Summary
פרוטוקול זה נועד לשחזר ולהתכונן התאים היעד נדיר מתערובת עם תאי המטרה ללא רקע אפיון גנטי מולקולרי ברמת תא בודד. איכות ה-DNA שווה לתאים בודדים שאינם מטופלים ומאפשר יישום תא בודד (הקרנת שני מבוסס, ממוקד ניתוח).
Abstract
התאים היעד נדירים ניתן לבודד מרקע גבוהה של תאים שאינם-יעד באמצעות נוגדנים ספציפיים חלבונים פני השטח של תאי היעד. שיטה שפותחה לאחרונה משתמשת חוט רפואי functionalized עם תאים אפיתל אנטי אדהזיה מולקולה (EpCAM) נוגדנים ויוו בידוד של מחזורי גידול תאים (CTCs)1. עמית מתאימים חולה בסרטן הערמונית ללא גרורות הראה כי הטכניקה בידוד ויוו , גרמו אחוז גבוה יותר של חולים חיובית CTCs, כמו גם ספירת CTC גבוה יותר לעומת תקן הזהב הנוכחי ב CTC ספירה. כמו תאים לא ניתן לשחזר ממכשירים רפואיים הנוכחי, חוט functionalized חדש (המכונה התקן) יוצר ומאפשר לכידת ולהתנתקות עוקבות של תאים על ידי טיפול אנזימטי. תאים רשאים לצרף המכשיר, דמיינו על המיקרוסקופ, מנותק באמצעות טיפול אנזימטי. תאים התאושש cytocentrifuged על גבי שקופיות מצופה קרום, שנקטפו בנפרד באמצעות לייזר microdissection או חוץ-גופית. דוגמאות תא בודד אז ותוחלת הגברה הגנום כולו בתא יחיד המאפשר ניתוח במורד הזרם מרובים כולל גישות הקרנת במטרה. ההליך של בידוד ושחזור התשואות באיכות גבוהה ה-DNA של תאים בודדים, אינו פוגע הגברה הגנום כולו עוקבות (WGA). ה-DNA של תא בודד מוגבר ניתן להעביר אותה ההקרנה ו/או ממוקד ניתוח כמו הכלאה הגנום השוואתי מערך (מערך-CGH) או רצף. המכשיר מאפשר שמחוץ בידוד מדגימות תא נדיר מלאכותיים (כלומר 500 התאים היעד קפץ לתוך 5 מ של דם היקפיים). ואילו שיעורי ניתוק של תאים הם מקובלים (50-90%), קצב התאוששות התאים מנותקים על גבי שקופיות משתרע על פני התלויים על הקו תא בשימוש מגוון רחב (< 10 - > 50%) צריך קצת תשומת לב נוספת. התקן זה אינה נמחקת לשימוש בחולים.
Introduction
לאחרונה, נוספו CellCollector DC01, חוט רפואי functionalized עם נוגדנים anti-EpCAM לבידוד CTCs מדם היקפי של חולי סרטן, הספקטרום שיטתי של CTC ספירה1,2,3 . במחקר כרגע מתמשך ללא גרורות סרטן הערמונית, החוט functionalized הזה מדווח כמעט כפליים למטופלים. להיות CTC-חיוביות וסופרת CTC גבוה יותר בחולים CTC-חיוביות לעומת CellSearch, תקן הזהב ב ספירת CTC3 . במופע זה מעודד, בידוד של תאים מן חוט רפואי functionalized לניתוח תא בודד יהיה רצוי, אלא טיפול אנזימטי עם פתרונות ניתוק התא (למשל טריפסין) ולא לייזר microdissection לא מאפשר ההתאוששות של תאים שלמים (נתונים לא מוצג).
כדי לאפשר התנתקות של התאים שנתפסו, דור חדש של חוטים functionalized היה מצויד פולימר ספציפיים. זה פולימר, המקשר בין הנוגדנים לכידת לכבל, היא חשופה טיפול מאגר שחרור המאפשר ניתוק של תאים שלמים (CellCollector DC03 המכונה התקן). המכשיר החדש functionalized, מאפשר בידוד תאי היעד של ריכוזים שונים של תאים סרטניים קו תא קפץ לתוך אלבומין שור (BSA) / buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ודם היקפי, בהתאמה.
על מנת להקל על זיהוי חזותי של תאים על המכשיר, לאחר התאוששות התאים הסרטניים היעד מלווים בלוחיות אסתר succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE), כתם DNA לפני הטיפול בגמילה (כלומר-טעינה וניתוק). הטיפול השפעות על איכות ה-DNA של תאים בודדים בעבר הוערכו לאחר WGA באמצעות בקרת איכות PCR4,5,6,מערך-CGH7 , ממוקד רצף7 מציג שום הבדל לעומת תאים שאינם מטופלים micromanipulated תא המתלים7. היתרון של שיטה זו נעוץ השילוב של העשרה קדם תא היעד נדיר ושחזור של תאים לניתוח במורד הזרם תא בודד (איור 1). מתויג CE ויוו אוסף התקן הנוכחי משמשת בדרך כלל עבור ספירה של CTCs ולא על אפיון מולקולרי בתא יחיד2,8. עם זאת, ניתוח מקיף יותר לחקור הטרוגניות בין CTCs זמן לניתוח ברמה תא בודד (כלומר ממוקד רצף ברמת תא בודד). שיטות אחרות מבוססת תא מבוססים על בידוד immunomagnetic של CTCs EpCAM-חיובית וטיפול תא בודד בהתבסס על dielectrophoresis לאחר מכן ניתוח גנטי מולקולרי9,10. אפיון מולקולרי של CTCs דרישה חשוב ליישום שימושי שלהם בסביבה קלינית והוא לא פחות חשוב במחקר בסיסי של המפל גרורתי. במקביל CTCs, הגידול במחזור ה-DNA (ctDNA) הפך חשיבות רבה, שכן היא מאפשרת ניתוח הדנ א את נטל הגידול עם בידוד טכנית מינימלית הליכים11,12. הגישות תא מבוסס עשוי לשרת כתרומה משלימים שכן היא מאפשרת רנ א13,14 , חלבון15 ביטוי ניתוח, גם עבור CTC נגזר תא תרבויות או xenografts16, 17. למרות מכשולים כגון שחזור תא נמוך, אישור לשימוש בחולים עדיין צריך להתגבר, בשיטת תפוס ושחרר לוקח צעד הבא חשוב לקראת אפיון של התאים היעד נדיר.
Protocol
כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית של גראץ (25-240 ex 12/13). דם היקפיים עבור spiking ניסויים. בדקנו אנשים בריאים
הערה: פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של HT-29 תאים (האדם הגס סרטן תאים בטור) PBS או תערובות מלאכותי של HT-29 תאים דם היקפיים. אותו ניסוי בוצעה עם שתי שורות תאים נוספים (LNCaP ו- VCaP, נתוני הניסוי בתוצאות נציג), באופן תיאורטי ניתן לבצע כל התאים לבטא EpCAM.
