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Summary
이 연구에서 우리는 신경 퇴행 성 조건 하에서 혈액-뇌 장벽 장애를 평가 하기 위한 간단 하 고 효율적인 절차를 제시. 우리의 목표를 달성 하기 위해 우리는 높은 분자량 fluorescein isothiocyanate 표시 (FITC) 주입-마우스 경으로 알 부 민 정 맥 및 형광 현미경 검사 법에 의해 뇌 실질에 그것의 누설을 평가.
Abstract
혈액-뇌 장벽 (BBB) 무결성의 중단은 다른 신경 및 신경 퇴행 성 질환에 대 한 일반적인 기능입니다. 교란된 BBB 항상성 및 뇌 질환의 병 인 사이 상호 작용 추가 조사 필요, 비록 개발 및 BBB 변경 정확 하 게 감지 하는 신뢰할 수 있는 프로시저의 유효성 검사 중요 한 그리고 유용한 도구를 대표 잠재적으로 질병을 예측에 대 한 진행 및 개발 대상 치료 전략.
여기, 우리는 그런 결함 BBB의 침투성에는 천재에 명확 하 게 감지할 수 있는 헌팅턴 질병의 전 임상 마우스 모델에서 발생 하는 신경 상태에서 BBB 누설을 평가 하기 위한 간단 하 고 효율적인 절차를 제시 질병입니다. 특히,는 높은 분자량 fluorescein isothiocyanate 표시 (FITC)-알 부 민, 장애인은 경우에 BBB를 교차 수 있는 마우스 경 정 맥 혈관 이나 parenchymal 지구에 그것의 배급에 심하게 융합은 다음 형광 현미경 검사 법에 의해 결정 됩니다.
뇌 실질에 녹색 형광 민의 축적 탈 BBB 침투성의 색인 기능 그리고 때 quantitated J 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 그린 형광 강도로 보고 됩니다.
Introduction
중앙 신경 조직 (CNS) 내의 항상성 적절 한 커뮤니케이션 및 신경 세포의 기능에 대 한 전제 조건입니다. CNS 실질은 단단히 봉쇄 주변에서는 내 피 혈액-뇌 장벽 (BBB), 주변 혈 류와 뇌 간의 인터페이스와이 두 지구1 사이 잡담에 중추적인 역할을 하 여 ,2. Bbb 등급은 복잡 하 고 동적 3 차원 구조는 주로 전문 마이크로-혈관 내 피 세포 (ECs) 세포 접합 단지-단단한 접속점 (TJs)-를 통해 서로 연결 하 고 pericytes에 의해 포위의 구성 신경 엔딩과 사이토 발 프로세스1,2.
생리 적인 조건 하에서 그대로 BBB의 매우 낮은 침투성 그리고 두뇌, 영양소와 다른 분자의 수송의 엄격한 규제를 보장 하 고 CNS에서 발생 하는 변화에서 독특한 보호를 제공 한다는 구성 및 가능성 주변에 대 한 신경 활동에 영향을 줄 수 있는 혈액의 모욕1,2,3.
그러나 BBB 무결성 및 그것의 향상 된 침투성의 많은 신경에 대 한 핵심 기능을 구성 하는 것 오랫동안 알려져 있다 및 신경 장애4 헌팅턴의 질병 (HD)5,6를 포함 하 여 이러한 장애 원인이 현상 여부 질병 과정에서 propagative 이벤트 아직 명확 하지 않습니다. 그러나 BBB 붕괴의 타이밍은 또한 애매 남아,, 우리의 그룹 및 다른 사람에 의해 증거 신흥 방해 BBB 무결성 늦은 이벤트를 질병의 진행, 하지만 오히려 초기 단계6에서,7 을 대표 하지 않는다 , 8, 장기 결과가 있을 수 있습니다.
이 염두에서에 두고, 그것은 성공적으로 대체 하 고 더 많은 타겟 개입의 수를 개발 하 고 질병의 진행 및 뇌 손상 예측에 유용한 전략을 개발 하기 위하여 조 neurodegeneration BBB 붕괴를 공개 하는 것이 중요 이러한 장애의 임상 결과 완화 BBB 장애의 신뢰할 수 있는 이미징, 그러므로, 실험 연구 및 뇌 질환의 임상 관리에 중요 한 중요성의 이다.
