Summary
Denne protokol er at restituere sig og forberede Molekylær genetisk karakterisering på niveauet encellede sjældne målceller fra en blanding med ikke-målarter baggrund celler. DNA kvalitet er lig med ubehandlede enkelt celler og giver mulighed for enkelt-celle ansøgning (begge screening baseret og målrettet analyse).
Abstract
Sjældne target-cellerne kan isoleres fra en stor baggrund af ikke-målarter celler ved hjælp af antistoffer specifikke for overflade proteiner af target-cellerne. En nyligt udviklede metode bruger en medicinsk wire functionalized med anti-epitelcelle vedhæftning molekyle (EpCAM) antistoffer for i vivo isolation af cirkulerende tumor celler (CTCs)1. En patient-matchede kohorte i ikke-metastatisk prostatacancer viste, i vivo isolation teknik resulterede i en højere procentdel af patienterne positiv for CTCs samt højere CTC tæller i forhold til den nuværende guld standard i CTC optællingen. Som cellerne ikke kan inddrives fra aktuelle medicinsk udstyr, blev en ny functionalized wire (benævnt enhed) fremstillet tillader opsamling og efterfølgende udstationering af celler af enzymatisk behandling. Celler er tilladt at tillægge enheden, visualiseret på et mikroskop og adskilt ved hjælp af enzymatisk behandling. Gendannede celler er cytocentrifuged på membran-belagt dias og høstet individuelt ved hjælp af laser microdissection eller micromanipulation. Encellede prøver underkastes derefter encellede samlede genom forstærkning tillader flere downstream analyse herunder screening og target-specifikke tilgange. Proceduren for isolation og recovery giver høj kvalitet DNA fra enkelt celler og forringe ikke efterfølgende hele genom forstærkning (WGA). En enkelt celle amplificerede DNA kan videresendes til screening og/eller målrettet analyse som array sammenlignende genom hybridisering (array-CGH) eller sekvensering. Enheden tillader ex vivo isolation fra kunstige sjældne celle prøver (dvs. 500 målceller spidse til 5 mL af perifert blod). Detachement satser af celler er acceptabel (50-90%), genfindingsprocenten for fritliggende celler på dias spænder over en bred vifte afhængig af cellelinie anvendes (< 10 - > 50%) og har brug for nogle yderligere opmærksomhed. Denne enhed er ikke markeret til brug i patienter.
Introduction
For nylig, CellCollector DC01, en medicinsk wire functionalized med anti-EpCAM antistoffer til at isolere CTCs fra perifert blod af kræftpatienter, blev tilføjet til den metodisk spektrum af CTC tælling1,2,3 . I en igangværende undersøgelse i ikke-metastatisk prostatacancer, denne functionalized wire rapporterer næsten dobbelt så mange patienter at være CTC-positive og højere CTC tæller i CTC-positive patienter i forhold til CellSearch, den gyldne standard i CTC optællingen3 . På grund af denne opmuntrende resultater, dyrkning af celler fra en functionalized medicinsk ledning til enkelt-celle analyse ville være ønskeligt, men hverken enzymatisk behandling med celle detachement løsninger (f.eks. trypsin) eller laser microdissection giver mulighed for inddrivelse af intakt celler (data ikke vist).
For at tillade udstationering af erobrede celler, var en ny generation af functionalized ledninger udstyret med en specifik polymer. Denne polymer, der forbinder capture-antistoffer til wire, er modtagelige for en frigivelse buffer behandling tillader udstationering af intakt celler (CellCollector DC03 omtales som enhed). Den nye functionalized indretning, giver isolation af target-cellerne fra forskellige koncentrationer af kræft celle linje celler spidse til bovint serumalbumin (BSA) / fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og perifert blod, henholdsvis.
For at lette den visuelle påvisning af celler på enheden og efter opsving, målrette kræftceller er mærket med carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) og en DNA pletten før inddrive behandling (dvs. opladning og afmonterer). Den behandling effekter på DNA kvaliteten af enkelt celler ved hjælp af en kvalitetskontrol PCR4,5, array-CGH6,7 tidligere, blev evalueret efter WGA og målrettet sekventering7 viser ingen forskel i forhold til ubehandlede celler micromanipulated fra celle suspensioner7. Fordelen ved denne metode ligger i kombinationen af sjældne målcellen pre berigelse og inddrivelse af celler til én celle downstream analyse (figur 1). Den nuværende CE-mærket i vivo samling enhed er generelt bruges til optælling af CTCs i stedet for én celle Molekylær karakterisering2,8. Dog mere omfattende analyse at undersøge heterogenitet blandt CTCs længe til analyse på den enkelte celle niveau (dvs. målrettet sekventering på én celle-niveau). Andre cell-baserede metoder er baseret på immunomagnetic isolation af EpCAM-positive CTCs og encellede håndtering baseret på dielektroforesis for efterfølgende Molekylær genetisk analyse9,10. Molekylær karakterisering af CTCs er en vigtig forudsætning for deres nyttige gennemførelse i kliniske omgivelser og er lige så vigtige for grundforskning af metastatisk cascade. Parallelt med CTCs, er cirkulerende tumor DNA (ctDNA) blevet af stor betydning, da det giver mulighed for DNA analyse af tumor byrde med minimal teknisk isolering procedurer11,12. Celle-baserede tilgange kan tjene som et supplerende bidrag, da det giver mulighed for RNA13,14 og protein15 udtryk analyse og også for CTC stammer celle kulturer eller xenografts16, 17. selv om forhindringer såsom lav celle opsving og clearance til brug hos patienter skal stadig overvindes, metoden fangst- og frigivelse tager et vigtigt næste skridt til karakterisering af sjældne target-cellerne.
Protocol
Alle procedurer er blevet godkendt af den etiske komité i den medicinske universitet i Graz (25-240 ex 12/13). Perifert blod for spiking eksperimenter blev samplet fra raske personer.
