ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
In questo studio, presentiamo una procedura semplice ed efficace per valutare la rottura della barriera sangue - cervello sotto circostanze neurodegenerative. Per raggiungere il nostro obiettivo, abbiamo infuso isotiocianato di fluorescina di alto peso molecolare etichettato (FITC)-albumina in giugulare del mouse della vena e valutate le perdite nel parenchima cerebrale mediante microscopia a fluorescenza.
Abstract
Rottura dell'integrità della barriera emato - encefalica (BBB) è una caratteristica comune per le diverse malattie neurologiche e neurodegenerative. Anche se l'interazione tra perturbato BBB omeostasi e la patogenesi dei disordini del cervello ha bisogno di ulteriori indagini, lo sviluppo e la convalida di una procedura affidabile per rilevare con precisione la barriera ematoencefalica può essere cruciale e rappresentano uno strumento utile per la predizione potenzialmente malattia progressione e lo sviluppo di mirate strategie terapeutiche.
Qui, presentiamo una procedura semplice ed efficace per valutare la perdita BBB in condizioni neurodegenerative come quello che accade in un modello murino preclinico di malattia di Huntington, in cui i difetti della permeabilità della BBB sono chiaramente rilevabili precocemente in la malattia. In particolare, l'alto peso molecolare isotiocianato di fluorescina etichettato (FITC)-albumina, che è in grado di attraversare la BBB solo quando quest'ultima è compromessa, viene acutamente infusa di una vena giugulare del mouse e la sua distribuzione nei distretti vascolari o parenchimatici è quindi determinata da microscopia di fluorescenza.
Accumulo di verde fluorescente-albumina nel parenchima del cervello funziona come un indice di permeabilità BBB aberrante e, quando quantificati utilizzando software di elaborazione immagine J, viene segnalato come l'intensità di fluorescenza verde.
Introduction
Omeostasi all'interno del sistema nervoso centrale (SNC) è un prerequisito per la corretta comunicazione e la funzione delle cellule neuronali. Il parenchima CNS è ermeticamente sigillato dalla periferia con l'endoteliale emato - encefalica (BBB), che rappresenta l'interfaccia tra il cervello e il flusso sanguigno periferico e svolge un ruolo fondamentale nel cross-talk tra questi due distretti1 ,2. La BBB è un complesso e dinamico struttura tridimensionale composta principalmente di micro-nave endothelial cellule specializzate (ECs) collegate tra loro attraverso i complessi giunzionali intercellulari - giunzioni strette (TJs) - e circondati da periciti, neurone terminazioni e astrociti piede processi1,2.
In condizioni fisiologiche, la bassissima permeabilità della BBB intatta assicura la severa regolamentazione del trasporto di sostanze nutritive e di altre molecole dentro e fuori il cervello e fornisce il sistema nervoso centrale con un'unica protezione dai cambiamenti che si verificano nella composizione del sangue che potrebbe influenzare l'attività neurale e contro potenziale periferico insulti1,2,3.
Rottura della BBB l'integrità e la sua permeabilità migliorata lungamente è stata conosciuta per costituire una caratteristica fondamentale per molti neurologiche e neurodegenerative disturbi4 compreso la malattia di Huntington (HD)5,6, tuttavia , se una tale disfunzione è un fenomeno causativo o un evento propagativo nel corso della malattia è ancora poco chiaro. I tempi di crisi di BBB anche resta sfuggenti, tuttavia, dal nostro gruppo ed altri la prova emergente indica che perturbato BBB integrità non rappresenta un evento ritardato nella progressione di malattia, ma piuttosto un punto iniziale6,7 , 8, che può avere conseguenze a lungo termine.
Con questo in mente, è importante rivelare precocemente ripartizione BBB nella neurodegenerazione al fine di sviluppare strategie utili per predire la progressione della malattia e del danno cerebrale e sviluppare interventi alternativi e più mirati in grado di correttamente mitigare le conseguenze cliniche di tali una perturbazione. Formazione immagine affidabile di danno BBB è, pertanto, di grande importanza nella ricerca sperimentale e gestione clinica delle malattie del cervello.