1. הכנת התאים היעד
- תרבית תאים וסימון של תאים
הערה: ב פרוטוקול זה, תאים מתורבתים ב cm ² 75 תרבות מבחנות. בבקשה להתאים את הכמויות של ריאגנטים בהתאם אם התקנים אחרים של התרבות תאים משמשים (למשל 25 cm ² תרבות מנות, ובכן 6 צלחות וכו '). כל הנוזלים המשמש הן חימם מראש עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים. אם לא צוין אחרת, כל הצעדים פרוטוקול מבוצעות בטמפרטורת החדר (RT).- התרבות התאים HT-29 5a שונה של מקוי בינוני בתוספת 2 מ מגלוטמין, 20 מ מ Hepes, 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין ב 37 מעלות צלזיוס באווירה2 CO 5%.
- כאשר תאים 90% confluent, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS 1 x.
- הקציר תאים, להוסיף 2 מ"ל של הפתרון ניתוק התא (טבלה של חומרים, ריאגנטים) התאים, דגירה את התאים עבור 5 דקות ב 37 º C.
הערה: הפתרון הניתוק כוללת הפרוטאוליטי ואנזימים collagenolytic 1-PBS, חומצה ethylenediaminetetraacetic 0.5 מ מ (EDTA), ו- 3 מ"ג/ליטר פנול אדום. להפחית את זמן התחממות כדור הארץ מראש של הפתרון ניתוק התא למינימום כמו זה יהיה לא פעיל לאחר 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס. מכסים את השכבה התא כולו כדי לקבל ניתוק התא אופטימלית. - בדוק בניתוק של תאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה.
- להעביר תאים מנותקת כל שפופרת 50 מ ל שמולאו מראש עם 10 מ"ל של מדיום התרבות תאים (כמו בשימוש בשלב 1.1.1.), resuspend את התאים על ידי pipetting.
- במקום התליה תא הנותרים על מערבל רולר אופקי ב RT והמשך לשלב labelling.
- חיים תא labelling תאי היעד
- שתדללו 1 µL של 5 מ מ CFSE (מסופק דימתיל סולפוקסיד, דימתיל סולפוקסיד) ב 1 מ"ל של PBS 1 x חימם מראש ב 37 ° C כדי להשיג 5 מיקרומטר מוכן לשימוש CFSE labelling הפתרון.
הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, מוכתמים, להשתמש בפתרונות המוכנים באופן טרי. - הכן מוכן לשימוש DNA מכתימים פתרון (טבלה של חומרים, ריאגנטים) ב 1 x PBS ואחסן אותו ב- 2-6 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.
הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, מוכתמים, להשתמש בפתרונות המוכנים באופן טרי. - לקבל התאים של מיקסר רולר אופקי (שלב 1.1.6.) ואת צניפה שהתאים ב x 300 גרם במשך 10 דקות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend התאים 10 מ"ל של PBS 1 x.
- לשטוף את התאים שוב עם PBS 1 x, resuspend בגדר תא 500 µL מוכן לשימוש CFSE labelling בפתרון.
- דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאסוף את התאים לאחר צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות.
- Resuspend התאים שכותרתה 1 מ"ל של מדיום התרבות תאים טרום ומחוממת ולאפשר את התאים להתחדש ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 3 דקות, resuspend כדורי תא ב 1 מ"ל של ה-DNA מוכן לשימוש מכתים פתרון ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- גלולה התאים, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תאי 4 מ ל 1 x PBS. להעריך את צפיפות התאים באמצעות hemocytometer וסמנו עבור קרינה פלואורסצנטית labelling באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצוידים עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) fluorescein isothiocyanate (FITC) מסננים (2A ו- 2E).
- Centrifuge התאים ב x 300 גרם במשך 3 דקות, resuspend בגדר תא על-פי הצפיפויות תא לצורך הניסוי המתאימים כפי שהוצגה בסעיף הבא ובמקום על קרח.
- שתדללו 1 µL של 5 מ מ CFSE (מסופק דימתיל סולפוקסיד, דימתיל סולפוקסיד) ב 1 מ"ל של PBS 1 x חימם מראש ב 37 ° C כדי להשיג 5 מיקרומטר מוכן לשימוש CFSE labelling הפתרון.
2. לחייב את החוט
הערה: תאים ניתן לבודד מן המטרה spikings של דם תא/ציוד היקפי את המשקל מיליליטר או על-ידי מתן מספר נמוך של תאים בקנה מידה microliter. בעוד הגישה מאפשרת מחקה מצב נדיר-cell בדם ההיקפי, האחרון עשוי להיות הדרך הטובה ביותר לצרף כמה תאים לצורך פרוטוקול אופטימיזציה/בדיקה.
- לחייב את החוט באמצעות כמויות גדולות של המתלים תא
- הכן של BSA 2% חסימת פתרון על ידי המסת 0.8 g של BSA ב- 40 מ ל 1 x PBS (תא תרבות שימוש). להמיס BSA vortexing הראשונית, דגירה עוקבות ב RT על מערבל רולר אופקי למשך 10-20 דקות.
- שטיפה ריק EDTA צינורות/נתרן הפארין צינורות עם 2 מ של 2% BSA כדי להסיר שאריות קרישה ולמחוק את הפתרון. לחסום את פני השטח של הצינור על ידי דגירה-RT 5 מ של BSA 2% על מערבל רולר אופקי ב 15 rpm למשך 30 דקות וזורקים את הפתרון.
- לדלל תאים עם תוויות ברורות (סעיף 1.2.) צפיפות של תאים למ"ל 100 000 ולהשתמש מ ל לחייב את החוט.
- הוסף 5 מ של המתלה תאים עם תוויות ברורות (500 000 תאים סה כ) ברכבת התחתית. להימנע בועות בעת הוספת התליה תא.
- להסיר את החוט של תא האחסון, כמו גם את כובע גומי מחזיק את החוט, לשטוף אותה עם 1 x PBS (איור 3).
- לחדור את הכובע צינור גומי של הצינור EDTA (שלב 2.1.4.) בעזרת מחט מזרק (20 גרם) והכנס את החוט כך החלק פונקציונלי הוא שקוע לחלוטין ההשעיה תא הכובע בחזרה על הצינור, הצינור ממוקם על המיקסר רולר מוטה.
הערה: החלק פונקציונלי טריפל-הסליל של החוט שאמור להיות מכוסה עם תא ההשעיה ברחבי ההטענה. - לסובב את הצינורות על מערבל רולר מוטה ב- rpm 5 למשך 30 דקות לאפשר את התאים לחבר הכבל.
