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Neuroscience

FITC 标记白蛋白静脉滴注对神经退行性疾病模型血脑屏障通透性的评价

Published: November 8, 2017 doi: 10.3791/56389
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Centre for Neurogenetics and Rare Diseases, IRCCS Neuromed

ERRATUM NOTICE

Summary

在这项研究中, 我们提出了一个简单和有效的程序来评估在神经退行性条件下血脑屏障的破坏。为了达到我们的目标, 我们在小鼠颈静脉内注入了高分子荧光素异硫氰酸酯标记 (FITC)-白蛋白, 并通过荧光显微镜将其渗漏到脑实质中。

Abstract

破坏血脑屏障 (BBB) 的完整性是一个常见的特点, 不同的神经和神经退行性疾病。虽然扰动 bbb 稳态和脑疾病的发病机制之间的相互作用需要进一步的研究, 开发和验证可靠的程序, 以准确地检测 bbb 改变可能是至关重要的, 并代表了一个有用的工具潜在的预测疾病进展和制定有针对性的治疗策略。

在这里, 我们提出了一个简单和有效的程序, 评估脑屏障渗漏的神经退行性的情况, 如发生在一个前临床小鼠亨廷顿疾病模型, 其中的缺陷, 血 bbb 的渗透性是明确可探测早熟这种疾病。具体来说, 高分子量的荧光素异硫氰酸酯标记 (FITC)-白蛋白, 只有当后者被削弱时才能够穿过 BBB, 在血管或实质区内被剧烈注入小鼠颈静脉并分布然后由荧光显微镜测定。

绿色荧光-白蛋白在脑实质中的积累是异常 BBB 通透性的一个指标, 当定量使用图像 J 处理软件时, 报告为绿色荧光强度。

Introduction

中枢神经系统内稳态是神经元细胞正常沟通和功能的先决条件。中枢神经系统的实质是由内皮血脑屏障 (BBB) 与周围紧密封闭的, 它代表着外周血和脑的接口, 在这两个区之间的相声中起着举足轻重的作用1 ,2。血脑屏障是一种复杂的动态三维结构, 主要由专门的微血管内皮细胞 (ECs) 通过细胞间连接-紧密接合 (TJs) 和周, 神经元结尾和星形胶质细胞脚处理1,2。

在生理条件下, 完整的血脑屏障的极低通透性确保了对营养物质和其他分子进出大脑的严格调节, 并为中枢神经系统提供了独特的保护, 使其不会发生可能影响神经活动和反对可能的周边侮辱的血液的构成1,2,3。

长期以来, 对 BBB 完整性及其增强的渗透性的破坏已经成为许多神经和神经退行性疾病的关键特征4包括亨廷顿氏病 (HD)5,6, 但是, 这种功能失调是一种致病现象还是在病程中繁殖事件尚不清楚。血脑屏障破裂的时间也仍然难以捉摸, 然而, 我们组和其他人的新证据表明, 扰乱 bbb 完整性并不代表疾病进展的晚期事件, 而是早期的步骤6,7,8, 可能会产生长期后果。

考虑到这一点, 重要的是要早熟揭示 BBB 故障在神经, 以制定战略有用的预测疾病进展和脑损伤, 并制定替代和更有针对性的干预, 能够成功减轻这种破坏的临床后果。因此, 对脑屏障损害的可靠影像学研究, 在大脑疾病的实验和临床管理中具有重要意义。

本文介绍了利用高分子量荧光素异硫氰酸酯标记白蛋白 (FITC-白蛋白) 在 HD 小鼠模型中评价 BBB 通透性的一种成功而简单的方法。FITC-白蛋白的外渗, 通常不能越过屏障, 进入脑实质被测量为 BBB 渗漏的一个指标。该技术易于适应大鼠和其他病理条件的特点, cerebrovasculature 损害9,10。

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Protocol

所有动物程序均由 IRCCS Neuromed 动物保育审查委员会和 #34 批准; 依 Superiore Sanit 和 #224; #34; (许可证编号: 1163/2015-PR), 并按照欧盟指令2010的指导方针/63/欧洲动物实验.

1. 注射到颈静脉内的 FITC-白蛋白溶液的制备

注意: 所有实验都是在清单 (11 周龄) HD R6/2 小鼠和年龄和性别匹配的野生型 (重量) 控制中进行的。窝.

  1. 在磷酸缓冲盐水 (PBS) 中溶解 FITC-白蛋白粉末 (参见 材料表 ), 在10毫克/毫升。 注: 为获得最佳效果, 应为每个标签反应准备新的.

2。外科手术中使用的设备的准备工作

  1. 放置以前的蒸压的外科仪器 (请参见 材料表 )。
  2. 用酒精 (70% 乙醇溶液) 清洗手术台。准备手术区 (45 厘米 x 45 厘米) 与外科无菌一次性毛巾悬垂和设置操作显微镜.