In questo articolo, descriviamo una procedura semplice e di successo per la valutazione della permeabilità BBB in un modello di topo HD utilizzando l'alto peso molecolare della fluorescina isotiocianato etichettati-albumina (FITC-albumina). Stravaso di FITC-albumina, che normalmente non può attraversare la barriera, nel parenchima del cervello è stato misurato come indice di dispersione BBB. Questa tecnica è facilmente adattabile ai ratti e ad altre condizioni patologiche caratterizzate da cerebrovasculature danno9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
tutte le procedure sugli animali sono state approvate da IRCCS Neuromed Animal Care Review Board e " Istituto Superiore di Sanità " (permettere numero: 1163/2015-PR) e sono stati in conformità degli orientamenti dell'UE direttiva 2010 / 63/EU per gli esperimenti sugli animali.
1. preparazione della soluzione di FITC-albumina deve essere iniettato in vena giugulare
Nota: tutti gli esperimenti sono stati controllo trasportato in manifesti topi HD R6/2 (11 - vecchio settimana) e in età e genere-abbinato wild-type (WT) littermates.
- Sciogliere FITC-albumina polvere (Vedi Tabella materiali) in tampone fosfato salino (PBS) 10 mg/ml.
Nota: Per risultati ottimali, questo dovrebbe essere preparato fresco per ogni reazione etichettatura.
2. Preparazione delle attrezzature per essere utilizzato durante la chirurgia
- stendere gli strumenti chirurgici precedentemente sterilizzati nell'autoclave (Vedi Tabella materiali).
- Pulire la panchina chirurgica con alcool (soluzione di etanolo 70%). Preparare l'area chirurgica (45 x 45 cm) con un telo chirurgico sterile monouso asciugamano e impostare lo stereomicroscopio operativo.
3. Procedura chirurgica per FITC-albumina infusione nella vena giugulare
- registrare il peso del corpo del mouse per anestesia.
- Anesthetize mouse con un'iniezione intraperitoneale (i. p) di una dose adeguata di ketamina (100 mg/kg) - soluzione xilazina (10 mg/kg).
- Monitor sedazione animale di pizzico di delicata punta ritirare riflesso come dimostrato in Walantus et al. 11 , 12.
- posizionare il mouse anestetizzato in posizione supina di scoperte e fissare i quattro zampe e la coda sul banco di lavoro chirurgico con nastro adesivo.
- Dopo che il mouse è assicurato, attentamente radere il margine chirurgico appropriato sul collo con un rasoio elettrico (Vedi Tabella materiali) e disinfettarlo con povidone-iodio soluzione e 70% di etanolo.
- a secco la superficie esposta rasata con tamponi di cotone.
- Delicatamente tirare la pelle rasata e fare un'incisione longitudinale lungo 1,5 cm, di bisturi, nell'emiclaveare linea inizia a metà strada sul torace e si estende per appena sotto il collo.
- Con molta cautela tirare parte del tessuto connettivo con forcipe sotto osservazione al microscopio (ingrandimento 5x) per esporre la vena giugulare esterna.
- Garantire un sufficiente spazio sulla destra e sulla sinistra della vena giugulare per facilitare l'inserimento dell'ago per l'infusione della soluzione FITC-albumina 30½ G.
- Iniettare per via endovenosa l'animale (a destra della vena giugulare) lentamente (più di 3 minuti) con 100 µ l di 10 mL/kg FITC-albumina utilizzando l'ago 30½ G.
- Dopo 15 minuti, eutanasia il mouse per decapitazione, rapidamente rimuovere il cervello dal cranio come descritto in precedenza 13 e immergerlo per 15 min in almeno 10 volte il volume del cervello stesso di pre-refrigerato isopentano.
