांके 10-14 दिनों के बाद रहना, उंहें हटा दें । कभी-कभार चूहे अपने पिंजरे-साथियों के टांके या लड़ाई निकाल सकते हैं । संवर्धन के साथ अपने पिंजरे में हमलावर चूहों को हटाने के रूप में इस तरह के व्यवहार की पहचान की है जैसे ही अन्य चूहों को चोट पहुंचाने से उन्हें रोकने के लिए.
    4. जब स्वास्थ्य या प्रायोगिक अंतिमबिंदु तक पहुंच रहे हैं, euthanize कार्बन डाइऑक्साइड सांस लेना या isoflurane अधिक मात्रा में इच्छामृत्यु के लिए मानक संचालन प्रक्रिया के अनुसार ग्रीवा अव्यवस्था के रूप में इच्छामृत्यु की एक माध्यमिक विधि द्वारा पीछा द्वारा चूहों संस्था में जगह
कारण शुरुआत प्रभावित चूहों की संख्या लक्षणों तत्काल कार्रवाई दीर्घकालिक समाधान
डीएनए में निहित endotoxins 6-40 एच के बाद इंजेक्शन । दूषित डीएनए तैयारी को देखते हुए हर चूहे को प्रभावित करने की संभावना । श्वास संबंधी समस्याएं, गंभीर दर्द के लक्षण, अंग विफलता, मृत्यु । प्रभावित चूहों को Euthanize । Limulus Amebocyte Lysate के साथ endotoxins के लिए प्रत्येक इंजेक्ट घटक का परीक्षण । endotoxin मुक्त maxiprep किट और केवल बाँझ और नए या NaOH-इलाज labware का उपयोग करें । डीएनए को पतला करने के लिए व्यावसायिक रूप से खरीदी गई, endotoxin-परीक्षित बफ़र का उपयोग करें ।
संज्ञाहरण अधिक मात्रा सर्जरी के दौरान, या तो पहले या बाद में डीएनए इंजेक्शन । केवल छोटे, छोटे या leaner चूहों को प्रभावित कर सकते हैं । हीटिंग पैड, पेशाब पर जबकि श्वसन संघर्ष । शेष चूहों के लिए संज्ञाहरण घटाएं । खुराक सटीकता के लिए तैयारी और प्रोटोकॉल की दोहरी जाँच करें. "runts" छोड़ें । पशुचिकित्सा परामर्श अगर उचित खुराक इस्तेमाल किया गया था ।
इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल सिरिंज या सुई में एयर बुलबुला तुरंत बाद गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन । जब तक सभी सीरिंज लापरवाही से लोड नहीं किया गया, यह केवल एक माउस को प्रभावित करता है । सांस के लिए हांफते हुए । हवा के बुलबुले के संकेत के लिए शेष सीरिंज की जाँच करें । सीरिंज को ध्यान से तैयार करें, नीचे बुलबुले निकालने के लिए सिरिंज का दोहन करें । बेहतर बुलबुले कल्पना करने के लिए प्रकाश व्यवस्था की स्थिति में सुधार ।
सर्जिकल साइट का उद्घाटन 12-72 एच के बाद इंजेक्शन एक या एक से अधिक चूहे । कभी-कभार पूरा पिंजरा । दूरी घाव, आम तौर पर कोई अंय संकट दोहराने suturing बाँझ तकनीक के साथ isoflurane संज्ञाहरण के तहत घाव को ध्यान से मरम्मत करने के लिए । खारा के साथ सिंचाई या कैंची के साथ घाव सीमाओं को दूर करने की आवश्यकता हो सकती है । यदि सभी चूहों बहुत ही कम या लापता टांके है, वहाँ एक माउस उन्हें हटाने हो सकता है, तो चूहों अलग किया जा सकता है. suturing तकनीक में सुधार । स्वतंत्र समुद्री मील का उपयोग करें ।
सर्जिकल साइट पर हर्निया 48 + एच के बाद इंजेक्शन एक या एक से अधिक चूहे । टीले सर्जिकल स्थल पर दिखाई दे रहा है । बाँझ तकनीक के साथ isoflurane संज्ञाहरण के तहत, मांसपेशियों की परत के हर्निया प्रकट करने के लिए चंगा त्वचा में कटौती । योनि में अंगों को बदलें, अवशोषित टांके के साथ मांसपेशियों की परत की मरंमत और साइट को बंद । यह मांसपेशी परत के गरीब suturing इंगित करता है । suturing तकनीक में सुधार । स्वतंत्र समुद्री मील का उपयोग करें ।
गुर्दे की विफलता 48 + एच के बाद इंजेक्शन एक या एक से अधिक चूहे । वजन में कमी > 20%, संभवतः uremic बनने, कूबड़ आसन खारा प्रदान करें और बढ़ाएं या analgesia लंबा । यदि कोई सुधार नहीं मनाया, प्रभावित चूहों बलिदान । यह कम गंभीर बनाने के लिए पशु की बीमारी राज्य को बदल । कम मजबूत या inducible होने के लिए transgene को झूमने पर मजबूर कर दिया । रोग प्रगति में एक पूर्व timepoint पर चूहों इंजेक्षन.