이 문서에서 우리는 높은 분자량 fluorescein isothiocyanate 표시-알 부 민 (FITC-알 부 민)을 사용 하 여 HD 마우스 모델에서 BBB 침투성의 평가 대 한 성공적이 고 간단한 절차를 설명 합니다. FITC-민, 일반적으로 뇌 실질에는 장벽을 교차 수 없습니다의 넘쳐 흐름 BBB 누설의 지표로 측정 되었다. 이 기술은 쉽게 적응할 수 있는 쥐 및 다른 병리학 조건 cerebrovasculature 장애9,10특징 이다.
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Protocol
IRCCS Neuromed 동물 관리 검토 위원회에 의해 그리고 동물에 대 한 모든 절차 승인 " Istituto 레 디 Sanità " (허가 번호: 1163/2015-홍보) EU 지시문 2010의 지침에 따라 했다 / 63/EU 동물 실험에 대 한.
1. 경 정 맥에 주입 FITC 민 솔루션의 준비
참고: 모든 실험 했다 매니페스트 (11 주 된) HD R6/2 마우스에 고 나이에 날 라와 일치 하는 성별 야생-타입 (WT) 제어 littermates.
- 디졸브 FITC-알 부 민 분말 (재료의 표 참조) 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 10 mg/ml에서.
참고: 최적의 결과 얻으려면이 준비 되어야 한다 신선한 각 라벨 반응.
2. 수술에 동안 사용 장비의 준비
- 이전 압력가 수술 도구 (재료의 표 참조) 때 려 눕.
- 알코올 (70% 에탄올 솔루션) 수술 벤치 청소. 외과 살 균 일회용 수건 드 레이프와 외과 영역 (45 x 45cm)를 준비 하 고 운영 stereomicroscope 설정.
3. 경 정 맥에 FITC 알 부 민 주입에 대 한 수술
- 마 취에 대 한 마우스 몸 무게 기록.
- 케 타 민 (100mg/kg)-xylazine (10 mg/kg) 솔루션의 적절 한 복용량의 복 주사 (i.p)와 Anesthetize 마우스. Walantus 외. 에서처럼 부드러운 발가락 핀치에 의해
- 모니터 동물 진정 반사를 철회 11 , 12.
- 보여지는 부정사 위치에 마 취 마우스를 놓고 접착 테이프로 수술 작업 대에 4 개의 다리와 꼬리를 수정.
- 마우스 확보 후 신중 하 게 면도 전기 면도기와 함께 목에 적절 한 수술 여백 (재료의 표 참조) 및 povidone-요오드 솔루션 및 70% 에탄올으로 소독.
- 면봉와 노출 된 면도 표면 건조.
- 부드럽게 면도 피부를 당겨 하 고 1.5 cm 긴 세로 절 개를, 메스는 midclavicular에 의해 흉부에 중간 시작 하 고 바로 목 아래에 확장 라인.
- 신중 하 게 외부 경 정 맥 노출 현미경 관찰 (5 배 확대)에서 집게와 떨어져 결합 조직 스트레칭.
- FITC 민 솔루션의 주입에 대 한 30½ G 바늘의 삽입을 촉진 하기 위하여 경 정 맥의 왼쪽 및 오른쪽에 충분 한 공간을 확인 하십시오.
- 동물에 정 맥 주입 (오른쪽 경 정 맥) 천천히 (3 분 이상) 100 µ L 10 mL/kg FITC 알 부 민으로 30½ G 바늘을 사용 하 여.
- 15 분 후, 잘린 여 마우스를 안락사, 급속 하 게 앞에서 설명한 13, 두개골에서 뇌를 제거 하 고 미리 냉장된 isopentane의 적어도 10 배 뇌 자체의 볼륨에서에서 15 분 담가.
- 미리 냉장된 관으로 뇌를 냉동 isopentane 이동한 조직학 단면까지-80 ° C 냉동 고에 저장.