Bemærk: Denne protokol beskriver isolering af HT-29 celler (human kolon kræft cellelinje) fra PBS eller kunstige blandinger af HT-29 celler og perifert blod. Det samme eksperiment blev udført med to ekstra cellelinjer (LNCaP og VCaP, eksperimentelle data i repræsentative resultater) og teoretisk kan udføres med alle celler, der udtrykker EpCAM.
1. forberedelse af target-cellerne
- Cellekultur og mærkning af celler
Bemærk: I denne protokol, er celler dyrkes i 75 cm² kultur kolber. Venligst justere beløbene for reagenser i overensstemmelse hermed hvis andre celle kultur enheder anvendes (f.eks. 25 cm² kultur retter, 6-godt plader, osv.). Alle væsker, der anvendes er pre opvarmet til 37 ° C i et vandbad. Hvis ikke andet er angivet, er alle protokol trin udføres ved stuetemperatur (RT).- Kultur HT-29 celler i Mccoy's 5a ændret Medium suppleret med 2 mM L-glutamin, 20 mM Hepes, 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin ved 37 ° C i 5% CO2 atmosfære.
- Når celler er 90% sammenflydende, fjerne medium og skyl celler med 10 mL 1 x PBS.
- For at høste celler, tilsættes 2 mL af celle detachement løsning (tabel af materialer og reagenser) til cellerne og der inkuberes celler i ca 5 min ved 37 ° C.
Bemærk: Detachment løsning indeholder proteolytiske og collagenolytic enzymer i 1 x PBS, 0,5 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) og 3 mg/L phenol rød. Reducere pre opvarmning tidspunktet for celle detachement løsning til et minimum, da dette vil være inaktive efter 1 h ved 37 ° C. Dække hele cellelag for at opnå optimal celle detachement. - Kontrollere udstationering af celler ved hjælp af en omvendt mikroskop.
- Overføre alle fritliggende celler til en 50 mL tube udfyldes på forhånd med 10 mL i cellekulturmedium, (samme som bruges i trin 1.1.1.) og resuspend cellerne af pipettering.
- Placer de resterende cellesuspension på en vandret roller mixer på RT og videre til mærkning trin.
- Live celle mærkning af target-cellerne
- Fortyndet 1 µL af 5 mM CFSE (leveres i dimethylsulfoxid, DMSO) i 1 mL PBS, 1 x pre varmes ved 37 ° C til indhente 5 µM klar-til-brug CFSE mærkning løsning.
Bemærk: For optimal farvning resultaterne, bruge frisklavede løsninger. - Udarbejde en klar-til-brug DNA Farvningsopløsningen (tabel af materialer og reagenser) i 1 x PBS og opbevar den ved 2-6 ° C beskyttet mod lys.
Bemærk: For optimal farvning resultaterne, bruge frisklavede løsninger. - Få celler fra vandret roller mixer (trin 1.1.6.) og pellet celler ved 300 x g i 10 min. Fjern supernatanten og resuspend celler i 10 mL 1 x PBS.
- Skyl cellerne igen med 1 x PBS og resuspenderes celle i 500 µL klar-til-brug CFSE mærkning løsning.
- Inkuber celler ved 37 ° C i 15 min og indsamle cellerne efter centrifugering ved 300 x g i 3 min.
- Resuspend de mærkede celler i 1 mL af pre varmede cellekulturmedium og tillade cellerne til at regenerere ved 37 ° C i 30 min.
- Høste cellerne ved centrifugering ved 300 x g i 3 min og resuspend celle pellets i 1 mL af klar-til-brug DNA farvning løsning ved 37 ° C i 10 min.
- Sammenpresse cellerne, Fjern supernatanten og resuspend celler i 4 mL 1 x PBS. Vurdere den celle tæthed ved hjælp af en hemocytometer og tjek for fluorescens mærkning ved hjælp af et fluorescens mikroskop udstyret med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og fluorescein isothiocyanat (FITC) filtre (figur 2A og 2E).
- Centrifugeres celler ved 300 x g i 3 min og resuspenderes celle efter celle tætheder behov for de respektive eksperiment som anført i næste afsnit og sted på is.
- Fortyndet 1 µL af 5 mM CFSE (leveres i dimethylsulfoxid, DMSO) i 1 mL PBS, 1 x pre varmes ved 37 ° C til indhente 5 µM klar-til-brug CFSE mærkning løsning.
2. opkrævning af ledning
Bemærk: Celler kan isoleres fra mål celle/perifere blod spikings på milliliter skala eller ved at give lavt antal celler på en microliter skala. Der henviser til, at den tidligere metode giver mulighed for efterligne sjældne-cellen betingelse i perifert blod, kan sidstnævnte være den foretrukne måde at vedhæfte nogle celler med henblik på protokollen optimering/test.
- Oplader ledning ved hjælp af en stor mængde af celle suspensioner
- Forbered en 2% BSA blokering løsning ved at opløse 0,8 g BSA i 40 mL 1 x PBS (celle kultur brug). Opløses BSA ved indledende vortexing og efterfølgende inkubation ved RT på en vandret roller mixer til 10-20 min.
- Skyl tomme EDTA-rør/natrium heparin rør med 2 mL 2% BSA at fjerne antikoagulerende rester og kassér løsningen. Blokere rør overfladen ved inkubation ved RT med 5 mL af 2% BSA på en vandret roller mixer på 15 rpm i 30 min og kassér løsningen.
- Fortyndes mærkede celler (afsnit 1.2.) til en tæthed af 100 000 celler/mL og bruge 5 mL til at oplade wiren.
- Tilsættes 5 mL af den mærkede cellesuspension (500 000 celler i alt) til røret. Undgå bobler, når du tilføjer cellesuspension.
- Fjerne kablet fra opbevaringsrum samt gummi cap holding wiren og skyl det i 1 x PBS (figur 3).