Abcess या संक्रमण सप्ताह के बाद सर्जरी के लिए दिन एक या एक से अधिक चूहे । स्पष्ट abcess या पूति के लक्षण प्रभावित चूहों को Euthanize । संदिग्ध संक्रमण की पुष्टि करने के लिए necropsy का अनुरोध करें । यह तब हो सकती है जब शल्य शर्तों और इंजेक्शन पर्याप्त बाँझ नहीं हैं । दिखाया प्रक्रिया एक सामांय प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ चूहों के लिए है, लेकिन आगे सावधानियों ऐसे cyclophosphamide के साथ इलाज के रूप में उन प्रतिरक्षा पशुओं की स्थापना में लिया जाना चाहिए ।

तालिका 1. गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन प्रोटोकॉल के दौरान सामना करना पड़ा संभावित स्वास्थ्य समस्याओं की तालिका. सूचीबद्ध स्वास्थ्य समस्याएं सामांय नहीं हैं, यद्यपि प्रक्रिया के दौरान हो सकता है जो जांचकर्ता-संबंधित त्रुटियों की एक संख्या है । इस तालिका की रोकथाम और स्वास्थ्य समस्याओं के निदान में सहायता की हो सकती है, साथ ही भविष्य में होने वाली ऐसी समस्याओं को रोकने के लिए संभावित उपायों के कार्यांवयन के लिए । अभ्यास के साथ, जांचकर्ताओं प्रक्रिया के कारण निराला स्वास्थ्य समस्याओं और मृत्यु दर की उंमीद करनी चाहिए ।

3. इंजेक्शन दक्षता और transgene प्रभाव का आकलन

  1. अभिकर्मक कुशलता का आकलन करने के लिए वांछित transgene के लिए एक अच्छी तरह से विकसित परख का प्रयोग करें । सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग ध्यान से सुनिश्चित करें कि परख विशिष्ट है बनाने के लिए ।
    नोट: प्रमोटर पसंद पर निर्भर करता है, चूहों की संभावना दिन 1 पर सबसे मजबूत transgene अभिव्यक्ति होगी; पहले सप्ताह के भीतर हमेशा इंजेक्शन के बाद ।
  2. इंजेक्शन के लिए पतला डीएनए को बढ़ाया जुगनू luciferase के रूप में luciferase-व्यक्त प्लाज्मिड के 10 µ जी शुरू करके luciferase के लाइव एनिमल इमेजिंग प्रदर्शन ।
    1. सभी चूहों को उजागर सतहों साफ । चूहों का पहला पिंजरा चैंबर में रखें और इसे बंद सील । सुनिश्चित करें कि इस प्रयोग के लिए पर्याप्त isoflurane है पण जाँच करके; यदि नहीं, तो isoflurane जोड़ें जब तक स्तर "मैक्स" लाइन तक पहुंच जाता है । ३.५ और 2 को ऑक्सीजन isoflurane डायल मोड़ द्वारा isoflurane के प्रवाह आरंभ करें ।
    2. intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा प्रत्येक माउस को १०० µ l से गल 30 मिलीग्राम/एमएल luciferin के साथ इंजेक्ट । समय रिकॉर्ड ।
    3. नारंगी और पीले माउस आइकन पर क्लिक करके इमेजिंग मशीन को नियंत्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर खोलें । "user id चुनें/जोड़ें" के अंतर्गत, "यूजर आईडी" के बगल में स्थित ड्रॉप-डाउन मेनू से सही प्रथमाक्षर चुनें. क्लिक करें "ठीक है." शीर्ष मेनू पट्टी पर, "प्राप्ति" पर क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से "अपने लिए सहेजें..." चुनें. फ़ोल्डर का चयन करें या करने के लिए डेटा को सहेजने के लिए कोई नया फ़ोल्डर बनाएँ ।