3。FITC-白蛋白输注到颈静脉的手术方法

  1. 记录麻醉时的鼠标体重.
  2. 麻醉鼠腹腔注射 (i. p) 的适当剂量氯胺酮 (100 毫克/千克)-嗪 (10 毫克/千克) 溶液.
  3. 在 Walantus et al. 中, 通过轻柔的脚趾掐缩反应来监测动物镇静反应, 如下所示 11 , 12 .
  4. 将麻醉鼠标置于正面仰卧位置, 并用胶带固定在手术台上的四条腿和尾部.
  5. 在鼠标安全后, 小心地用电动剃须刀将颈部适当的手术边缘剃掉 (参见 材料表 ), 并用聚维酮碘溶液和70% 乙醇对其进行消毒.
  6. 用棉签将裸露的剃光表面烘干.
  7. 轻轻地拉起剃光的皮肤, 用手术刀做一个1.5 厘米长的纵向切口, 在锁骨线上, 从胸部的中段开始, 延伸到颈部以下.
  8. 在显微镜观察 (5X 放大倍率) 下, 仔细地将结缔组织与镊子分开, 以暴露颈外静脉.
  9. 确保在右侧和颈静脉左侧有足够的空间, 以方便插入30和 #189; G 针用于 FITC-白蛋白溶液的注入.
  10. 通过使用30和 #189, 静脉注射 (右颈静脉) (3 分钟以上) 与100和 #181; L 10 毫升/千克 FITC-白蛋白; G 针.
  11. 15 分钟后, 安乐将鼠标斩首, 迅速从头骨上移除先前描述的大脑 13 , 并将其浸入15分钟, 至少10x 的大脑本身的 pre-chilled 戊.
  12. 将戊冷冻的大脑移动到 pre-chilled 管中, 并将其存储到-80 和 #176; C 冷冻直到组织学切片.

4。FITC-白蛋白注入脑组织切片的研究

  1. 在最佳切削温度 (OCT) 复合物中嵌入冷冻大脑 (见 材料表 ) 在低温切片之前.
  2. 按顺序将大脑切成20和 #181; m 厚部分, 低温 (请参阅 材料表 ), 并将其安装到显微镜玻璃幻灯片上.
  3. 使用特定的 anti-laminin 抗体 (见材料表) 执行 FITC-白蛋白/层粘连蛋白 co-staining, 如前所述 6 。
    1. 简要地, 在夜间与主抗体 anti-laminin (pAb 1:1000) 孵育切片, 并进行适当的二级抗体共轭 Cy3.
    2. 片幻灯片, 安装介质包含4和 #39;, 6-diamidino-2-吲 (DAPI) (吸收峰值 = 360 nm; 发射峰值 = 460 nm (请参阅 材料表 )
    3. 使幻灯片在4和 #176 中通宵晾干; C 在黑暗中.
    4. 在荧光显微镜下观察荧光染色 (参见 材料表 ), 在20X 倍放大器上装有两个 FITC (吸收峰值 = 495 nm; 发射峰值 = 525 nm) 和 Cy3 滤镜 (吸收峰值 = 550 nm; 发射峰值 = 570 nm)。
      1. 在染色后立即查看样品, 用指甲油固定在角上的片, 并在显微镜下检查, 如上图 (4.3.3).

5。设置荧光显微镜和彩色图像采集

  1. 设置荧光显微镜如下.
    1. 在使用前10分钟打开萤光灯。打开显微镜、连接的计算机和数码相机。运行图像分析软件 (请参见 材料表 ).
    2. 使用适当的目标来优化信号收集和空间分辨率, 并选择适当的筛选器.
  2. 获取彩色图像
    1. 在图像分析软件中选择 [实时] 命令 (参见 材料表 ), 并为每个滤镜设置最佳光照参数.
    2. 选择 [冻结] 命令以获得单通道彩色图像并添加缩放栏 (#39; 编辑和 #62; 刻录缩放和 #39;)
    3. 保存 #39 中的每个图像; tiff 和 #39; 格式.
    4. 通过选择和 #39; 文件和 #62; 合并通道和 #39, 将通道合并到单个图像中; 并将其保存在
    5. tiff 和 #39; 格式
    6. 每个脑切片 (每张幻灯片6节) 获取至少四二十四位彩色图片 (2200 和 #181; m x 3400 和 #181; m).

6。FITC-白蛋白外渗的评价

  1. 通过使用自由可用的 ImageJ 来分析每个通道的荧光强度 14 , 15 .
  2. 通过每个图像的总 CY3-Laminin 荧光强度使 FITC 白蛋白的总荧光信号强度正常化, 并将血管外的淤血白蛋白报告为绿色荧光强度.