4. 조직학 단면의 뇌 주입 FITC 민
- 포함 복합 최적의 절삭 온도 (10 월)에 뇌를 냉동 (재료의 표 참조) 이전 cryostat 단면에.
- 직렬는 cryostat와 20 µ m 두꺼운 부분, 뇌를 잘라 (재료의 표 참조), 현미경 유리 슬라이드에 탑재.
- 는 FITC-알 부 민/laminin 공동 얼룩 특정 사용 하 여 수행 안티 laminin 항 체 (재료의 표 참조)으로 설명한 6.
- 짧게, 밤에 주 항 체 안티 laminin (pAb 1:1000) 섹션을 품 어와 Cy3에 활용 된 적절 한 이차 항 체 진행.
- Coverslip 슬라이드 4를 포함 하는 설치 매체와 함께 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (흡수 피크 = 360 nm; 방출 피크 = 460 nm (재료의 표 참조).
- 슬라이드 어둠 속에서 4 ° C에서 건조 하룻밤 떠나.
- 형광 현미경으로 얼룩이 지기 형광 관찰 (재료의 표 참조) 두 FITC를 갖춘 20 배 확대에 (흡수 피크 = 495 nm; 방출 피크 = 525 nm) 및 Cy3 필터 (흡수 피크 = 550 nm; 방출 최대 = 570 nm).
- 샘플은 얼룩 직후, 매니큐어를 사용 하 여 모서리에 coverslip 보안을 보고 (4.3.3) 이상으로 현미경 검사.
5. 형광 현미경을 설정 하 고 컬러 이미지의 수집
- 형광 현미경을 다음과 같이 설정 합니다.
- 차례 형광 램프에 사용 하기 전에 약 10 분. 현미경, 연결 된 컴퓨터와 디지털 카메라를 켭니다. 이미지 분석 소프트웨어 실행 (재료의 표 참조).
- 최적의 신호 수집 및 공간 해상도 대 한 적절 한 목표를 사용 하 고 적절 한 필터를 선택 합니다.
- 수집의 컬러 이미지
- 이미지 분석 소프트웨어에 [라이브] 명령을 선택 (테이블의 자료를 참조) 각 필터에 대 한 최적의 조명 매개 변수를 설정 하 고.
- 단일 채널 컬러 이미지를 눈금 막대 추가 [고정] 명령을 선택 (' 편집 > 굽기 규모 ')
- 각 이미지에 저장 된 '.tiff ' 형식.
- 단일 이미지를 선택 하 여 채널 병합 ' 파일 > 병합 채널 '에서 그것을 저장 하 고는
- tiff ' 형식.
- 취득 4 24 비트 컬러의 최소 뇌 조각 (6 섹션 슬라이드 당) 당 (2200 µ m x 3400 µ m)을 사진.
6. FITC 민 넘쳐 흐름의 평가
- 자유롭게 사용할 수 ImageJ 14 , 15를 사용 하 여 각 채널에 대 한 형광 강도 분석.
- FITC-알 부 민 각 이미지 마다 총 CY3 Laminin 형광 강도 의해 총 형광 신호 강도 정상화 하 고 녹색 형광 강도로 혈관 밖에 서 extravasated 알 부 민을 보고.
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Representative Results
적절 한 주입 FITC 민의 BBB는 두뇌 parenchymawhen으로 혈 류에서 녹색 형광 추적 프로그램의 넘쳐 흐름에 경 정 맥 결과6손상. 생리 적인 조건 하에서 생긴된 형광 민의 뇌 혈관의 내부에 제한 된 이며 주변 혈관 주위 지역 및/또는 뇌 실질에 신호 감지 (그림 1A, 현미경에는 탑)입니다. 반대로, BBB 신경 병 적인 상황에서 손상 될 때 FITC 민 보여줍니다 확산 형광 패턴 혈관 주위 공간에 따라 뇌 실질 (그림 1A, 하단에 현미경)에. 공동 관 표시와 함께 얼룩, laminin, FITC 민 축적 (그림 1A) 사이트를 명확 하 게 지역화 하는 데 사용 됩니다. FITC-민 손상 된 BBB에 의해 방출 증가 녹색 형광 강도 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 평가 되었다 ( 재료의 표참조) 녹색 형광 강도로 보고 (N = 3, 0.3112 대 0.5765; * * *, p = 0.0004, 짝이 없는 T-검정) (그림 1B). FITC 알 부 민 농도 위에 보고 정규화 되었다.