    4. निचले दाएँ कोने में स्थित छवि प्राप्ति बॉक्स पर जाएँ. जांच करें कि स्वचालित सेटिंग्स निंनानुसार हैं: बिन्नी, मध्यम; F/Stop, 1 के लिए luminescent, फोटोग्राफ के लिए 8; उत्सर्जन फ़िल्टर, खुला; इमेजिंग मोड, Luminescent, फोटोग्राफ, ओवरले, और संरेखण के बगल में ही जांच करता है । सिस्टम को प्रारंभ करने के लिए "प्रारंभ" क्लिक करें और प्रारंभ करने के लिए समाप्त करने के लिए प्रतीक्षा, फिर छवि पांच चूहों के लिए "दृश्य के फ़ील्ड" को "ई" में बदलें ।
    5. संज्ञाहरण टयूबिंग के लिए वाल्व बारी ऐसी है कि मशीन के अंदर nosecones isoflurane प्रशासन कर रहे हैं । इमेजिंग मशीन के अंदर जानवरों को अपनी पीठ के साथ उनके पेट पर वांछित क्रम में जगह के ऊपर कैमरे का सामना करना पड़ गुर्दे की कल्पना । यदि एक से अधिक पिंजरे के लिए छवि है, isoflurane कक्ष में अगले पिंजरे जगह है ।
    6. 5-10 min निम्नलिखित luciferin इंजेक्शन, छवि लेने के लिए "मोल" दबाएँ.
    7. दाईं ओर "उपकरण पैलेट" पर, क्लिक करें "छवि समायोजित." "रंग स्केल" के अंतर्गत, "Min" बार को घटाएँ जब तक अभिव्यक्ति सभी अपेक्षित चूहों में स्पष्ट है, प्रत्येक माउस गुर्दे पर बैंगनी के रूप में visualized. यदि कोई भी चूहे अभिव्यक्ति नहीं दिखाते हैं, तो luciferin के १०० µ l के साथ चूहों को फिर से इंजेक्ट करें और फिर से प्राप्त करने से पहले कम से 3 मिनट रुकें ।
      1. यदि छवि पिक्सेल संतृप्त है, जोखिम समय कम और संतृप्त पिक्सल की उपस्थिति के रूप में एक मात्रात्मक छवि प्राप्त करने के लिए प्राप्त करने के लिए अभिकर्मक दक्षता का अनुमान लगाने में परिणाम होगा । सबसे कम संभावित जोखिम समय है ०.५ एस ।
      2. यदि छवि पहले जोखिम समय पर ही बेहोश जीन अभिव्यक्ति से पता चलता है, जोखिम समय को बढ़ाने के लिए 2 मिनट और मोल । हर बार जब छवि फिर से ली जाती है, तो डेटा को चुने हुए फोल्डर में सेव कर लिया जाता है ताकि बाद में आगे के विश्लेषण के लिए सभी छवियां उपलब्ध हों ।
    8. दोहराने चूहों के बाद पिंजरों के लिए इमेजिंग कदम ।
    9. इमेजिंग मशीन से चूहों को हटा दें । गैस बंद कर दीजिये. कक्ष, nosecones, और इमेजिंग चरण को साफ़ करें । कंप्यूटर प्रोग्राम बंद करें ।
      नोट: सॉफ़्टवेयर "डेटासेट को सहेजने के लिए कहेगा." यह डेटासेट के लिए किए गए जोड़तोड़ को संदर्भित करता है, न कि स्वयं डेटा ।
      1. ब्याज के पैमाने और क्षेत्रों (ROIs) में परिवर्तनों को सहेजने के लिए "हां" क्लिक करें । छवियों के लिए मूल सेटिंग पर वापस लौटने के लिए "नहीं" पर क्लिक करें.