- לשטוף את החוט עם 5 מ ל 1 x PBS ואחסן אותו במקום חשוך ב 2-6 מעלות צלזיוס צינור 15 מ"ל המכיל 1 x PBS עד בדיקה חזותית.
הערה: החלק פונקציונלי של החוט חייב תמיד להיות שקוע בתוך PBS כדי למנוע פגיעה בתאים.
- בידוד התאים היעד של תערובות מלאכותיים עם דם היקפיים (חלופה טעינה שיטה: 2.1. לחייב את החוט באמצעות כמויות גדולות של המתלים תא)
- לדלל תאים עם תוויות ברורות (סעיף 1.2.) כדי להשיג תא המתלים עם צפיפות גבוהה תא (> תאים 1 000 000/mL), ובכך לשמור על הנפח של תא ההשעיה הוסיף את הדם ההיקפיים נמוכה.
- להוסיף 500 כדי 500 000 תאים 5 מ של דם היקפיים ומערבבים אותם על-ידי היפוך ברכבת התחתית.
- להסיר את החוט של תא האחסון, הסירי את הפקק גומי מחזיק את החוט, לשטוף אותה עם 1 x PBS.
- לחדור כובע צינור חדש עם חלק פונקציונלי של המכשיר באמצעות מחט מזרק (20 גרם) כך החלק פונקציונלי הוא שקוע לחלוטין בדם מחודדים הכובע בחזרה על הצינור, הצינור ממוקם על המיקסר רולר מוטה.
הערה: החלק פונקציונלי טריפל-הסליל של החוט שאמור להיות מכוסה עם תא ההשעיה ברחבי ההטענה. - דגירה הצינור על המיקסר רולר מוטה ב- 5 rpm למשך 30 דקות ב- RT.
- לשטוף את החוט 3 פעמים ב- PBS 1 x ואחסן אותו בחושך בשפופרת 15 מ"ל המכיל 1 x PBS עד בדיקה חזותית.
הערה: החלק פונקציונלי של החוט חייב תמיד מתחת לפני המים כדי למנוע פגיעה בתאים.
- לחייב את החוט של המתלים תא בנפח נמוך (חלופה טעינה שיטה: 2.1. לחייב את החוט באמצעות כמויות גדולות של המתלים תא)
- Resuspend של התאים עם תוויות ברורות על 1 000 000 תאים למ"ל ב- 1 x PBS.
- לתקן את כוס חד פעמית 150 מ מ פסטר פיפטה אופקית על מדף.
- להסיר את החוט תא אחסון אך לשמור את הכובע הצהוב גומי מחזיק את החוט.
- מקם את החוט פיפטה כך החלק functionalized הינו ממוקם בקצה פיפטה פסטר לא נוגע הזכוכית.
הערה: קצה החוט לא להישאר מחוץ הטיפ פיפטה פסטר. הימנע חיבור על חלקו האחורי של קצה פיפטה פסטר עם הכיפה גומי מחזיק את החוט. אם מצורפים חזק, המתלים תא אין אפשרות לטעון מהצד השני לתוך קצה פיפטה. - לטעון µL 15 של התליה תא לתוך קצה פיפטה פסטר המכסה את החלק functionalized של הכבל.
- דגירה החוט במשך 10 דקות ברבע סיבוב ידני קצה חוט שהורכב/פסטר פיפטה כל דקה.
- להסיר את החוט בקצה פיפטה פסטר, לשטוף אותה עם 5 מ של 1 x PBS ואחסן אותו במקום חשוך ב 2-6 מעלות צלזיוס צינור 15 מ"ל המכיל 1 x PBS עד בדיקה חזותית.
הערה: החלק פונקציונלי חייב תמיד להיות שקוע בתוך 1 x PBS כדי למנוע פגיעה בתאים.
3. ספירת התאים על החבל
הערה: תמיד לשמור את החלק פונקציונלי של החוט שקועים PBS 1 x כדי למנוע פגיעה בתאים.
- להשתמש בעט גריז כדי לצייר על שטח מלבן על משטח זכוכית ולהוסיף 500 µL ל- 1 x PBS.
- לכופף את החלק פונקציונלי של החוט ומניחים אותו על השקופית זכוכית כך החלק פונקציונלי הוא שקוע 1 x PBS.
הערה: מתאים נפח של 1 x PBS לכסות לחלוטין את החלק פונקציונלי של הכבל והסביבה של המלבן. השתמש קלטת דבק דו-פרצופי כדי לטעון את החלק פונקציונלי של החוט בשקופית. - לבדוק חזותית צידי הכבל כדי למנות את התאים שנתפסו (איור 2B ו- 2F).
הערה: הנוכחות של תאים נקבעת באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד מסננים עבור דאפי, FITC. שני הצדדים של החוט יכול להיבדק, מספר התאים או שקובעת (מספרי הטלפון הנייד גבוהה) או ספרתי (רק ריאלי אם המספרים הנמוכים של תאים מחוברים החוט). שלב זה יכול יבוצע אם ספירת תאים אינה נחוצה. - לאחר הסריקה, מניחים את החוט בחזרה לתוך הצינור 15 מ"ל המכיל את PBS 1 x (ראה הערה של 2.3.6. מדור 3.), לאחסן אותו החוט בחושך.
הערה: רוב החלק פונקציונלי של הכבל ניתן לחתוך (כולל העיקול) והוציאו אחסון הפגה.
4. התנתקות והשחזור של התאים היעד
הערה: ניתוק של התאים ייעשה תוך 4 שעות לאחר בידוד.
- להמיס 4 מ ג של הרכיב מאגר שחרור (טבלה של חומרים, ריאגנטים) לכל מיליליטר 1 x PBS ולסנן את הפתרון דרך מסנן סטרילי 0.2 µm להשיג המאגר מוכן לשימוש.
הערה: הפולימר של החוט מורכב של הידרוג אשר הוא functionalized עם נוגדנים anti-EpCAM המאפשר מחייב הצגת EpCAM היעד תאים. המאגר שחרור מכיל אנזים הפרוטאוליטי חמצן פחמן מסוגל בבועיות את הידרוג. פצילות הפרוטאוליטי התוצאה השפלה של הפולימר, לפיכך, ניתוק התאים שנתפסו. - לחמם המאגר שחרור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- הוסף 1.6 מ של שחרור מאגר למלא צינור התגובה 1.5 mL.