- Spostare l'isopentano congelato il cervello in una provetta pre-refrigerata e memorizzarlo in un congelatore a-80 ° C fino al sezionamento istologico.
4. Istologica di sezionamento del cervello infuso con FITC-albumina
- Embed congelato il cervello in temperatura di taglio ottimale (OCT) composto (vedere la Tabella materiali) prima criostato sezionamento.
- In Serie tagliato il cervello in 20 sezioni spesse µm, con un criostato (Vedi Tabella materiali) e montarli su vetrini microscopio.
- Eseguire la FITC-albumina/laminin co-colorazione utilizzando uno specifico anticorpo anti-laminina (Vedi tabella materiali) come precedentemente descritto 6.
- Brevemente, incubare sezioni con l'anticorpo primario anti-laminina (pAb 1: 1000) tutta la notte e procedere con appropriato anticorpo secondario coniugato di Cy3.
- Vetrino coprioggetto diapositive con mezzo di montaggio contenente 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (picco di assorbimento = 360 nm; picco di emissione = 460 nm (Vedi Tabella materiali).
- Lasciare la diapositiva per asciugare durante la notte a 4 ° C al buio.
- Osservare la fluorescenza macchiatura sotto un microscopio a fluorescenza (Vedi Tabella materiali) a 20 ingrandimenti dotato di entrambi FITC (picco di assorbimento = 495 nm; picco di emissione = 525 nm) e filtri Cy3 (picco di assorbimento = 550 nm; emissione picco = 570 nm).
- Per visualizzare i campioni immediatamente dopo la colorazione, fissare il vetrino coprioggetto agli angoli utilizzando smalto ed esaminarli al microscopio come sopra (4.3.3).
5. Impostazione del microscopio di fluorescenza e acquisizione di immagini a colori
- impostare il microscopio a fluorescenza come segue.
- Accendere la lampada fluorescenza circa 10 minuti prima dell'uso. Accendere il microscopio, il computer collegato e la fotocamera digitale. Eseguire il software di analisi di immagine (Vedi Tabella materiali).
- Utilizzare l'obiettivo appropriato per la raccolta ottimale del segnale e risoluzione spaziale e selezionare filtri appropriati.
- Acquisizione di immagini a colori
- selezionare il comando [live] sul software di analisi di immagine (Vedi Tabella materiali) e impostare i parametri di illuminazione ottimale per ogni filtro.
- Selezionare il comando [freeze] per prendere l'immagine di colore singolo canale e aggiungere la barra della scala (' Edit > masterizzare scala ')
- Salvare ogni immagine nella '. TIFF ' formato.
- Unire i canali in una singola immagine selezionando ' File > Merge canale ' e salvarlo nella
- tiff ' formato.
- Acquisire un minimo di quattro venti-quattro bit colore immagini (2200 µm x 3400 µm) per fetta di cervello (6 sezioni per vetrino).
6. Valutazione di FITC-albumina stravaso
- analizzare l'intensità di fluorescenza per ogni singolo canale tramite le liberamente disponibile ImageJ 14 , 15.
- Normalizzare l'intensità del segnale fluorescente totale di FITC-albumina dall'intensità fluorescente CY3-laminina totale per ogni immagine e segnalare l'albumina travasato fuori i vasi come intensità di fluorescenza verde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Infusione corretta di FITC-albumina nel vena giugulare produce lo stravaso del tracciante fluorescenza verde dal flusso sanguigno nel cervello parenchymawhen che BBB è compromessa6. In condizioni fisiologiche, la distribuzione di albumina fluorescente infuso è consentita all'interno dei vasi sanguigni del cervello e non è rilevabile alcun segnale nel parenchima circostante di zona e/o cervello perivascolare (Figura 1A, micrografie sul in alto). Al contrario, quando la BBB è compromessa in circostanze neuro-patologiche, FITC-albumina Mostra un pattern di fluorescenza diffusa lungo spazi perivascolari e nel parenchima del cervello (Figura 1A, micrografie sul fondo). Co-macchiatura con il marcatore vascolare, laminina, utilizzata per localizzare chiaramente sito di accumulo FITC-albumina (Figura 1A). Intensità di aumento della fluorescenza verde emessa da FITC-albumina nel compromesso BBB è stata valutata utilizzando una software di elaborazione di immagine (Vedi Tabella materiali) e segnalato come l'intensità di fluorescenza verde (N = 3; 0.3112 contro 0.5765; * * *, p = 0,0004, Spaiati T-test) (Figura 1B). Intensità di FITC-albumina è stato normalizzato come riportato sopra.