    10. डेटा विश्लेषण के लिए, सॉफ़्टवेयर खोलें । "उपकरण पैलेट" पर क्लिक करें "रॉय उपकरण." सर्कल आइकन पर क्लिक करें और नीचे चार चौकों के साथ एक लाल अंडाकार द्वारा संकेत के रूप में छवि खिड़की में एक नया रॉय जगह के लिए ड्रॉप डाउन मेनू में "1" पर क्लिक करें । एक लाल वर्ग पर माउस कर्सर रखकर और इंजेक्शन गुर्दे उपरिशाई बैंगनी क्षेत्र संलग्न करने के लिए घसीटने से रॉय के आकार को समायोजित करें ।
      1. रॉय पर एक लाल वर्ग पर कर्सर के साथ, राइट-क्लिक करें तो चुनें "डुप्लिकेट रॉय" छवि विंडो में एक नया रॉय बनाने के लिए और अगले माउस को स्थानांतरित करने के लिए । प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक छवि में सभी चूहों पर एक रॉय है इंजेक्शन गुर्दे.
      2. मेनू में सीधे छवि से ऊपर, परिवर्तन "इकाइयों" से "मायने रखता है" करने के लिए "चमक (फोटॉनों)." रॉय डेटा निर्यात करने के लिए, "उपकरण पैलेट" में, क्लिक करें "रॉय उपकरण" फिर माप की एक स्प्रेडशीट बनाने के लिए पेंसिल/मापनी आइकन पर क्लिक करें. डेटा विश्लेषण और चुनाव के आंकड़े कार्यक्रम में आगे विश्लेषण में "औसत चमक" माप का उपयोग करें ।
  3. 11के रूप में वर्णित अनुभागों का धुंधला प्रदर्शन करें ।
    नोट: इंजेक्शन पूरी तरह से गुर्दे transfect नहीं करता है तो विभिन्न वर्गों के विभिन्न अभिकर्मक क्षमता11कब्जा होगा । सह ऐसे फ्लोरोसेंट लेटेक्स microspheres के रूप में मोतियों की इंजेक्शन मदद कर सकता है transgene पॉजिटिव (चित्रा 3 डी)11की उंमीद क्षेत्रों की पहचान । धुंधला प्रोटोकॉल का अनुकूलन अत्यंत महत्वपूर्ण है ।
  4. transfected गुर्दे में ब्याज की जीन की पहचान करने के लिए पश्चिमी दाग प्रदर्शन करते हैं ।
    नोट: प्रोटीन निष्कर्षों के लिए अंगों की फसल बर्फ पर किया जाना चाहिए । फिर, अंग का एक छोटा सा टुकड़ा का उपयोग नहीं के रूप में इस क्षेत्र में अच्छी तरह से transfected नहीं किया गया है हो सकता है । अभिकर्मक असमान अंग भर वितरित तो विभिंन क्षेत्रों और उंहें पूल गठबंधन है । गुर्दे श्रोणि एक प्लाज्मिड के hydrodynamic इंजेक्शन हार्मोन erythropoietin उत्पादन में हेमाटोक्रिट में एक मामूली वृद्धि हुई है, तो यह है कि स्रावित transgene उत्पादों के संचलन में पाया जाना चाहिए की उम्मीद है11.