הערה: צינורות תוכנן עבור אמצעי אחסון התגובה 1.5 mL מאפשרים יישום של mL 1.6 אשר יש צורך השוקע החלק פונקציונלי של הכבל. - דגירה החלק פונקציונלי של החוט במאגר שחרור ב 37 מעלות צלזיוס (אמבט מים) מינימלית 20 להשתמש הכיפה גומי שנשלחו עם החוט במקום הצינורית כדי לתקן את הכבל בצינור 1.5 mL כדי למנוע זיהום במהלך הדגירה באמבט מים.
- להעביר את מכלול תיל/צינור מטרף-RT, 500 סל ד למשך 15 דקות.
הערה: ניעור יש מסלול של 1.5 מ מ. - הנח את מכלול תיל/צינור ומפרידה ולסובב את זה ב x 300 גרם במשך 10 דקות.
- להסיר את החוט ברכבת התחתית, סגור את הכובע, centrifuge את הצינור שוב ב x 300 גרם במשך 10 דקות.
הערה: הכבל יכול להיות מאוחסן PBS 1 x-2-6 מעלות צלזיוס בחושך לספירת תאים כדי להעריך את יעילות ניתוק או בדוק בתאי שנותרה על החבל. - כדי להקטין את הנפח של התליה תא, להסיר כל פרט µL 100 (חוץ-גופית) או לחלופין 300 µL (cytocentrifugation ו- microdissection לייזר עוקבות) של תגובת שיקוע והמשך מיד הדגימה תא בודד.
5. החד-תאיים דגימה
- חוץ-גופית
הערה: תאים בודדים יתווספו 2 µL של התא פירוק מיקס מאסטר ומאפשר WGA. להכין את תערובת הבסיס לפי מספר התאים להיות מעובד, לחשב כמויות נוספות עבור אובדן עקב pipetting ומקום תא פירוק בסיס תערובת על קרח.- הכן תא פירוק מאסטר המיקס (מרכיבי ערכת WGA, טבלה של חומרים, ריאגנטים) לפי הפרוטוקול שתואר על ידי Czyż et al18. בקצרה, לערבב µL 2.0 של מאגר התגובה, µL 1.3 של octylphenoxypolyethoxyethanol (10% הפתרון), µL 1.3 של 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl-פוליאתילן גליקול (10% הפתרון), 2.6 µL של פתרון proteinase K ו- 12.8 µL RNase/DNase ללא מים כדי להשיג מיקס מאסטר עבור 10 דגימות (הנפח הכולל 20 µL).
הערה: לקבלת דוגמאות נוספות, להגדיל את אמצעי האחסון בהתאם. ההרכב של מיקס מאסטר של פירוק תא שונה שימוש בהליך חלופי ניצול דגימות microdissection לייזר (ראה 5.2.). - השתמש עט גריז כדי לצייר על שטח מחזיק התליה תא במקומה. התאמת השטח והנפח אם התא צפיפות גבוהה מדי (כלומר. לסמן שטח גדול יותר על השקופית זכוכית, עומס 1-PBS ושל aliquot של התליה תא).
- Pipette את המתלים כל התא ויטראז'ים (מתקבל בשלב 4.8). על גבי השקופית זכוכית.
- להעביר את השקופית זכוכית מיקרוסקופ מצויד עם micromanipulator. תן את התאים להתפשר על 5 דקות(איור 2D ו- 2 H).
- להכין 0.2 מ"ל המבחנות טעון עם µL 2.0 של מאסטר פירוק התא לערבב (ראה שלב 5.1.1.) ואחסן אותו בקרח.
- איסוף תאים בודדים ב- µL 1 ל- PBS 1 x באמצעות micromanipulator ולהעביר את התאים לתוך צינור המכיל מיקס מאסטר פירוק התא.
הערה: לצורך העברת תאים micromanipulated למאגר פירוק התא למקם את נימי ישירות µL 2 של פירוק פתרון, הוצא עד בועות ניתן לראות. - בקצרה תוצאה לדגימה ב x 2000 g 3 s באמצעות microfuge של שולחן העבודה כדי לאסוף את כל נוזל בחלק התחתון של הצינור. מניחים את הדוגמאות על קרח.
- המשך ישירות אל תא בודד WGA (ראה סעיף 6. ו. Czyż et al. 19).
- הכן תא פירוק מאסטר המיקס (מרכיבי ערכת WGA, טבלה של חומרים, ריאגנטים) לפי הפרוטוקול שתואר על ידי Czyż et al18. בקצרה, לערבב µL 2.0 של מאגר התגובה, µL 1.3 של octylphenoxypolyethoxyethanol (10% הפתרון), µL 1.3 של 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl-פוליאתילן גליקול (10% הפתרון), 2.6 µL של פתרון proteinase K ו- 12.8 µL RNase/DNase ללא מים כדי להשיג מיקס מאסטר עבור 10 דגימות (הנפח הכולל 20 µL).
- לייזר microdissection (שיטת הדגימה תא בודד חלופי: 5.1. חוץ-גופית)
הערה: ההרכב של המיקס מאסטר להשתמש בסעיף זה שונה זו ששימשה בסעיף 5.1 המיקרומניפולציה. תאים בודדים יתווספו 4.5 µL של התא פירוק מיקס מאסטר (מרכיבי ערכת WGA, טבלה של חומרים, ריאגנטים) של WGA.- להכין מיקס מאסטר פירוק תא לפי Czyż. ואח 19 על ידי ערבוב µL 5.0 של מאגר התגובה, µL 1.3 של octylphenoxypolyethoxyethanol (10% הפתרון), µL 1.3 של 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl-פוליאתילן גליקול (10% הפתרון), ו, µL 2.6 של פתרון proteinase K, µL 34.8 של RNase / ללא DNase מים כדי לקבל תערובת הבסיס עבור 10 דגימות (הנפח הכולל 45 µL). מניחים את תערובת הבסיס על קרח.
הערה: לקבלת דוגמאות נוספות, להגדיל את אמצעי האחסון בהתאם. - UV-פינוק מצופה קרום שקופיות מתאים לייזר microdissection. לכן, למקם את השקופיות בדנ א צלב מקשר התקן, לחשוף בפני UV הגבוה בערך 10 דקות.
- להרכיב את השקופית מצופה קרום cytocentrifuge ו cytospin התליה התא כולו ב 300 x גרם במשך 5 דקות.
הערה: בעת שימוש מערכת בנוזל, איפה התאים cytocentrifuged אותן לשקופית בתמיסה, להסיר את תגובת שיקוע לאחר cytocentrifugation ולהחיל על יבש-ספין-x 1140 g עבור 1 דקות. - ישירות להמשיך לייזר microdissection או לתת את cytospins מילה נהדרת לילה ומקפיאים את הדגימות ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
- פיפטה 4.5 µL של מיקס מאסטר פירוק התא לתוך הכיפה של שפופרת PCR 0.2 מ"ל, קציר תאים בודדים באמצעות לייזר microdissection.