- Trænge gummi rør cap af EDTA-rør (trin 2.1.4.) ved hjælp af en sprøjte nål (20G) og indsætte wiren, sådan at den funktionelle del er fuldt nedsænket i en cellesuspension når fælles landbrugspolitik tilbage på røret og røret anbringes på hældende roller mixer.
Bemærk: Den triple-spiralformet funktionelle del af wiren bør dækkes med cellesuspension hele opladningen. - Rotere rørene på en hældende roller mixer på 5 rpm i 30 min at tillade cellerne til at vedhæfte til wire.
- Skyl wire med 5 mL 1 x PBS og opbevares mørkt ved 2-6 ° C i en 15 mL rør indeholdende 1 x PBS indtil visuel undersøgelse.
Bemærk: Den funktionelle del af ledningen skal altid være neddykket i PBS til at undgå at skade cellerne.
- Isolere målceller fra kunstige blandinger med perifert blod (alternativ opladning metode til: 2.1. Oplader ledning ved hjælp af en stor mængde af celle suspensioner)
- Fortynd mærkede celler (afsnit 1.2.) for at opnå celle suspensioner med høj celle tæthed (> 1 000 000 celler/mL), derved at holde mængden af cellesuspension føjet til de perifere blod lav.
- Tilsættes 500 til 500 000 celler til 5 mL af perifert blod og bland dem ved at vende røret.
- Fjerne kablet fra opbevaringsrum, fjerne gummi cap holding wiren og skyl det i 1 x PBS.
- Trænge en ny tube cap med den ikke-funktionelle del af enheden ved hjælp af en sprøjte nål (20G), sådan at den funktionelle del er fuldt nedsænket i den spidse blod når fælles landbrugspolitik tilbage på røret og røret anbringes på hældende roller mixer.
Bemærk: Den triple-spiralformet funktionelle del af wiren bør dækkes med cellesuspension hele opladningen. - Inkuber røret på skrå roller mixer på 5 rpm i 30 min på RT.
- Skyl wiren 3 gange i 1 x PBS og opbevares mørkt i en 15 mL rør indeholdende 1 x PBS indtil visuel undersøgelse.
Bemærk: Den funktionelle del af ledningen skal altid være oversvømmet for at undgå at skade cellerne.
- Oplader ledning fra lav-volumen celle suspensioner (alternativ opladning metode til: 2.1. Oplader ledning ved hjælp af en stor mængde af celle suspensioner)
- Resuspend mærket cellerne i 1 000 000 celler/mL i 1 x PBS.
- Lave en 150 mm engangs glas Pasteur pipette vandret på en rist.
- Fjerne kablet fra opbevaringsrum, men holde den gule gummihætte holding wiren.
- Placer wiren i pipetten, sådan at den functionalized del er beliggende i spidsen af Pasteur pipette ikke rører glasset.
Bemærk: Spidsen af wiren bør ikke holde ud af Pasteur pipette tip. Undgå at sætte bagenden af Pasteur pipette tip med gummi cap holding wiren. Hvis knyttet stramt, kan ikke celle suspensioner indlæses fra anden siden i pipette tip. - Indlæse 15 µL af cellesuspension i spidsen af Pasteur pipette dækker den functionalized del af wiren.
- Inkuber wire i 10 min. manuelt kvart-vending den forsamlede wire/Pasteur pipette spids hvert minut.
- Fjerne kablet fra Pasteur pipette tip, skyl det i 5 mL 1 x PBS og opbevares mørkt ved 2-6 ° C i en 15 mL rør indeholdende 1 x PBS indtil visuel undersøgelse.
Bemærk: Den funktionelle del skal altid være nedsænket i 1 x PBS til at undgå at skade cellerne.
3. tælle celler på wiren
Bemærk: Hold altid de funktionelle del af wiren nedsænket i 1 x PBS til at undgå at skade cellerne.
- Brug et fedt pen til at tegne et rektangel område på et glas dias og tilføje 500 µL 1 x PBS.
- Bøje den ikke-funktionelle del af wiren og placere den på glas dias, sådan at den funktionelle del er nedsænket i 1 x PBS.
Bemærk: Passe inden for rektanglet og bind 1 x PBS helt dækker den funktionelle del af wiren. Bruge en dobbeltsidet selvklæbende tape til at montere den ikke-funktionelle del af wiren på diaset. - Visuelt at undersøge begge sider af wire optælles erobrede cellerne (figur 2B og 2F).
Bemærk: Tilstedeværelsen af celler bestemmes ved hjælp af et fluorescens mikroskop udstyret med filtre for DAPI og FITC. Begge sider af wiren kan kontrolleres og antallet af celler enten vurderet (for høj celle numre) eller tælles (kun muligt, hvis lavt antal celler er knyttet til wire). Kan springes over dette trin, hvis tælling af celler ikke er nødvendigt. - Efter scanningen, placere wire tilbage ind i 15 mL rør indeholdende 1 x PBS (Se Note af 2.3.6. og afsnittet 3.), opbevares mørkt wiren.
Bemærk: De fleste af de ikke-funktionelle del af wiren kan være skåret (herunder bøje) og fjernet lette opbevaring.
4. udstationering og inddrivelse af target-cellerne
Bemærk: Detachment af cellerne skal ske inden for 4 h efter isolation.
- 4 mg release buffer komponent (tabel af materialer og reagenser) opløses pr. mL 1 x PBS og opløsningen filtreres gennem et 0,2 µm sterile filter at få klar-til-brug bufferen.
Bemærk: Polymer af wiren er sammensat af en hydrogel, som er functionalized med anti-EpCAM antistoffer tillader binding til EpCAM-præsenterer målceller. Release bufferen indeholder en carbon-ilt proteolytisk enzym i stand til at holde hydrogel. Proteolytisk kavalergang resulterer i nedbrydning af polymer og dermed løsrivelse af erobrede celler. - Pre varm release buffer ved 37 ° C i 5 min.