  5. लंबी अवधि के उच्च transgenes के स्तर की अभिव्यक्ति के लिए, इस तरह के cyclophosphamide के रूप में गुर्दे एजेंटों के साथ एक एकीकृत वेक्टर प्रणाली गठबंधन । transgene के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पहले कई हफ्तों इंजेक्शन के बाद खत्म होता है और मजबूत है11।

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Representative Results

सर्जरी और इंजेक्शन तकनीक एक बार में महारत हासिल करने के लिए सरल कर रहे हैं, कोई प्रमुख उपकरण या महंगी सामग्री की आवश्यकता होती है । यदि पार्श्व करने के लिए नई-चीरा गुर्दे की सर्जरी, कई इच्छामृत्यु के लिए अनुसूचित चूहों पर एक प्रशिक्षण दिन की अनुमति दी जानी चाहिए जिसमें चूहों शल्य चिकित्सा के बाद नहीं बरामद कर रहे हैं क्योंकि इस सर्जरी पर पहला प्रयास सामान्य से ज्यादा समय लग सकता है. वैकल्पिक रूप से, इसी तरह की तकनीक से परिचित जांचकर्ताओं यह काफी आसान लग सकता है । चित्रा 1 और चित्रा 2में सचित्र दिशाओं में चित्रण का ध्यान से पालन करें । ठीक से चीरा जगह के लिए, सर्जन उंगलियों का उपयोग करने के लिए माउस के पेट पर धक्का कर सकते हैं, जबकि यह अपनी तरफ देता है । गुर्दे कोमल पेट दबाव के साथ रीढ़ की हड्डी के पास उगता है कि एक छोटी सी गांठ द्वारा कल्पना की है, और चीरा इस क्षेत्र पर बनाया जाना चाहिए (चित्रा 1 और चित्रा 2). यह त्वचा और मांसपेशी परतों सही आकार (चित्रा 1) के माध्यम से चीरा बनाने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि चीरा बहुत बड़ा है, गुर्दे वापस उदर गुहा में फिसलना होगा, इंजेक्शन मुश्किल बना । यदि चीरा बहुत छोटा है, यह पेट की गुहा से बाहर धक्का गुर्दे और अंग नुकसान हो सकता है मुश्किल हो जाएगा । एक अंय महत्वपूर्ण बात गुर्दे श्रोणि में सुई की नियुक्ति है । सर्जन बंद संदंश के साथ नीचे गुर्दे धक्का चाहिए, तो काम कर सतह के समानांतर एक कोण पर गुर्दे श्रोणि में सुई डालने ऐसी है कि इंजेक्शन की मात्रा के अधिकांश गुर्दे पैरेन्काइमा में सीधे चला जाता है (चित्रा 2) । यह महत्वपूर्ण है कि इंजेक्शन के रूप में जल्दी संभव के रूप में hydrodynamic गुर्दे अभिकर्मक के लिए आवश्यक दबाव पैदा करने के लिए प्रदर्शन किया है ।

विभिन्न उपभेदों के चूहों, उम्र, वजन, और/या सेक्स गुर्दे के आसपास वसा की मात्रा और गुर्दा की स्थिति में मतभेद होगा, तो कुछ समायोजन के लिए ब्याज की चूहों के साथ काम करने के लिए आवश्यक हो सकता है. यदि संभव हो तो, पहली शल्य चिकित्सा का प्रयास है जिसमें से चूहों बरामद कर रहे हैं एक तत्काल readout गुर्दे की विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति, जैसे luciferase इमेजिंग (चित्रा 3) के रूप में शामिल होना चाहिए. यदि युवा चूहों का उपयोग किया जाता है, अपेक्षित परिणाम यह है कि सभी चूहों एक चमक है कि परिमाण के एक आदेश के भीतर है (चित्र बी) होगा । कभी-कभार, luciferin के एक दूसरे इंजेक्शन के बाद भी, यह इमेजिंग द्वारा स्पष्ट है कि एक माउस या चूहों दूसरों के लिए तुलनीय स्तर पर transfected बनने में विफल रहा है या कि कुछ इंजेक्शन चूहों भी पूरी तरह से जीन अभिव्यक्ति में कमी कर रहे हैं. ऐसे चूहों को फेल transgene डिलिवरी के कारण अध्ययन से बाहर रखा जा सकता है । यदि चूहों के कई जीन अभिव्यक्ति का अभाव है, तो सर्जन डीएनए समाधान के इंजेक्शन के समय में कमी करनी चाहिए । इंजेक्शन के उच्च दबाव के माध्यम से आवश्यक क्षति पैदा करने के लिए विफलता जीन अभिव्यक्ति की लगातार कमी के लिए सबसे अधिक संभावना अपराधी है । चूहों सावधानी से संभावित स्वास्थ्य समस्याओं के लिए सर्जरी के बाद निगरानी की जानी चाहिए ( तालिका 1 देखें साथ समाधान के साथ संभावित स्वास्थ्य समस्याओं के लिए और आवश्यक के