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Representative Results

适当的 FITC-白蛋白注入颈静脉的结果在绿色荧光示踪剂从血液进入大脑 parenchymawhen BBB 是危及6。在生理条件下, 注入的荧光白蛋白的分布仅限于脑血管内, 周围血管区和/或脑实质的信号都是可探测的 (图 1A, 显微顶)。相反, 当血脑屏障在神经病理环境下被破坏时, FITC-白蛋白在血管空间和大脑实质 (图 1A, 底部显微) 显示了弥漫荧光模式。与血管标记, 层粘连蛋白共同染色, 用于清楚地定位 FITC 白蛋白积累的部位 (图 1A)。通过使用图像处理软件 (参见材料表) 和报告为绿色荧光强度 (N = 3; 0.3112 vs 0.5765; ***, p = 0.0004, 评估了 FITC-白蛋白在受损 BBB 中发出的绿色荧光强度的增加。未配对 T 检验) (图 1B)。FITC-白蛋白的强度是正常化的上述报告。

Figure 1
图 1: FITC-白蛋白外渗是 BBB 损伤的标志.(A) 代表荧光显微的脑 cryosections 显示绿色荧光白蛋白在下的生理 (顶) 和病理条件 (下) 的差异分布. 红色染色代表血管标记层粘连蛋白。曝光时间: DAPI 20 毫秒, FITC 500 ms, Tx 红 60 ms 刻度栏 = 100 µm (合并专论)。(B) 此图显示了 FITC-白蛋白所发出的绿色荧光的量化, 这是报告为绿色荧光强度 (见步骤 6.2), 在生理 (健康 bbb) 和病理条件 (危害 bbb)。N = 3。数据表示为平均± SD, ** p = 0.0004 (不成对 T 检验)。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

我们在这里描述的技术主要是用来检测脑疾病状态下的 BBB 渗漏。BBB 功能障碍是越来越多的关注, 作为一个常见的特点, 不同的神经系统疾病4。我们以前使用这种方法来描述在一个罕见的神经退行性疾病的小鼠模型, 如 HD6早期紊乱的 BBB 完整性。

该方法利用了程序的相对简单性和有效性, 提供了准确、可靠的结果。它代表了一个高度敏感的前临床研究工具, 是有用的速度和直接它提供定性评估 BBB 中断的简单可视化的绿色荧光在分段脑组织。然而, 与生物化学和分子分析结合, 该技术成功地提供了有关血管内皮 TJs 的结构和功能完整性的定量信息, 并允许分析 BBB 的相关性。大脑稳态紊乱

虽然它不能提供任何关于 BBB 超微结构的信息, 但这里所描述的协议可能会导致比较便宜和 time-demanding 的程序, 与其他方法如高分辨率电子显微镜16,17. 此外, 由于其易于应用和重现性, 该程序可能有助于监测脑血管的进步病变的特点, 神经变性紊乱的临床前模型。

一个巨大的力量, 评估 bbb 中断的荧光方法在于潜在的研究的作用, 细微的变化 bbb 功能的常见和罕见的神经紊乱, 并最终直接测试的效果血脑屏障-影响药物或内源性分子时, 应用于血液或大脑室。虽然这一过程还不能转化为人类, 但它有可能为将来用于临床实践的新脑示踪剂的开发提供适应症。

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Disclosures

作者没有利益冲突披露

Acknowledgments

这项工作得到了 "基金会 Neuromed" 的支持, 由意大利卫生部 "74年2月 Corrente" 资助科诺诺夫

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate SIGMA A9771-100MG
pAb anti-Laminin Novus Biologicals NB300-144
CY3 anti-rabbit made in goat MILLIPORE AP132
SUPERFROST PLUS Thermo Scientific J1800AMNZ
Cover Slips 24 X 50 mm Thermo Scientific (DIAPATH) 61050
Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound Bio Optica 05-9801
VECTASHIELD Mounting Media VECTOR H-1500 Mounting media with DAPI
iNSu/Light Insulin Disposible Syringe RAYS Health & Safety INS1ML26G13
30G 1/2" BD Microlance 304000 Needle for Insulin disposible Syringe
Scalpel Handle F.S.T. 91003-12
#22 Disposable Scalpel blads F.S.T. 10022-00
Fine Iris scissors 10.5 cm F.S.T. 14094-11
Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm F.S.T. 11251-35
Graefe Forceps 10 cm F.S.T. 11051-10
Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm F.S.T. 11251-20
Medical patch Medicalis 34788
Sterile disposable towel drape Dispotech TVO50VE
Stereoscopic Microscope NIKON SMZ 745 T
Optic Illuminator LED light (C-FLED2) NIKON 1003167 Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope
Eclipse Ni-U Microscope Nikon 932162 Epifluorescence Microscope
Microscope digital Camera Nikon DS-Ri2 Microscope camera
Intenslight Nikon C-HGFI Microscope lamp
NIS-Elements 64 bit Nikon AR 4.40.00 Analysis Software
Electric Razor Gemei GM-3007

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References

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Tags

神经科学 问题 129 血脑屏障 (bbb) bbb 通透性 FITC-白蛋白 神经 静脉注射 小鼠模型

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:

Maglione Vittorio

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Vittorio Maglione

FITC 标记白蛋白静脉滴注对神经退行性疾病模型血脑屏障通透性的评价
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Di Pardo, A., Castaldo, S., Capocci, … More

Di Pardo, A., Castaldo, S., Capocci, L., Amico, E., Maglione, V. Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. J. Vis. Exp. (129), e56389, doi:10.3791/56389 (2017).

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