- Tilføje 1,6 mL release buffer til at fylde en 1,5 mL reaktion tube.
Bemærk: Tuber beregnet til 1,5 mL reaktion mængder tillader anvendelse af 1,6 mL, som er nødvendige for udgiftsdækkende den funktionelle del af wiren. - Ruger funktionelle del af wire i release buffer ved 37 ° C (vandbad) til 20 min. Brug gummihætte leveret med ledning i stedet for rør cap for at fastsætte wiren i 1,5 mL tube til at undgå forurening under inkubation i vandbad.
- Overføre den ledning/slange forsamling til en shaker på RT og 500 rpm i 15 min.
Bemærk: Shaker har en bane på 1,5 mm. - Placer den ledning/slange forsamling i en centrifuge og spinde det ved 300 x g i 10 min.
- Fjerne kablet fra røret, lukke fælles landbrugspolitik og centrifugeres røret igen ved 300 x g i 10 min.
Bemærk: Ledning kan lagres i 1 x PBS på 2-6 ° C i mørke til celle optælling for at vurdere detachement effektivitet/check for celler forbliver på wiren. - For at reducere omfanget af cellesuspension, fjerne alle, men 100 µL (micromanipulation) eller alternativt 300 µL (cytocentrifugation og efterfølgende laser microdissection) af supernatanten og straks gå til én celle prøveudtagning.
5. enkelt-celle prøveudtagning
- Micromanipulation
Bemærk: Enkelt celler vil blive tilføjet til 2 µL af celle lysis master mix giver WGA. Forberede master mix afhængig af antallet af celler, der skal behandles, beregne ekstra mængder for tab som følge af pipettering og sted celle lysis master mix på is.- Forberede den celle lysis master mix (komponenter af WGA kit, tabel af materialer og reagenser) i henhold til protokollen, beskrevet af Czyż al.18. Kort, Bland 2,0 µL af reaktion buffer, 1,3 µL af octylphenoxypolyethoxyethanol (10% opløsning), 1,3 µL af 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl-polyethylen glycol (10% opløsning), 2.6 µL af proteinase K opløsning og 12,8 µL RNase/DNase-frit vand for at få en Master mix for 10 prøver (samlede volumen 20 µL).
Bemærk: For mere prøver, øge diskenhederne i overensstemmelse hermed. Sammensætningen af celle lysis master mix er forskellig fra den, der anvendes i den alternative procedure udnytte laser microdissection prøver (Se 5.2.). - Brug et fedt pen til at tegne et område holder cellesuspension på plads. Område og lydstyrken justeres, hvis den celle tæthed er for høj (dvs. mark et større område på glas dias, indlæse 1 x PBS og en alikvot af cellesuspension).
- Der afpipetteres hele farves cellesuspension (fremstillet i trin 4.8.) i glas diaset.
- Overføre glas dias til et mikroskop udstyret med en micromanipulator. Lad cellerne nøjes med 5 min (figur 2D og 2 H).
- Forberede 0,2 mL PCR rør fyldt med 2,0 µL af celle lysis master mix (Se trin 5.1.1.) og gemme den på is.
- Indsamle enkelt celler i 1 µL 1 x PBS ved hjælp af micromanipulator og overføre cellerne ind i et rør, der indeholder celle lysis master mix.
Bemærk: For at overføre micromanipulated celler i celle lysisbuffer placere kapillar direkte ind i de 2 µL af lysis løsning og udsende indtil boblerne kan ses. - Kort spin ned prøve på 2000 x g i 3 s ved hjælp af en desktop mikrofuge til at indsamle alle væske i bunden af røret. Placer prøverne på is.
- Direkte videre til én celle WGA (Se afsnit 6. og Czyż et al. 19).
- Forberede den celle lysis master mix (komponenter af WGA kit, tabel af materialer og reagenser) i henhold til protokollen, beskrevet af Czyż al.18. Kort, Bland 2,0 µL af reaktion buffer, 1,3 µL af octylphenoxypolyethoxyethanol (10% opløsning), 1,3 µL af 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl-polyethylen glycol (10% opløsning), 2.6 µL af proteinase K opløsning og 12,8 µL RNase/DNase-frit vand for at få en Master mix for 10 prøver (samlede volumen 20 µL).
- Laser microdissection (alternativ encellede prøveudtagningsmetode til: 5.1. Micromanipulation)
Bemærk: Sammensætningen af master mix anvendes i dette afsnit er forskellig fra den, der anvendes i afsnit 5.1 for micromanipulation. Enkelt celler vil blive tilføjet til 4,5 µL af celle lysis master mix (komponenter af WGA kit, tabel af materialer og reagenser) nemlig WGA.- Forberede celle lysis master mix ifølge Czyż et al. 19 ved at blande 5.0 µL af reaktion buffer, 1,3 µL af octylphenoxypolyethoxyethanol (10% opløsning), 1,3 µL af 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl-polyethylen glycol (10% opløsning), hhv., 2.6 µL af proteinase K opløsning og 34,8 µL af RNase / DNase-frit vand til at opnå en master mix for 10 prøver (samlede volumen 45 µL). Plads master mix på is.
Bemærk: For mere prøver, øge diskenhederne i overensstemmelse hermed. - UV-behandling membran-belagt dias egnet til laser microdissection. Derfor placere dias i en DNA tværs linker enhed og udsætte for højeste UV i ca 10 min.
- Samle den membran-belagt slide i en cytocentrifuge og cytospin den hele cellesuspension ved 300 x g i 5 min.
Bemærk: Når du bruger en i-væske system, hvor cellerne er cytocentrifuged i diaset i løsning, Fjern supernatanten efter cytocentrifugation og anvende en tør-spin ved 1140 x g i 1 min. - Direkte videre til laser microdissection eller lad cytospins lufttørre natten over og fryse prøver ved-20 ° C til langtidsopbevaring.
- Afpipetteres 4,5 µL af celle lysis master mix i fælles landbrugspolitik en 0,2 mL PCR rør og høste enkelt celler ved hjælp af laser microdissection.