रूप में संस्था के पशु चिकित्सा टीम के साथ परामर्श) । एक प्रारंभिक प्रशिक्षण अवधि के बाद, शल्य चिकित्सा ही कम दस मिनट से लेना चाहिए । शल्य अवधि सर्जरी के दौरान ऊतकों की सुखाना को रोकने के लिए एक समय में एक माउस पर परिचालन द्वारा संभव के रूप में कम के रूप में किया जाना चाहिए । इस प्रक्रिया में समय निवेश के अधिकांश की प्रेरण के कारण है और ketamine/xylazine संवेदनाहारी से वसूली । एक टीम के रूप में काम कर रहे दो अनुभवी कर्मियों को प्रति दिन दस सर्जरी करने के लिए, एक उचित अधिकतम के रूप में पंद्रह के साथ प्रदर्शन की उंमीद करनी चाहिए ।

शोधकर्ताओं ने इंजेक्शन के बाद पहले कुछ दिनों के भीतर transgene के लिए अत्यधिक सकारात्मक दाग करने के लिए कोशिकाओं की एक कम संख्या की उम्मीद करनी चाहिए. इन सकारात्मक कोशिकाओं के आसपास के क्षेत्रों जहां इंजेक्शन द्रव गुर्दे (चित्रा 3सी-डी) से घुसपैठ की है चारों ओर पैच में स्थानीयकृत हो जाएगा । transfected कोशिकाओं के लिए किडनी का कुछ भाग पूरी तरह से नेगेटिव हो जाएगा । ऐसे नकारात्मक क्षेत्रों एरिथ्रोसाइट्स में भी कमी आएगी और पूरी तरह से सामान्य प्रोटोकॉल के बाद से इंजेक्शन इन क्षेत्रों में नहीं पहुँच पाया. दाग प्रोटोकॉल और प्रवर्तकों ध्यान से जीन अभिव्यक्ति पर कब्जा करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । जांचकर्ताओं को उंमीद करनी चाहिए कि कोशिका प्रकार transfected चर जाएगा, transfected कोशिकाओं के कम प्रतिशत के भीतर जीन अभिव्यक्ति का स्तर अधिक हैं, और कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन के स्थानीयकरण के उच्च स्तर के कारण के रूप में अपेक्षित नहीं हो सकता है अभिव्यक्ति (चित्र 3d) ।

Figure 3
चित्र 3. Hydrodynamic गुर्दे luciferase और TdTomato के गुर्दे विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति में इंजेक्शन के परिणाम श्रोणि । (क) FVB 7-8 सप्ताह पुराने पुरुष चूहों hydrodynamic pTEeL के 20 µ जी, एक प्लाज्मिड-EF-luciferase प्रवर्तक से बढ़ाया जुगनू 1α व्यक्त की श्रोणि के इंजेक्शन दिया गया । चूहों 2, 3, और 5 भी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्लाज्मिड के 20 µ जी के साथ इंजेक्शन थे । (ख) में दिखाए गए चूहों से प्राप्त की गई चमक की साजिश डॉट (क). (सी और डी) चूहों या तो hydrodynamic वितरण बफर अकेले दिया (ग) या (घ) फ्लोरोसेंट microspheres (चमकीले हरे डॉट्स) और pEF1α-EF-TdTomato प्रमोटर से लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर 1α व्यक्त TdTomato थे । समीपस्थ नलिकाओं कमल tetragonolobus agglutinin (LTA; हरा) के दाग थे और transfected कोशिकाओं को आरएफपी संकेत (लाल) को बढ़ाना विरोधी एंटीबॉडी TdTomato के साथ दाग के बाद दिखाया जाता है. नाभिक DAPI (नीला) से सना है । (C) और (D) में दिखाए गए चित्र १३.२ mm x १७.५ mm हैं । त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में विशेष रूप से गुर्दे में प्रतिलिपि जीन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए एक मजबूत तरीका बताया गया है । एक मामूली अनुभवी सर्जन के हाथ में हम इस तकनीक से transfected चूहों के प्रतिशत को 50-100% की सीमा में हो पाया है, माउस उंर और transgene के readout की संवेदनशीलता पर निर्भर करता है । luciferase जीन अभिव्यक्ति का स्तर piggyBac transposons प्राप्त चूहों में कई महीनों के लिए पृष्ठभूमि के ऊपर था और पूरी तरह से प्रतिरक्षा चूहों में एक ही transposons11प्राप्त करने के कई हफ्तों के लिए बनाए रखा । जबकि कई कोशिकाओं इंजेक्शन साइट के पास क्षेत्रों में transgene के लिए चमकीले दाग, समग्र अभिकर्मक दक्षता अपेक्षाकृत कम था (चित्रा 3 डी) । सबसे महत्वपूर्ण सामग्री वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए इंजेक्शन सिरिंज ही है. यह एक 29G एक्स ½ "एक संलग्न सुई और कोई सुरक्षा इंजेक्शन में बाधा के साथ इंसुलिन सिरिंज होना चाहिए. इंजेक्शन तेजी से होना चाहिए, तीन एस के भीतर. प्लाज्मिड डीएनए तैयारी शुद्ध होना चाहिए, बहुत कम endotoxin और बैक्टीरियल जीनोमिक डीएनए के स्तर के साथ19।