Figura 1: stravaso FITC-albumina come indicatore di danno BBB. Micrografie rappresentante fluorescenza (A) del cervello cryosections mostrando distribuzione differenziale dell'albumina verde fluorescente sotto sia fisiologico (parte superiore) e condizioni patologiche (in basso). Colorazione rossa rappresenta la laminina marcatore vascolare. Tempi di esposizione: DAPI 20 ms, FITC 500 ms, Tx Red 60 ms. scala bar = 100 µm (monografia di Unione). (B) questo grafico Visualizza la quantificazione della fluorescenza verde emessa da FITC-albumina, che viene segnalato come l'intensità di fluorescenza verde (Vedi punto 6.2), fisiologiche (BBB sano) sia in condizioni patologiche (compromesso BBB). N = 3. I dati sono rappresentati come media ± DS, * * * p = 0,0004 (test T spaiato). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La tecnica che descriviamo qui è utile principalmente per la rilevazione di perdite BBB in condizioni di malattia del cervello. Disfunzione BBB sta guadagnando l'attenzione come una caratteristica comune di diversi disordini neurologici4. In precedenza abbiamo utilizzato questo approccio per descrivere il derangement precoce dell'integrità BBB in un modello murino di una malattia neurodegenerativa rara come HD6.
Questo metodo si avvale della relativa semplicità e l'efficacia della procedura, che fornisce risultati accurati e affidabili. Rappresenta uno strumento di ricerca preclinica altamente sensibile ed è utile per la velocità e l'immediatezza che offre nel valutare qualitativamente rottura BBB di semplice visualizzazione di fluorescenza verde all'interno del tessuto di cervello sezionato. Tuttavia, quando combinato con analisi biochimica e molecolare, la tecnica è riuscita a fornire informazioni quantitative circa l'integrità strutturale e funzionale delle TJs endoteliale vascolare e consente di analizzare la correlazione di BBB rottura con l'omeostasi del cervello.
Anche se non può fornire tutte le informazioni circa l'ultrastruttura BBB, il protocollo descritto qui può provocare meno costose e richiedono tempo procedure rispetto ad altri metodi come di microscopia elettronica ad alta risoluzione16, 17. Inoltre, grazie alla sua facilità di applicazione e la riproducibilità, la procedura può essere utile per monitorare le lesioni progressive del sistema vascolare del cervello che caratterizzano i modelli pre-clinici di disordine neurodegenerative.
Una grande forza di valutare la rottura BBB da un approccio basato sulla fluorescenza si trova nel potenziale per indagare il ruolo dei cambiamenti sottili nella funzione BBB in comune e rari disturbi neurologici ed eventualmente di testare direttamente in tempo reale l'effetto di Farmaci che influenzano la BBB o molecole endogene quando applicato dal vano sangue o cervello. Anche se la procedura non può essere convertita ancora esseri umani, ha il potenziale per fornire indicazioni per lo sviluppo di nuovi rivelatori di cervello per essere utilizzato nella pratica clinica in futuro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse di divulgare
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da "Fondazione Neuromed" e finanziato dal Ministero italiano della salute "Ricerca Corrente" di V.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health & Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
References
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington's disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
- Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
- Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
- van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
- Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
- Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
- Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).
Tags
Neuroscienze problema 129 barriera emato - encefalica (BBB) permeabilità BBB FITC-albumina neurodegenerazione iniezione endovenosa modello del topoErratum
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