- Hente PCR rør fra laser microdissection lup og lukke røret. Indsamle alle væske i bunden af røret ved kort-spin og prøven anbringes på is.
- Fortsætte med enkelt-celle WGA eller gemme de isolerede prøver på-80 ° C i op til 1 måned før videre behandling.
- Forberede celle lysis master mix ifølge Czyż et al. 19 ved at blande 5.0 µL af reaktion buffer, 1,3 µL af octylphenoxypolyethoxyethanol (10% opløsning), 1,3 µL af 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl-polyethylen glycol (10% opløsning), hhv., 2.6 µL af proteinase K opløsning og 34,8 µL af RNase / DNase-frit vand til at opnå en master mix for 10 prøver (samlede volumen 45 µL). Plads master mix på is.
6. adapter-linker baseret hele genom forstærkning 18,19
Bemærk: Sørg for alle nødvendige master mix (komponenter af WGA kit, tabel af materialer og reagenser) er udarbejdet og opbevares på is klar til brug. Master mix omfatte DNA fordøjelsen mix 1 for micromanipulated (Se 5.1.) prøver (der indeholder 2,0 µL af reaktion buffer, 2.0 µL af Msejeg begrænsning enzym og 16,0 µL af RNase/DNase-frit vand) eller DNA fordøjelsen mix 2 for laser microdissection (Se 5.2). prøver (der indeholder 2,5 µL af Msejeg begrænsning enzym og 2,5 µL af RNase/DNase-frit vand), pre udgloedning master mix (indeholdende 5,0 µL af reaktion buffer, 5.0 µL af hver af de preannealing PCR adaptere og 15,0 µL af RNase/DNase-frit vand), ligatur Master mix (indeholdende 30,0 µL af pre udglødet PCR adaptere, 10,0 µL adenosin trifosfat løsning og 10,0 µL T4 ligase løsning) og primære PCR master mix (indeholdende 30,0 µL af en PCR-buffer, 20,0 µL af 10 mM deoxynucleotide mix løsning, 10,0 µL af en polymerase mix og 340.0 µL af RNase/DNase-frit vand). Alle diskenheder er givet til forberedelse af 10 prøver. Justere i overensstemmelse hermed at antallet af prøver.
- For celle lysis, sted micromanipulated/laser microdissection prøver i et termisk cycler og køre encellede lysering af inkubere celle på 42 ° C i 45 min, 65 ° C i 30 min og 80 ° C i 10 min.
Bemærk: Brug en termisk cycler med opvarmede låg. Celle lysis kan gøres O/N for 10-15 h. I så fald udelade trinnet inkubation ved 65 ° C. - Køre pre Udglødning af PCR-adaptere. Derfor Inkuber den pre udgloedning master mix i en termisk cycler ved 65 ° C i 1 min. efterfulgt af yderligere 49 cyklusser, 1 min. hver, med gradvis faldende temperaturen 1 ° c/cyklus. Efter 50 cykler (ved 15 ° C), Ruger den master mix ved 15 ° C indtil videre anvendelse.
Bemærk: Dette trin er nødvendige for at generere asymmetriske adaptere egnet til ligatur (Se trin 6.6.) med enkelt-celle DNA udsat for Msejeg begrænsning digest. - Efter celle lysis, spin ned i lysed prøver på 2000 x g til 3 s at indsamle alle væske i bunden og læg den på is.
- For at splitte DNA, tilføje 2 µL DNA fordøjelsen mix 1 til hver mængden micromanipulated prøve eller 0,5 µL af DNA fordøjelsen mix 2 laser microdissection prøve og køre begrænsning digest. Bruge en termisk cycler med en opvarmet låg ved 37 ° C i 5 min. efterfulgt af en restriktion enzym inaktivering skridt på 65 ° C i 5 min.
Bemærk: Fordøjelsen ved 37 ° C kan udvides til 3h. Dette er den eneste protokol skridt forskellige mellem prøver fra micromanipulation og prøver fra laser microdissection. - Spin ned prøver at indsamle alle væske i bunden og læg den på is.
- For ligating begrænsning fordøjet DNA og pre udglødet adaptere, tilføje 5.0 µL af ligatur master mix til hver fordøjet DNA-prøve og ligate det i en termisk cycler ved 15 ° C i 1 time.
Bemærk: Dette trin kan udvides til 12 h eller udføres O/N. - Spin ned prøver at indsamle alle væske i bunden og læg den på is.
- Nemlig WGA tilføje 40.0 µL af primære PCR master mix til hvert af produkterne, ligatur og indkøre en termisk cycler med en opvarmet låg som følger: første WGA, inkuberes prøver på 68 ° C i 3 min. For det andet cyklus 15 gange på 94 ° C til 40 s, 57 ° C i 30 s og 68 ° C i 1 min. 30 s + 1 s/cyklus. Derefter tilføje 9 cyklusser på 94 ° C til 40 s, 57 ° C + 1 ° C/cyklus for 30 s, 68 ° C i 1 min. 45 s + 1 s/cyklus. Derefter cykle 23 gange på 94 ° C til 40 s, 65 ° C i 30 s, 68 ° C i 1 min. 53 s + 1 s/cyklus. Endelig, udføre en afsluttende udvidelse på 68 ° C til 3 min. 40 s og chill prøver at 4 ° C.
- Spin ned prøver at indsamle alle væske i bunden og kontrollere DNA kvaliteten eller opbevare prøver på-20 ° C eller-80 ° C til langtidsopbevaring.
7. kvalitetskontrol af WGA produkter
Bemærk: Kontrol kvaliteten af WGA produkter baseret på rækken af DNA smear og antallet af forstærkning produkter efter at have kørt en 4plex QC-PCR 5. Køre WGA delprøver og respektive QC-PCR prøver på en 1,0%-agarosegel for evaluering.
