Målet med denne protokol er specifikt tag og selektivt isolere viral DNA fra inficerede celler til karakterisering af virale genom forbundet proteiner.
Målet med denne protokol er for at isolere herpes simplex virustype 1 (HSV-1) DNA fra inficerede celler til identifikation af forbundet viral og cellulær proteiner af masse massespektrometri. Selv om proteiner, der interagerer med viral genomer spiller vigtige roller i afgøre udfaldet af infektion, var en omfattende analyse af virale genom forbundet proteiner ikke tidligere muligt. Her viser vi en metode, der muliggør direkte rensning af HSV-1 genomer fra inficerede celler. Replikerende viral DNA er selektivt mærket med modificerede nukleotider, der indeholder en alkyn funktionelle gruppe. Mærket DNA er så specifikt og uigenkaldeligt markeret via den kovalente fastgørelse af biotin indeholder via en kobber (I)-katalyseret indeholder-alkyn cycloaddition eller klik reaktion. Biotin-mærkede DNA er renset på streptavidin-belagte perler og tilknyttede proteiner er elueret og identificeret ved massespektrometri. Denne metode gør det muligt for selektiv målretning og isolation af HSV-1 replikation gafler eller hele genomer fra komplekse biologiske miljøer. Derudover tilpasning af denne tilgang vil gøre det muligt for undersøgelse af forskellige aspekter af herpesviral infektion, samt undersøgelse af genomer af andre DNA virus.
Virus har en begrænset kapacitet til at udføre væsentlige funktioner og derfor afhænge af host faktorer til at lette kritiske aspekter af infektioner herunder virale Gen-ekspression, replikering, reparation, rekombination og transport. Aktiviteterne i disse vært faktorer er ofte forstærket af viralt kodede proteiner. Derudover skal virus undgå afsløring og indblanding af cellulære svar til viral infektion. Derfor, virus værtssammenspil diktere resultatet af infektion. Altafgørende forståelse af hvordan virus ændrer den cellulære miljø for at tilpasse den cellulære maskiner for at lette viral processer. Af særlig interesse er at identificere hvilke faktorer og processer, handle på viral genomer i hele den smitsomme cyklus.
Herpes simplex virustype 1 (HSV-1) er en dobbelt strandede DNA-virus, der inficerer en betydelig del af den menneskelige befolkning. Inden for den første time af infektion træder det virale genom atomkernen, hvor en bestilt kaskade af viral genekspression ensues i koordination med viral DNA (vDNA) replikering1. I kernen, genomer er underlagt epigenetisk regulering, gennemgå reparation og rekombination, og er pakket ind i capsids, således at de første afkom virioner produceres i mindre end seks timer. Den omfattende evaluering af virale genom forbundet proteiner i løbet af infektion vil lægge fundamentet for at undersøge de molekylære detaljer af processer, der fungerer på viral genomer, og vil give indblik i hvilke viral og cellulær faktorer er involveret i forskellige stadier af infektion.
Tidligere metoder til undersøgelse af vært faktorer involveret i viral infektion omfatter affinitet rensning af virale proteiner til analyse af tilknyttede cellulære proteiner2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. disse assays har været medvirkende til identifikation af cellulære faktorer involveret i vært antiviral svar samt viral kromatin modifikation, genekspression, og DNA reparation. Det er imidlertid vanskeligt at fastslå, om interaktioner afhænger af foreningen med vDNA, og proteomics kun giver indsigt i samspil, der opstår som en funktion af en specifik viral faktor. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) er blevet brugt til at identificere, hvor specifikke viral og cellulær proteiner binder til viral genomer10,11,12,13,14 , 15 og fluorescerende in situ hybridisering (FISH) kombineret med immuncytokemi har aktiveret visualisering af cellulære faktorer, der colocalize med vDNA16,17,18, 19 , 20. disse assays mulighed for rumlige og tidsmæssige analyse. Dog omfatter begrænsninger behovet for meget specifikke antistoffer, begrænset følsomhed og behovet for tidligere indsigt i virus værtssammenspil. Vi har derfor udviklet en metode baseret på iPOND (isolation af proteiner på spirende DNA)21 og aniPOND (accelereret indfødte iPOND)22 til selektivt etiket og rense vDNA fra inficerede celler til objektiv identifikation af virale genom tilknyttede proteiner af massespektrometri. iPOND har været medvirkende til undersøgelse af cellulære replikation gaffel dynamics.
Til selektiv rensning af viral genomer fra inficerede celler er replikere vDNA mærket med ethynyl modificeret Nukleosider, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) eller 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (figur 1), efterfulgt af kovalent konjugation at biotin indeholder via Klik på kemi til at lette trinvist rensning af viral genomer og tilknyttede proteiner på streptavidin-belagte perler (figur 2B). Vigtigere, er infektioner udført i stationære celler, som ikke er involveret i cellulære DNA-replikation at aktivere særlige mærkning af vDNA. Derudover HSV-1 infektion forårsager celle cyklus anholdelse og hæmmer cellulære DNA replikation23,24. Virus kan prelabeled før infektionen til analyse af proteiner forbundet med indgående viral genomer (figur 1A) eller mærket under DNA replikation til analyse af proteiner forbundet med nyligt syntetiserede vDNA (figur 1B) 25. Desuden puls chase analyse kan bruges til at undersøge karakteren af proteiner forbundet med viral replikation gafler (figur 1 c)26. Derudover kan ethynyl-modificerede vDNA kovalent konjugeret med et fluorophore for fysisk undersøgelse af protein dynamics (figur 2A og figur 3). Imaging giver mulighed for direkte visualisering af vDNA og er en gratis tilgang til validering af vDNA-protein interaktioner, og kan tilpasses til at holde styr på viral genomer hele infektion. Vi forventer, at disse metoder kan ændres yderligere, at studere ethvert aspekt af herpesviral infektion, herunder ventetid og reaktivering, og til at studere andre DNA virus. Desuden kan mærkning med 5-ethynyl uridine (EU) tillade til analyse af RNA viral genomer.
Denne protokol omfatter flere trin, som, hvis ikke fulgt nøje, kan medføre betydeligt reduceret protein udbytte eller kontaminering med cellulære DNA. Det er afgørende at stationære celler anvendes til alle eksperimenter for at cellulære DNA ikke er mærket og renset. Dette kan bekræftes ved manglen på cellulære DNA polymeraser i eksemplet protein fordi HSV-1 ikke udnytte cellulære DNA polymerase for genom syntese. Under EdC mærkning og kerner høst trin, bør prøver fordeles til at sikre, at alle behandles l…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Hannah Fox for hjælp ved udarbejdelsen af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af NIH give R01AI030612.
MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
HSV-1 stock | stocks with titers greater than 1×109 PFU/mL work best | ||
Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
Nuclear Extraction Buffer (NEB) | prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
(+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
Click Reaction Mix | prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
freezing buffer | prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
Buffer B1 | prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
Buffer B2 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
Buffer B3 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
Cell strainer | Falcon | 352360 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
2X Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
Standard western blotting reagents | |||
NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | prepare 3% in 1x PBS |
Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
Click reaction cocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | prepare according to manufactorer's protocol |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
chloroform:isoamyl alcohol | mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
Cell culture incubator | |||
Biosafety cabinet | |||
Heat blocks | 65 °C and 95 °C |