- לאחזר את הצינור PCR המיקרוסקופ microdissection לייזר וסגור את הצינור. לאסוף את כל נוזל בחלק התחתון של הצינור על ידי קצר-ספין ולמקם את הדגימה על קרח.
- להמשיך עם WGA תא בודד או לאחסן את הדגימות מבודדים ב-80 מעלות צלזיוס במשך עד חודש לפני עיבוד נוסף.
- להכין מיקס מאסטר פירוק תא לפי Czyż. ואח 19 על ידי ערבוב µL 5.0 של מאגר התגובה, µL 1.3 של octylphenoxypolyethoxyethanol (10% הפתרון), µL 1.3 של 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl-פוליאתילן גליקול (10% הפתרון), ו, µL 2.6 של פתרון proteinase K, µL 34.8 של RNase / ללא DNase מים כדי לקבל תערובת הבסיס עבור 10 דגימות (הנפח הכולל 45 µL). מניחים את תערובת הבסיס על קרח.
6. מתאם-מקשר מבוסס גנום שלם הגברה 18,19
הערה: ודא כי כל תערובות בסיס הכרחי (מרכיבי ערכת WGA, טבלה של חומרים, ריאגנטים) מוכן ומאוחסנים על הקרח מוכן לשימוש. Mixes מאסטר כוללים את התמהיל עיכול דנ א 1 עבור micromanipulated (ראה 5.1.) דגימות (המכילה µL 2.0 התגובה המאגר, µL 2.0 של Mseאני אנזים הגבלה, µL 16.0 RNase/DNase ללא מים) או עיכול DNA לערבב 2 עבור microdissection לייזר (ראה 5.2). דוגמאות (המכילה 2.5 µL של Mseאני אנזים הגבלה ו- 2.5 µL RNase/DNase ללא מים), מחזק מראש מיקס מאסטר (מכיל µL 5.0 התגובה המאגר, µL 5.0 של כל אחד מהמתאמים PCR preannealing ו- µL 15.0 RNase/DNase ללא מים), מצדו מיקס מאסטר (מכיל 30.0 µL של מתאמי ה-PCR מראש annealed, 10.0 µL אדנוזין טריפוספט פתרון, והפתרון 10.0 µL T4 ליגאז) ו- PCR הראשי לערבב (המכיל 30.0 µL של מאגר ה-PCR, µL 20.0 של 10 מ מ deoxynucleotide לערבב פתרון, µL 10.0 של פולימראז מיקס, µL 340.0 RNase/DNase ללא מים). כל הספרים ניתנים עבור הכנת דוגמאות 10. משתנות בהתאם למספר של דגימות.
- עבור פירוק התא, למקם את הדגימות microdissection micromanipulated/לייזר הצנטרפוגה תרמי ומופעל תא בודד פירוק על ידי המקננת התא ב 42 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות, 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ו- 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
הערה: השתמש הצנטרפוגה תרמי עם מכסה מחוממת. פירוק התא יכול להיעשות O/N עבור h 10-15. במקרה כזה, להשמיט את שלב הדגירה ב 65 º C. - להפעיל מראש מחזק המתאמים PCR. לכן, דגירה המיקס מאסטר מראש מחזק ב הצנטרפוגה תרמי ב 65 ° C עבור 1 דקות ואחריו עוד יותר מחזורי 49, 1 דקות כל אחד, עם הטמפרטורה יורדת בהדרגה על ידי 1 ° C/מחזור. לאחר מחזורים 50 (ב 15 מעלות צלזיוס), דגירה המיקס מאסטר-15 ° C עד שימוש נוסף.
הערה: השלב זה נחוץ ליצירת מתאים מצדו אסימטרי מתאמי (ראה שלב 6.6.) עם ה-DNA בתא יחיד נתון Mseאני הגבלת תקציר. - לאחר פירוק התא, ספין למטה הדגימות lysed ב 2000 x g 3 s כדי לאסוף את כל נוזל בחלק התחתון ומניחים אותו על קרח.
- קטע דנ א, להוסיף 2 µL של המיקס עיכול DNA 1 כדי כל מדגם lysed micromanipulated או 0.5 µL של עיכול DNA לערבב 2 לדגימת microdissection לייזר ולהפעיל הגבלת תקציר. השתמש הצנטרפוגה תרמי עם מכסה מחוממת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחריו צעד איון אנזים הגבלה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
הערה: עיכול ב 37 מעלות צלזיוס יורחב כדי 3 שעות. . זה הצעד היחיד פרוטוקול שונות בין דגימות המתקבל המיקרומניפולציה ודוגמאות המתקבל microdissection לייזר - ספין למטה הדוגמאות כדי לאסוף את כל נוזל בחלק התחתון ומניחים אותו על קרח.
- עבור נבדק הגבלת מתעכל DNA ו מתאמים מראש annealed, להוסיף µL 5.0 של המאסטר מצדו לערבב כל מדגם ה-DNA מעוכל, מאתרים ומפסיקים את זה ב הצנטרפוגה תרמי-15 מעלות לשעה.
הערה: שלב זה ניתן להרחיב 12 שעות או שבוצעה O/ש - ספין למטה הדוגמאות כדי לאסוף את כל נוזל בחלק התחתון ומניחים אותו על קרח.
- WGA להוסיף 40.0 µL של ראשי PCR מיקס מאסטר לכל אחד מהמוצרים מצדו לרוץ WGA הצנטרפוגה תרמי עם מכסה מחוממת כמו כדלקמן: הראשונה, דגירה בדגימות ב 68 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. שנית, מחזור 15 פעמים ב 94 ° C 40 s, 57 ° C ל 30 s ו- 68 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה 30 s +1 s/מחזור.... לאחר מכן להוסיף 9 מחזורים ב 94 ° C 40 s, 57 ° C + 1 ° C/מחזור 30 s, 68 ° C s 1 דקות 45 s +1/מחזור. לאחר מכן, מחזור 23 פעמים ב 94 ° C 40 s, 65 ° C ל 30 s, 68 ° C s 1 דקות 53 s +1/מחזור. לבסוף לבצע סיומת הסופי ב 68 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות 40 s, להרגיע את הדוגמאות כדי 4 ° C.
- ספין למטה הדוגמאות כדי לאסוף את כל נוזל בחלק התחתון, בדוק את איכות ה-DNA או לאחסן את הדגימות ב-20 ° C או-80 מעלות לאחסון לטווח ארוך.
7. בקרת איכות של מוצרים WGA
הערה: לבדוק את איכות המוצרים WGA בהתבסס על הטווח של השמצות הדנ א ואת המספר של מוצרי הגברה לאחר הפעלת ה-QC-PCR 4plex 5. הפעל WGA aliquots ודוגמאות המתאימים QC-PCR על ג'ל agarose 1.0% להערכה.