- Forberede 100 µM stamopløsninger af alle primere anvendes til 4plex kvalitetskontrol PCR (tabel 1). Tilføje 8 µL af hver primer til 136.0 µL PCR-grade vand til at generere 200 µL af primer pool. Vortex løsning for 3 s, spinde det ned på 2000 x g i 3 s og alikvot 20 µL til opbevaring ved-20 ° C.
- Brug standard PCR kits til at forberede en multiplex PCR master mix indeholdende 6.0 µL af 2 x PCR komponenter (undtagen primere), 4,5 µL PCR-grade vand og 0,5 µL af primer pool.
- Tilføje 1,0 µL af WGA produkter, spinde det ned og køre PCR på 94 ° C i 2 min. efterfulgt af 35 cyklusser af denaturering på 94 ° C i 1 min., primer udglødning på 56 ° C i 1 min og primer udvidelse ved 72 ° C i 1 min. 30 s og et afsluttende udvidelse skridt ved 72 ° C i 7 min. Chill det til 4 ° C, spinde det ned og prøveemner på isen for gel analyse samme dag eller ved-20 ° C til senere analyse.
Bemærk: Nedkøling i den termiske cycler kan udføres på 12 ° C til at øge levetiden af Peltier elementer. - Analysere WGA (fremstillet af 6.8.) og respektive 4plex QC-PCR produkter på en Agarosen gel5.
Representative Results
Celler efter CFSE og nukleinsyre farvning kan evalueres ved hjælp af en immunofluorescens mikroskop udstyret med filtre for DAPI og FITC. Kerner til stede med en lyse kontrastfarve i DAPI kanal cytoplasma af celler viser ensartede mærkning med CFSE med heterogene Inter celle intensitet (figur 2A og 2E). Lignende form og farvning intensiteter forventes fra celler knyttet til wire (figur 2B og 2F) såvel som løsrevet fra ledningen og genoprettet på et dias (figur 2D og 2 H).
Høj celle tætheder (f.eks. > 1 000 000 celler/mL) kan resultere i samlede dækning af wire med celler, når opladningen ledningerne. Dog lavere celle tætheder, ændringer i rotationshastighed under inkubation, og brugen af forskellige cellelinjer påvirker isolation effektivitet og skal afprøves særskilt. Når ledningerne blev inkuberet med 5 mL af HT-29 celler til 100.000 celler / mL som beskrevet i afsnit 2.1., en middelværdi på 254 ± 103 celler (n = 5) blev fanget på ledningerne. Med det samme eksperiment ved hjælp af LNCaP celler, en middelværdi på 440 ± 319 celler (n = 5) pr. tråd blev opnået.
Præsentere 500, 5 000 og 50.000 HT-29 celler i en baggrund af 5 mL af perifert blod til ledninger (ifølge protokollen afsnit 2.2.) resulterede i erobringen af 75 ± 18 celler, 25 ± 9 celler og 47 ± 57 celler (n = 3, hver), henholdsvis. Hvis wiren debiteres med 15 µL af cellesuspension (1 000 000 celler/mL) i henhold til protokollen i afsnit 2.3., op til 1 000 (HT-29) celler kan knytte til en wire.
Celle detachement effektivitetsgevinster varierede fra 81% i HT-29 celler (range 54,9% - 93.2%, og n = 5) til 81% (range 63.51% - 92.87%, n = 6) og 91% (spænder 84,7-95.3%, n = 6) i LNCaP og VCaP celler, henholdsvis. På samme måde, inddrivelse af fritliggende celler varierer mellem cellelinjer: en gennemsnitlig 28% af fritliggende HT-29 celler blev inddrevet af cytocentrifugation. Mens genfindingsprocenten for LNCaP var lavere end 10%, var den gennemsnitlige genfindelse sats for VCaP celler 55%.
Ca. 75% af enkelt celler udsat for WGA udbyttet høj kvalitet WGA produkter: Dette er 1) udstrygningspræparat af WGA produkter lige fra 0,1 til > 1 kb (figur 4, top panel) og 2) tre eller fire bands i 4plex kvalitet styre PCR (figur 4, nederste panel) . WGA produkter kan bruges til 1) array-CGH profilering opfylder kvalitetskriterierne for encellede array-CGH profiler 6,7 og 2) målrettet NGS efter fornyet forstærkning WGA 7.