यह ऐसी शाही सेना, वायरस, या प्रोटीन के रूप में अंय पदार्थों के इंजेक्शन, एक समान तरीके से किया जा सकता है कि कल्पना है । गुर्दे श्रोणि अन्य इंजेक्शन साइटों के लिए प्रवेश के एक मार्ग के रूप में बेहतर था परीक्षण, गुर्दे की नस या गुर्दे पैरेन्काइमा के प्रत्यक्ष इंजेक्शन के रूप में. उन इंजेक्शन खून बह रहा है और कम जीन अभिव्यक्ति11के लिए नेतृत्व किया । क्योंकि गुर्दे श्रोणि एक लोचदार संरचना के लिए कभी कभार मूत्र backflow पकड़ की आवश्यकता है, यह बेहतर करने के लिए खिंचाव और सुई को समायोजित करने में सक्षम हो सकता है । डीएनए समाधान या इंसुलिन सिरिंज के द्वारा बनाई गई छेद से मूत्र का रिसाव नहीं मनाया गया है, सुझाव है कि गुर्दे श्रोणि जल्दी से मरम्मत की है. सटीक तंत्र है जिसके द्वारा इंजेक्शन द्रव transfects गुर्दे गहराई में अध्ययन नहीं किया गया है के रूप में यह जिगर के लिए है, उदाहरण के लिए. भविष्य इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन इस तंत्र को आगे स्पष्ट सकता है । इंजेक्शन की प्रतिगामी प्रकृति में तरजीह है कि hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन विधि यकृत नस20 और गुर्दे अभिकर्मक के अंय सफल तरीकों के प्रवाह को उलट गुर्दे की नस12के माध्यम से इंजेक्शन है, 13 , 14 , 21. गुर्दे की क्षति की संभावना इष्टतम अभिकर्मक क्षमता के लिए आवश्यक है तो हम परिकल्पना कि अभिकर्मक कोशिका तेज, उच्च मात्रा इंजेक्शन की वजह से झिल्ली को नुकसान के माध्यम से होता है । podocytes, नलिकाओं, और इकट्ठा नलिकाएं सभी उनके प्रमुख समारोह के रूप में मूत्र अंतरिक्ष के साथ प्रत्यक्ष इंटरफेस है फिल्टर और मूत्र ध्यान केंद्रित है ।

हालांकि प्रतिलिपि और गुर्दे विशेष, इस विधि अपेक्षाकृत कम अभिकर्मक स्वीकार्य द्वारा सीमित है (चित्रा 3 डी) । Hydrodynamic गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन एक ट्रांसजेनिक पशु के निर्माण के लिए एक विकल्प नहीं है एक गुर्दा विशेष प्रमोटर, जिसमें पशु में एक निश्चित उपप्रकार की हर कोशिका ब्याज की जीन व्यक्त होता से transgene ड्राइविंग । बल्कि इस विधि सबसे अच्छा रोगों में जो सही कोशिकाओं की एक छोटी संख्या phenotype पर एक नाटकीय प्रभाव होता है के लिए जीन हस्तांतरण दृष्टिकोण के लिए अनुकूलित है, हार्मोन या अंय आम तौर पर गुर्दे द्वारा उत्पादित पदार्थों के स्राव के लिए, या के निर्माण के लिए एक दुर्लभ कोशिकाओं है कि गुर्दे पर कुछ सकारात्मक प्रभाव की मरंमत या इसे पुनर्जीवित करने के लिए लागू होगा की जनसंख्या । वैकल्पिक रूप से, यह भी विपरीत रास्ते में इस्तेमाल किया जा सकता है एक नकारात्मक प्रभाव के साथ एक transgene शुरू करने से गुर्दे की चोट के नए मॉडल विकसित करने के लिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने और हितों का कोई विरोध नहीं करने की घोषणा कुछ भी नहीं है ।

Acknowledgments

दिग्गजों मामलों के विभाग से एक कैरियर विकास पुरस्कार [BX002797] समर्थित L.E.W. और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों [R01-DK095867] और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन [15GRNT25700209] समर्थित J.C. राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [DK093660], दिग्गजों मामलों के विभाग [BX002190], और गुर्दे की बीमारी के लिए वेंडरबिल्ट केंद्र समर्थित M.H.W. इस सामग्री के संसाधनों और VA टेनेसी घाटी स्वास्थ्य सेवा प्रणाली में सुविधाओं के उपयोग के साथ समर्थित काम का परिणाम है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AnaSed Xylazine Patterson Veterinary 07-808-1947 Anesthetic - Not controlled substance
BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch Cardinal Health 309306 Required syringes
Buprenex Pharmacist/Veterinarian Analgesia - Controlled Substance
Dynarex Disposable Towel Drape Thermo Fisher Scientific 19-310-671 Place over heat pad
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Use only endotoxin-free plasmid DNA
Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control Charles River PC200 Positive control for endotoxin test
Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial Charles River R13500 Endotoxin test
Extra Fine Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5882 Surgical tool
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch - 9" Thermo Fisher Scientific 01-812-51 For autoclaving surgical tools
Gaymar Heat Pump Paragon Medical TP-700 Water-circulating heat pump
Germinator 500 Roboz Surgical Instrument DS-401 To reuse surgical tools during surgery
Graefe Forceps Roboz Surgical Instrument RS-5136 Surgical tool
Graefe Tissue Forceps Roboz Surgical Instrument RS-5153 Surgical tool
Halsey Needle Holder, 5" Length Roboz Surgical Instrument RS-7841 Surgical tool
Heat pads - 15" x 21" - need at least 3 Paragon Medical TP22G For use with Gaymar Heat Pump
IsoFlo (Isoflurane, USP) Abbott Animal Health 5260-04-05 For imaging and euthanasia
Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor Smiths Medical VCT3K2 For imaging and euthanasia
Ketamine Pharmacist/Veterinarian Anesthetic - Controlled Substance
Kimwipes Kimberly-Clark Professional 34120 Laboratory tissues
Living Image software Caliper Life Sciences For live animal imaging
Luciferin Perkin Elmer 122796 For live animal imaging
Nanodrop 2000 Thermo Scientific ND-2000-US-CAN Spectrophotometer for DNA measurement
Prevantics Swabs Thermo Fisher Scientific 23-100-110 For skin surgery prep
Prolene 5-0 sutures Taper 30" Thermo Fisher Scientific NC0256891 Non-absorbable sutures for skin
Puralube Brand Opthalmic Ointment Patterson Veterinary 07-888-2572 To keep eyes moist during surgery
Trans IT - QR Hydrodynamic Delivery Solution Mirus Bio MIR-5240 Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA
Vicryl 5-0 Sutures J303H Thermo Fisher Scientific NC9816710 Absorbable sutures for muscle layer
Wahl Mini Arco Clipper Med-Vet International 8787-1550 Shaver for skin prep
Xenogen IVIS 200 Caliper Life Sciences For live animal imaging

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक १३१ गुर्दे जीन थेरेपी जीन स्थानांतरण इंजेक्शन गुर्दे श्रोणि प्लाज्मिड डीएनए
गुर्दे में प्रोटीन के गैर वायरल अभिव्यक्ति के लिए Hydrodynamic गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन
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Woodard, L. E., Welch, R. C., Williams, F. M., Luo, W., Cheng, J., Wilson, M. H. Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney. J. Vis. Exp. (131), e56324, doi:10.3791/56324 (2018).

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