- הכן 100 מיקרומטר פתרונות מניות של כל צבעי בסיס המשמש לבקרת איכות 4plex PCR (טבלה 1). הוסף 8 µL של כל פריימר µL 136.0 של PCR-כיתה מים כדי ליצור µL 200 של הבריכה פריימר. מערבולת הפתרון עבור 3 s, לסובב אותו למטה ב x 2000 g עבור 3 s ו- aliquot 20 µL עבור אחסון ב-20 ° C.
- שימוש רגיל PCR ערכות להכין תבנית בסיס PCR מולטיפלקס מערבבים המכיל µL 6.0 של רכיבים x PCR 2 (למעט תחל), 4.5 µL של מים PCR-כיתה ו 0.5 µL של הבריכה פריימר.
- להוסיף µL 1.0 של המוצרים WGA, לסובב אותו למטה ומנוהל PCR ב 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחריו 35 מחזורי דנטורציה ב 94 ° C עבור 1 דקות, פריימר חישול-56 ° C 1 דקות, הארכת תחל ב-72 מעלות עבור s 1 דקות 30 ו צעד סיומת הסופי ב-72 מעלות במשך 7 דקות תרגעו עד 4 ° C, לסובב אותו למטה ולמקם את הדוגמאות על הקרח לניתוח ג'ל באותו היום או ב-20 ° C לניתוח בשלב מאוחר יותר.
הערה: מצמרר הצנטרפוגה תרמית ניתן לבצע ב 12 ° C כדי להגדיל את תוחלת החיים של אלמנטים Peltier. - לנתח את WGA מוצרים (המתקבל 6.8.) ומוצרים QC-PCR 4plex בהתאמה ג'ל agarose5.
Representative Results
תאים לאחר CFSE מכתים nucleic שניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence מצויד מסננים עבור דאפי, FITC. הגרעינים להציג counterstain בהיר בערוץ דאפי ואילו הציטופלסמה מהתאים הצג תוויות אחיד עם CFSE בעוצמה הבין-תאית הטרוגנית (איור 2 א ו 2E). צורה דומה, צביעת עוצמות צפוי מתאי מחובר הכבל (איור 2B ו- 2F) כמו גם מנותק מן החוט, התאושש בשקופית (איור 2D ו- 2 H).
צפיפות גבוהה התא (למשל > תאים 1 000 000/mL) עלול לגרום לסיקור של הכבל עם תאים כאשר הטעינה את החוטים. עם זאת, להוריד את צפיפויות תא, שינויים במהירות סיבוב במהלך הדגירה, ושימוש של שורות תאים שונים משפיעים על יעילות הבידוד, צריך להיבדק בנפרד. מתי החוטים היו מודגרות 5 מ של תאים HT-29-100 000 תאים / מ ל כפי שמתואר בסעיף 2.1., ממוצע של תאים ± 103 254 (n = 5) נתפסו על החוטים. עם אותם ניסויים באמצעות תאים LNCaP, ממוצע של תאים ± 319 440 (n = 5) לכל חוט הושג.
הצגת תאים HT-29 500 5 000, לא 50000 רקע של 5 מ"ל של דם היקפיים חוטים (על פי פרוטוקול סעיף 2.2.), גרמו לכידתו של תאים ± 18 75, 25 ± 9 תאים ותאים ± 57 47 (n = 3, כל אחד), בהתאמה. אם הכבל מואשם µL 15 תא השעיה (תאים 1 000 000/mL) לפי הפרוטוקול בסעיף 2.3., עד 1 000 (HT-29) תאים עשוי לחבר חוט.
תא היעילות ניתוק נע בין 81% בתאים HT-29 (טווח 54.9% 93.2% ו- n = 5) ל- 81% (טווח 63.51% 92.87%, n = 6) ו- 91% (טווח 84.7% 95.3% n = 6) LNCaP בולטים VCaP תאים, בהתאמה. באופן דומה, ההתאוששות של תאים מנותקת שונה בין שורות תאים: ממוצע של 28% של תאים HT-29 מנותקת ששוחזרו על ידי cytocentrifugation. ואילו קצב ההחלמה LNCaP היה נמוך יותר מ-10%, שיעור ההחלמה הממוצע עבור תאים VCaP היה 55%.
כ- 75% של תאים בודדים נתון WGA תשואה באיכות גבוהה WGA מוצרים: 1) השמצות של WGA מוצרים ועד 0.1 > 1 kb (איור 4, החלונית העליונה), 2) ושלוש או ארבע להקות איכות 4plex לשלוט PCR (איור 4, החלונית התחתונה) . WGA המוצרים יכולים לשמש עבור 1) מערך-CGH פרופיל להכיר את הקריטריונים איכות עבור מערך בתא יחיד-CGH פרופילים 6,7 ו- 2) יישוב המיתרים לאחר הגברה מחדש WGA 7.