그림 1: BBB 손상의 마커로 FITC 민 넘쳐 흐름. (A) 대표 형광 현미경에서 녹색 형광 성 민의 차등 분배를 보여주는 두뇌 cryosections의 두 생리 (맨 위)과 병 적인 조건 (아래). 붉은 얼룩 혈관 마커 laminin을 나타냅니다. 노출 시간: DAPI 20 ms, FITC 500 석사, 텍사스 레드 60 양 규모 바 = 100 µ m (병합 논문). (B)이이 그래프 표시 FITC-알 부 민, 녹색 형광 강도로 보고에 의해 방출 된 녹색 형광의 정량화 (단계 6.2 참조), 생리 (건강 한 BBB)에 병 적인 조건 (손상 된 BBB). N = 3. 데이터는 ± SD, 의미 표현 됩니다 * * * p = 0.0004 (짝이 없는 T-검정). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리는 여기에 설명 하는 기술 두뇌 질병 조건 하에서 BBB 누설을 탐지 하는 데 주로 유용 합니다. BBB 역 기능은 다양 한 신경학 적 장애4의 일반적인 기능으로 관심을 얻고 있다. 우리는 이전 HD6같은 희귀 신경 질환의 마우스 모델에서 BBB 무결성의 초기 혼란을 설명 하기 위해이 방법을 사용.
이 방법은 정확 하 고 신뢰할 수 있는 결과 제공 하는 절차의 효율성과 상대적 단순 활용 걸립니다. 그것은 매우 중요 한 전 임상 연구 도구를 나타냅니다 하 고 속도 직접 sectioned 뇌 조직 내에서 녹색 형광의 간단한 시각화 하 여 BBB 붕괴를 질적 평가에서 제공 하는 데 유용. 그러나, 분석 생화학 및 분자와 결합 하면, 기술은 성공적 혈관 내 피 TJs의 구조적 및 기능적 무결성에 대 한 정량적 인 정보를 제공 하 이며 BBB의 상관 관계의 분석을 허용 와 뇌 항상성 교란 한다입니다.
여기에 설명 된 프로토콜 고해상도 전자 현미경16, 등 다른 방법에 비해 저렴 하 고 시간 요구 절차에 발생할 수 있지만 그것은 열 대권 외의 BBB에 대 한 정보를 제공할 수 없는 17. 또한, 쉬운 응용 프로그램 및 재현성, 절차 신경 장애 전 임상 모델 특징 두뇌 맥 관 구조의 진보적인 장애를 모니터링 하는 데 유용 있을 수 있습니다.
형광-기반 접근 방식에 의해 BBB 장애 평가의 큰 힘 거짓말 공통 BBB 기능에 미묘한 변화의 역할을 조사 하는 잠재력과 희귀 신경 질환에 결국 직접 실시간으로 테스트의 효과 BBB에 영향을 미치는 약 또는 혈액 또는 뇌 실에서 적용 될 때 생 분자. 절차 아직 인 간에 게 번역 될 수 없습니다, 하지만 그것은 임상 연습에서 나중에 사용 될 새로운 뇌 추적기의 개발에 대 한 표시를 제공 가능성이 있다.
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Disclosures
저자는 공개 충돌의 관심을가지고
Acknowledgments
이 작품 "피코 Neuromed"에 의해 지원 되었고 건강 V.M. 게 "검색 전류"의 이탈리아 정부에 의해 자금
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health & Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
References
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신경 과학 문제 129 혈액-뇌 장벽 (BBB) BBB 침투성 FITC 알 부 민 neurodegeneration 정 맥 주입 마우스 모델Erratum
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