Figur 1: arbejdsproces til isolering og inddrive målceller for enkelt-celle analyse. (A) celler er kulturperler til 90% confluency og (B) høstet for at få en enkelt celle suspension. Efter farvning med CFSE og nukleinsyre pletten, (C) den functionalized ledning er inkuberes med celler i et volumen på 5 mL ved hjælp af reaktion rør eller i en lav lydstyrke ved hjælp af en Pasteur pipette tip. Sidstnævnte giver mulighed for anvendelse af celle suspension diskenheder fra så lavt som 15 µL. (D) celler skal være fritliggende inden for 4 timer efter opladning. Derfor, ledningen er placeret i et 1,5 mL reaktion rør fyldt med udgivelsen buffer. Efter 15 min inkubation på en rocker og 10 min centrifugering, wiren er fjernet og cellesuspension centrifugeres for at sammenpresse cellerne. (E) gendannet celler er enten overført til et glas dias for enkelt-celle micromanipulation (øverst) eller cytocentrifuged på en membran-belagt slide og videresendt til laser microdissection (nederst). (F) endelig høstede enkelt celler forstærkes gennem hele genom forstærkning (WGA). WGA-produkter er kompatible med array-CGH og målrettede NGS downstream analyse. EpCAM epitop: grøn cirkel på cellens overflade. Functionalized wire: enhed, grå triple-cylindriske ledninger. Polymer: lilla linjer. Anti-EpCAM antistoffer: orange. Frigive buffer aktivitet: rød pil. Fedt markør til at holde cellesuspension på plads: mørk blå ellipse. Genvundet cellesuspension: lys blå. Kapillar for micromanipulation: sort linje. Forstørrelse: gendannede cellen høstet af micromanipulation, cytospin på membran-dækket skub indeholdende gendannede celler (grå udfyldt ellipse). Forstørrelse: gendannede celle bliver laser microdissected (grå cirkulær linje: membran fra membran dias tjener som rygraden for laser microdissection), objektiv med laserstråle (blå linje nærmer membran dias fra neden). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: visualisere mærkede celler. (A, E) Celler før opladning: celler er mærket med CFSE og counterstained med en DNA intercalating farvestof viser et udvalg af CFSE (grøn) signal intensitet. (B,F) Mærkede celler fanget på wiren. (C,G) Wire efter celle-udstationering procedure. (D,H) Celler løsrevet fra wire og inddrives af cytocentrifugation på et dias. CFSE: FITC kanal (grøn). DNA pletten: DAPI kanal (blå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Wire og opbevaring rum. (A) rum af wiren. (B) udsnit af den functionalized del. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: kvalitetskontrol af WGA produkter fremstillet af enkelt micromanipulated celler. Toppanelet: WGA produkter fremstillet af enkelt celler typisk resultat i DNA udstrygningspræparater spænder fra 0,2 kb til > 1.0 kb med en maksimal intensitet på ca 0.5 kb. Prøver nummer 1, 7 og 13 (vises med stjerner) Vis suboptimal eller ingen DNA udstrygninger. Bundpanelet: WGA produkter er af tilstrækkelig kvalitet, hvis 4plex PCR udbytter tre eller fire af fire PCR produkter (på 100, 200, 300 og 400 bp). Prøver 1, 7, 10 og 13 Vis færre end tre bands og ville blive udelukket fra videre analyse. Lane Møller indeholder en 100 bp-stige og stjerner angiver prøver af utilstrækkelig WGA produktkvalitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Primer sekvens | BEMÆRK |
| 5 '-gtt cca ata tga ttc cac cc-3′ | 100 bp fremad primer |
| 5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3′ | 100 bp omvendt primer |
| 5 '-agg tgg agc gag gct agc-3 ' | 200 bp fremad primer |
| 5 '-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3′ | 200 bp omvendt primer |
| 5 '-agg tga gac att ctt gct gg-3′ | 300 bp fremad primer |
| 5 '-tcc handle aac cag tca gcg tc-3 ' | 300 bp omvendt primer |
| 5 '-aca gtc kat gcc atc act gc-3′ | 400 bp fremad primer |
| 5 '-gct tga caa agt ggt KBRT tg-3′ | 400 bp omvendt primer |
Tabel 1: Primer sekvenser for 4plex kvalitetskontrol PCR
Discussion
Den beskrevne protokollen tager sigte på hentning af celler fra en functionalized wire (benævnt enhed) til ex vivo encellede genomisk analyse. Vi testede tre EpCAM-positive cellelinjer (HT-29, LNCaP og VCaP), men i princippet, denne metode kan anvendes til enhver cellelinje at udtrykke EpCAM. EpCAM-positive target-cellerne kan forelægges enhed som ren cellesuspension (Se 2.1.) eller blandet i et overskud af baggrunden celler (fx. perifere blod, se 2.2.). Især sidstnævnte kan anvendes til at teste isolation kapacitet sjældne celle betingelser, finjustering af antallet celler knyttet til wire kan gøres ved hjælp af den beskrevne lav-volumen tilgang (se punkt 2.3.). Da forskellene mellem cellelinjer forventes, hastighed egnet celle tætheder for opladning wire, rotation såvel som inkubationstiden skal afprøves empirisk ved at vurdere antallet af tilknyttede celler ved hjælp af en immunofluorescens mikroskop.
For genomisk downstream programmer på én celle niveau WGA, er påkrævet. WGA metoden variere mellem labs, og i princippet vores metode er åben for alle metoder end kan håndtere prøver fra micromanipulation eller laser microdissection. I denne protokol bruger vi en metode baseret på enzymatisk fragmenterede DNA på grund af en bedre ydeevne sammenlignet med en varme-fragmentering baseret WGA7. Valgfri, enkelt celler kan videresendes til isotermisk WGA giver mulighed for efterfølgende DNA profilering20,21.
Beskrevet protokollen tager sigte på at inddrive intakt celler efter at være knyttet til en ny generation af functionalized ledninger for genomisk encellede analyse. Den første generation af functionalized ledninger, som også repræsenterer kun CE-godkendt i vivo berigelse enheder på markedet indtil videre, blev brugt til optælling af CTCs i spredt sig i kroppen kræftpatienter. Tidligere publikationer og vores egne data tyder i vivo isolation teknik for at være mere følsom i forhold til den nuværende guld standard teknologi2. Således tillader udstyre denne i vivo isolation teknik med en funktion til dokumentgendannelse, som realiseret i enheden kombinerer høj CTC opsving med karakterisering på én celle-niveau.
Men enheden er ikke blevet godkendt til brug hos patienter, således kliniske data er ikke tilgængelige. Ex vivo applikationer (dvs isolere CTCs fra perifert blod efter prøvetagning) ikke anbefales som teknologien er tilpasset til de indstillinger, der er til stede i kubiske forgæves, fx lave diameteren af den forfængelige (øge sandsynligheden for direkte kontakt mellem CTCs og fange antistoffer) og lang opholdstid (30 min, så 2-3 L blod til at passere ledningen). Men som beskrevet i afsnit 2.2. target-cellerne kan også isoleres fra blandet prøver7.
En nuværende begrænsning af metoden er ineffektiv inddrivelse af optagne celler efter løsrivelse fra ledningerne. Dette, kan imidlertid forbedres ved en celle fiksering skridt før udstationering behandling.