איור 1: זרימת עבודה עבור לבודד ולשחזר התאים היעד לניתוח החד-תאיים. (א) תאים מתורבתים עד 90% confluency וקצרו (B) כדי לקבל השעיה תא בודד. לאחר צביעת עם CFSE, הכתם nucleic, (ג) את החוט functionalized מודגרת בנוכחות תאי נפח של 5 מ"ל באמצעות צינורות התגובה או באמצעי אחסון נמוך באמצעות טיפ פיפטה פסטר. האחרון מאפשר יישום של התא המתלים כרכים נמוך כמו 15 µL. תאים (D) צריך להיות מנותק תוך 4 שעות לאחר הטעינה. לכן, החוט ימוקם צינור התגובה 1.5 mL מלא עם שחרור מאגר. לאחר 15 דקות דגירה נדנדה ו 10 דקות צנטריפוגה, החוט יוסר ולא התליה תא הוא centrifuged כדי הצניפה התאים. (ה) משוחזר תאים או הועבר שקופית זכוכית תא בודד המיקרומניפולציה (למעלה) או cytocentrifuged לשקופית מצופה קרום, מועבר לייזר microdissection (למטה). (נ) בסופו של דבר, שנקטפו תאים בודדים הם מוגבר באמצעות הגברה הגנום כולו (WGA). WGA מוצרים תואמים מערך-CGH וניתוח ממוקד המיתרים במורד הזרם. EpCAM epitope: עיגול ירוק על פני השטח של התא. Functionalized חוט: מכשיר, חוטים משולש-הסליל אפור. פולימרים: קווים סגולים. נוגדנים אנטי-EpCAM: כתום. לשחרר את פעילות המאגר: חץ אדום. גריז סמן כדי להחזיק תא ההשעיה במקום: אליפסה כחולה כהה. התאושש תא ההשעיה: תכלת. נימי עבור המיקרומניפולציה: שחור קו. הגדלה: תא התאושש לקצור ידי חוץ-גופית, cytospin על מכוסה קרום השקופית המכילה תאים התאושש (אליפסה ממולאת אפור). הגדלה: להיות התאושש תא לייזר microdissected (גריי קו מעגלי: ממברנה משקופית ממברנה הגשה המרכזי (backbone) עבור microdissection לייזר), אובייקטיבי עם קרן לייזר (קו כחול מתקרבת השקופית הממברנה מלמטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: להמחיש תאים עם תוויות ברורות. (A, E) התאים לפני טעינה: תאים בלוחיות הסבר CFSE, counterstained עם ה-DNA intercalating צבע מציג עוצמת האות של טווח של CFSE (ירוק). (B,F) תאים עם תוויות ברורות שנתפסו על החוט. (C,G) תיל לאחר הליך ניתוק התא. (יח,ח) התאים מנותקים תיל, התאושש על ידי cytocentrifugation לשקופית. CFSE: ערוץ FITC (ירוק). כתם DNA: ערוץ דאפי (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: האזנה ואחסון תא. (א) תאים של החוט. פרט (B) של ה-functionalized. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: בקרת איכות של מוצרים WGA מתקבל מתאי יחיד micromanipulated. הדף פאנל: מוצרים WGA המתקבל תאים בודדים בדרך כלל התוצאה ב- DNA מכפיש החל 0.2 kb > 1.0 kb בעוצמה שיא-סביב 0.5 ק ב. דוגמאות מספר 1, 7, 13 (מסומן בכוכביות) להראות שיוצרת או אין דנ א מטושטש. פאנל התחתונה: WGA המוצרים הם באיכות מספקת אם PCR 4plex התשואות שלושה או ארבעה ארבעה מוצרים PCR (ב- 100, 200, 300, 400 bp). 1, 7, 10 ו 13 להראות פחות משלוש הלהקות ודוגמאות לא ייכללו ניתוח נוסף. ליין M מכיל סולם bp 100 ומציינים כוכביות הדגימות איכות המוצר לא מספיק של WGA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פריימר רצף | הערה |
| יונקות-gtt המרכז לאמנות עכשווית אתא tga ttc cac cc-3′ | bp 100 פריימר לפנים |
| יונקות-ctc ctg גה גת ggt גת gg-3′ | bp 100 פריימר הפוכה |
| יונקות-קנאה tgg agc מחסום פה gct agc-3′ | פריימר לפנים 200 bp |
| יונקות-ttt tgc ggt לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה aat gtc ct-3′ | 200 bp פריימר הפוכה |
| יונקות-קנאה tga gac att ctt gct gg-3′ | bp 300 פריימר לפנים |
| יונקות-tcc מעשה aac חטיבתי tca gcg tc-3′ | bp 300 פריימר הפוכה |
| יונקות-aca gtc החתול gcc atc מעשה gc-3′ | 400 bp פריימר לפנים |
| יונקות-gct tga לפנות לסוכנות של agt ggt מס רווחי הון tg-3′ | 400 bp פריימר הפוכה |
טבלה 1: רצפים פריימר לבקרת איכות 4plex PCR
Discussion
הפרוטוקול המתואר שמטרתה אחזור תאים חוט functionalized (המכונה התקן) עבור ex-vivo תא בודד אנליזה גנומית. בדקנו שלוש שורות תאים EpCAM-חיוביות (HT-29, LNCaP ו VCaP), אבל באופן עקרוני, ניתן ליישם שיטה זו כל שורת התאים לבטא EpCAM. התאים היעד EpCAM-חיוביים ניתן להציג על המכשיר כמו השעיה תא טהור (ראה 2.1). או מעורבות לתוך עודף של תאים הרקע (למשל. היקפי דם, רואה 2.2.). ואילו במיוחד האחרון עשוי לשמש כדי לבדוק את קיבולות בבידוד בתנאים נדירים תא, כוונון עדין של מספר התאים מחובר הכבל יכול להיעשות באמצעות מצומצמות תיאר את הגישה (ראה 2.3.). כמו ההבדלים בין שורות תאים הם צפוי, צפיפויות תא מתאים לטעינה הכבל, סיבוב מהירות כמו גם זמן הדגירה צריך להיבדק מדעית המעריכה את מספר התאים המחוברים באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence.
עבור יישומי הזרם גנומית ברמת תא בודד WGA, נדרש. לשיטת הבחירה WGA עשויים להשתנות בין המעבדות ופתוחה, בעקרון, השיטה שלנו על כל אמצעי ממה יכולה להתמודד דגימות המתקבל microdissection חוץ-גופית או לייזר. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים בשיטה המבוססת על ה-DNA enzymatically מפוצלים בשל ביצועים טובים יותר לעומת WGA קיטוע-חום המבוסס על7. תאים אופציונלית, יחיד ניתן להעביר אותה WGA איזותרמי ומאפשר DNA עוקבות פרופיל20,21.
הפרוטוקול המתואר שמטרתה מתאושש תאים ללא פגע לאחר להיות מחוברים דור חדש של חוטים functionalized לניתוח תא בודד גנומית. הדור הראשון של חוטים functionalized, גם לייצג את ההתקנים העשרה רק אישור CE ויוו בשוק עד כה, שימשו לספירת CTCs בחולי סרטן גרורות. פרסומים קודמים ונתונים שלנו להציע את הטכניקה בידוד ויוו להיות רגישים בהשוואה את הטכנולוגיה הנוכחית תקן זהב2. לפיכך, מצייד ויוו בידוד טכניקה זו עם תכונת שחזור כפי הבנתי את ההתקן מאפשר שילוב של שחזור CTC גבוהה עם אפיון ברמת תא בודד.
אולם, המכשיר אינה נמחקת לשימוש בחולים, לפיכך, נתונים קליניים אינם זמינים. Ex-vivo יישומים (דהיינו בידוד CTCs מדם היקפי לאחר דגימה) אינם מומלצים כמו הטכנולוגיה היא להתאים הגדרות נוכח cubital שחצן, למשל נמוך הקוטר של שחצן (הגדלת ההסתברות קשר בין CTCs לבין נוגדנים תופסת ישיר), זמן ארוך השמירה (30 דקות, המאפשר L 2-3 של דם להעביר את החוט). עם זאת, כמתואר בסעיף 2.2. התאים היעד יכול להיות גם מבודד דגימות מעורבת7.
מגבלה הנוכחי של השיטה היא התאוששות לא יעיל של תאים מבולבל לאחר ניתוק חוטי החשמל. זה, עם זאת, אולי ניתן לשפר על ידי צעד קיבוע תא לפני הטיפול ניתוק.
לסיכום, פרוטוקול זה הוא צעד ראשון לקראת השימוש בשילוב של שיטת בידוד ויוו עם תא השחזור עבור גנטית איפיון תאים בודדים. מאמצים נוספים צריכה לטפל אופטימיזציה של שחזור התא, סיווג עבור היישום שלה חולים1,2. עם זאת, רפואה אישית להחלטות ניטור וטיפול טיפול חורג ספירה של CTCs. לפיכך, שיטה זו היא צעד ראשון לקראת גנומית CTC אפיון ברמת תא בודד.
יישומים לקראת ניתוח transcriptome תא בודד נראה ריאלי כמו תאים שלמים נקצרים. עם זאת, הוא נשאר לפנות לבדיקה אם ההליך בגמילה יש השפעה על תקינות RNA (למשל העברת תאים בודדים התאושש כדי פירוק ישיר ולאחריו RT-qPCR22). אם מצליחים, אפיון של תאים בודדים (למשל CTCs) יכול להיות מוזז לשלב transcriptome, המאפשר ניתוח מפורט יותר. בהקשר זה, ה-RNA-seq שימוש חכם-seq2 מספק כלי חשוב לניתוח במורד הזרם RNA של תאים בודדים כמו cDNA preamplified (שהתקבל במהלך ההכנה ספריית ה-RNA-seq) יכולה להיות נתונה ל- PCR כמותי. זה יאפשר היעד משולב עם ניתוח המבוסס על הקרנה של תאים בודדים התאושש22,23.
החוטים functionalized הנוכחי מבוססים על נוגדנים anti-EpCAM אשר מהווה סמן אפיתל בשימוש נרחב לבחירה חיובי של CTCs24. כפי CTCs מספר עשוי downregulate אפיתל סמנים כגון cytokeratins או EpCAM25, הוספת נוגדנים כגון HER2/ש להגדיל את הסיכוי של CTC בידוד. מספר נוגדן מבוסס העשרה יש אסטרטגיות פותחה, נבדקו על ידי פריירה ואח. 201626. תערובת של נוגדנים ותשמרו על חוט יכול להיות שיפור עתידי של הטכנולוגיה המוביל את ניתוקה של מספר גבוה יותר של תת נוספים CTCs.
. זה חובה על כל השלבים הכרוכים חוט בטיפול כדי לשמור את החלק פונקציונלי של החוט שקועים פתרון על מנת לשמור על הפונקציונליות שלו. אנו ממליצים למקם את החוט ב- 1 x PBS במהלך ההערכה (מיקרוסקופ; למשל-צעדים 3.1. -3.3.) אחסון... כדי למנוע כתמים בלתי הולם, אנו ממליצים על שימוש טרי שהוכן מכתימים פתרון בשלבים 1.2.1. 1.2.2. התאים בחולשה מוכתם ה"בלתי תא סומכים את החוט, עלול להוביל underestimation של התאים המצורפת.
זה הכרחי למנוע חיבור על פיפטה פסטר עם הכיפה גומי בעת הוספת את החוט פיפטה פסטר לטעינה עוקבות של התליה תא (שלב 2.3.4.). הכיפה גומי משמש כדי להחזיק את החוט במקום כך החלק פונקציונלי-שוכן בקצה פיפטה פסטר. אם הכיפה מחוברת גם בחוזקה על חלקו האחורי של פיפטה פסטר, העמסה של התליה תא אינה אפשרית. במקרה זה, להקל את הכובע כך האוויר אשר נמצא שנעקרו על ידי התליה תא טעון יכולים להשאיר את פיפטה.
לכופף את החוט חיונית ומגמתו במהלך תא ספירת צעדים 3.2. 3.3. לטעון את הרשת בעזרת סרט דביק על כך שאינם פונקציונליים סוף החוט מגיע לשקר לצד אחד. לאחר סריקה של כל אורכו של החלק פונקציונלי, החוט הוא התגלגל 180° אז ניתן לסרוק את החצי השני של החוט פונקציונלי. שלב זה חשוב עבור הניסויים הראשוניים להעריך את מספר התאים על החבל. ברגע מוערך מספר התאים עבור שורת התאים ו הליך מסוים, שיכול לחזור ההליך מבלי לספור תאים (למשל. בדיקת נוכחות של תאים או השמטת שלב זה בלבד). Pipetting זהיר הוא חיוני כדי למנוע איבוד תאים בעת הורדת כמות תגובת שיקוע בשלב 4.8. ודא pipetting מתבצע בצורה חלקה מבלי לגרום turbulences לכדור בגדר.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי האוסטרי המדע קרן (FWF), פרויקט-. לא. אני 1220-B19 (ל. נ) במסגרת הפרויקט ERANET ב Translational סרטן מחקר (TRANSCAN) "Circulating גידול התאים כמו סמן עבור מחלה שיורית מינימלית בסרטן הערמונית (CTC-סריקה)". דוקטורנטית ספורטינג הוכשר בתוך המסגרת של תוכנית דוקטורט הרפואה מולקולרית של האוניברסיטה הרפואית של גראץ. המחברים להכיר בהכרת תודה נינה Schlögl, דניאל קומר, גבי Wendt, קלאודיה Chudak, ג'וליה שולץ ו ג'ואנה שילר לסיוע טכני מומחה שלהם. המחברים מודים גיאורג Peinhaupt על עיצוב גרפי תמיכה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
| McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
| Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
| Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
| Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
| 50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
| Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
| Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
| Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
| Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
| MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
| Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
| Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
| Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
| Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
| Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
| Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
| Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
| Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
| Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
| Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
| 0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
| Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
| Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
| Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
| MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
| Standard PCR reagents | |||
| 6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
| DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
| Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |
References
- Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
- Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
- Kuske, A., et al. Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients. Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).
- van Beers, E. H., et al. A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples. Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).
- El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA. Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).
- Möhlendick, B., et al. A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH. PLoS ONE. 8 (6), e67031 (2013).
- Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci Rep-UK. 7, 43424 (2017).
- Zhang, H., et al. Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck. Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).
- Carter, L., et al. Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer. Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).
- Luca, F. D., et al. Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer. Oncotarget. , (2016).
- Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection. Cell. 168 (4), 571-574 (2017).
- Page, K., et al. Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer. Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).
- Kalinich, M., et al. An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma. P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).
- Gorges, T. M., et al. Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells. Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).
- Sinkala, E., et al. Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting. Nat Commun. 8, 14622 (2017).
- Morrow, C. J., et al. Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study. Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).
- Williamson, S. C., et al. Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer. Nat Commun. 7, 13322 (2016).
- Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM. Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).
- Czyż, Z. T., Klein, C. A. Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells. Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).
- Kroneis, T., et al. Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR. J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).
- Kroneis, T., et al. Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification. Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).
- Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification. Sci Rep-UK. 7, 45219 (2017).
- Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. Potential and Challenges of Liquid Biopsies. Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).
- Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. Circulating tumor cell technologies. Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).