I Resumé er denne protokol et første skridt mod den kombinerede brug af en i vivo isolation teknik med celle opsving for genetisk karakterisering af enkelt celler. Yderligere indsats at løse optimering af celle opsving og regnskabsafslutning for dens anvendelse i patienter1,2. Personlig medicin til behandling overvågning og terapi afgørelser er dog ud over optælling af CTCs. Således, denne metode er et første skridt i retning af genomisk CTC karakterisering på det enkelte celle niveau.
Programmer mod encellede transkriptom analyse synes muligt som intakt celler er høstet. Det er imidlertid vurderes, om proceduren for inddrive indvirker på RNA integritet (f.eks. forwarding gendannede enkelt celler til direkte lysis efterfulgt af RT-qPCR22). Hvis det lykkes, kan karakterisering af enkelt celler (f.eks. CTCs) være flyttet til transkriptom niveau, giver mulighed for mere detaljerede analyser. I denne henseende, RNA-seq ved hjælp af Smart-seq2 giver et værdifuldt redskab for RNA downstream analyse af enkelt celler som den preamplified cDNA (opnået under RNA-seq bibliotek forberedelse) kan blive udsat for kvantitativ PCR. Dette vil give mulighed for en kombineret mål og screening-baseret analyse af enkelt gendannede celler22,23.
De nuværende functionalized ledninger er baseret på anti-EpCAM antistoffer, som er udbredte epitelial markør for positiv markering af CTCs24. Som flere CTCs kan nedregulere epitelial markører som cytokeratins eller EpCAM25, ville tilføje antistoffer som HER2/nye øge chancen for CTC isolation. Flere antistof baseret berigelse strategier er blevet udviklet og gennemgået af Ferreira mfl. i 201626. En blanding af antistoffer immobiliseret på en wire kunne være en fremtidig forbedring af teknologi fører til isolering af et højere tal og flere undertyper af CTCs.
Det er obligatorisk for alle skridt involverer wire håndtering for at holde den funktionelle del af wiren neddykket i løsning for at opretholde dens funktionalitet. Vi anbefaler for at placere ledningen i 1 x PBS under evaluering (mikroskop; fx. trin 3.1. -3.3.) og opbevaring. For at undgå upassende farvning, anbefaler vi brug af frisk tilberedt Farvningsopløsningen i trin 1.2.1. og 1.2.2. Svagt farvede celler hæmmer celle tælle på ledningen og kan føre til undervurderingen af de tilknyttede celler.
Det er nødvendigt at undgå plugging Pasteur pipette med en gummihætte, når du indsætter wiren i Pasteur pipette til senere indlæsning af cellesuspension (trin 2.3.4.). Gummihætte bruges til at holde wiren på plads, så at den funktionelle del er beliggende inde i spidsen af Pasteur pipette. Hvis fælles landbrugspolitik er alt for fast tilknyttet den bageste del af Pasteur pipette, er indlæsning af cellesuspension ikke muligt. I dette tilfælde lette fælles landbrugspolitik, således at den luft, der er fordrevet af de indlæste cellesuspension kan forlade pipetten.
Bøje wiren er afgørende for dets orientering under cellen optælling i trin 3.2. og 3.3. Monter ledningerne ved hjælp af selvklæbende tape, sådan at de ikke-funktionelle ende af wiren kommer til at ligge til den ene side. Efter scanning af hele længden af den funktionelle del, kastes wiren 180°, så anden halvdelen af den funktionelle wire kan scannes. Dette trin er vigtigt for indledende forsøg at vurdere antallet af celler på wiren. Når antallet af celler for en bestemt cellelinje og proceduren er evalueret, proceduren kan gentages uden celle tælle (f.eks. kun kontrol for tilstedeværelse af celler eller udelade dette trin). Omhyggelig pipettering er afgørende for at undgå celletab når man skal reducere mængden af supernatanten taktfast 4.8. Sørg for pipettering sker gnidningsløst uden forårsager turbulens til pellet.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev finansieret af østrigske videnskab fond (FWF), projekt nr. I 1220-B19 (til PS) som en del af projektets ERA i translationel kræft forskning (TRANSCAN) "Circulating tumorceller som biomarkør for Minimal Residual sygdom i Prostata Cancer (CTC-SCAN)". Ph.d.-kandidat S.C. blev uddannet inden for rammen af ph.d.-programmet Molekylær medicin på det medicinske universitet i Graz. Forfatterne parlamentsarbejdet Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz og Johanna Schiller for deres ekspert teknisk bistand. Forfatterne vil gerne takke Georg Peinhaupt understøttelse af grafisk design.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
| McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
| Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
| Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
| Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
| 50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
| Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
| Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
| Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
| Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
| MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
| Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
| Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
| Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
| Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
| Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
| Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
| Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
| Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
| Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
| Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
| 0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
| Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
| Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
| Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
| MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
| Standard PCR reagents | |||
| 6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
| DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
| Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |
References
- Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
- Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
- Kuske, A., et al. Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients. Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).
- van Beers, E. H., et al. A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples. Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).
- El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA. Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).
- Möhlendick, B., et al. A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH. PLoS ONE. 8 (6), e67031 (2013).
- Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci Rep-UK. 7, 43424 (2017).
- Zhang, H., et al. Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck. Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).
- Carter, L., et al. Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer. Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).
- Luca, F. D., et al. Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer. Oncotarget. , (2016).
- Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection. Cell. 168 (4), 571-574 (2017).
- Page, K., et al. Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer. Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).
- Kalinich, M., et al. An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma. P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).
- Gorges, T. M., et al. Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells. Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).
- Sinkala, E., et al. Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting. Nat Commun. 8, 14622 (2017).
- Morrow, C. J., et al. Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study. Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).
- Williamson, S. C., et al. Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer. Nat Commun. 7, 13322 (2016).
- Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM. Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).
- Czyż, Z. T., Klein, C. A. Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells. Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).
- Kroneis, T., et al. Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR. J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).
- Kroneis, T., et al. Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification. Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).
- Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification. Sci Rep-UK. 7, 45219 (2017).
- Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. Potential and Challenges of Liquid Biopsies. Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).
- Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. Circulating tumor cell technologies. Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).
