Summary
Detta protokoll är att återhämta sig och förbereda sällsynta målceller från en blandning med icke-målorganismer bakgrund celler för molekylär genetisk karakterisering på enskild cell nivå. DNA kvalitet är lika med icke-behandlade enstaka celler och möjliggör encelliga ansökan (båda screening baserat och riktad analys).
Abstract
Sällsynt målceller kan isoleras från en hög bakgrund av icke-målarter celler med antikroppar som är specifika för ytbehandlaproteinerna av målceller. En nyligen utvecklad metod använder en medicinsk tråd functionalized med anti epitelial cell adhesion molekyl (EpCAM) antikroppar i vivo isolering av cirkulerande tumör celler (CTCs)1. En patient-matchat kohort i icke-metastaserande prostatacancer visade att isolering i vivo tekniken resulterade i en högre procentandel av patienter som är positiva för CTCs samt högre CTC räknas jämfört med nuvarande guldmyntfoten i CTC uppräkning. Som cellerna inte kan återställas från nuvarande medicinska enheter, tillverkades en ny functionalized tråd (kallas enhet) så att fånga och efterföljande avlossning cellintervall genom enzymatisk behandling. Celler tillåts att ansluta till enheten, visualiseras på ett mikroskop och fristående med enzymatisk behandling. Återvunna celler cytocentrifuged på membran-belagd diabilder och skördas individuellt med hjälp av laser lokalt eller mikromanipulation. Enskild cell prover utsätts sedan för encelliga hela genomet förstärkning så att flera efterföljande analys inklusive screening och target-specifika strategier. Förfarandet för isolering och återhämtning ger hög kvalitet DNA från enstaka celler och försämra inte efterföljande hela genomet amplifiering (WGA). En enda cell amplifierade DNA kan vidarebefordras till screening och/eller riktad analys såsom array jämförande genomet hybridisering (array-CGH) eller sekvensering. Enheten tillåter ex vivo isolering från konstgjorda ovanlig cellprover (dvs. 500 målceller spetsade in 5 mL av perifert blod). Medan avlossning av celler är acceptabel (50-90%), återvinningsgraden av fristående celler på diabilder spänner över ett brett sortiment som är beroende av den cellinje som används (< 10 - > 50%) och behöver några ytterligare uppmärksamhet. Denna enhet rensas inte för användning till patienter.
Introduction
Nyligen lades CellCollector DC01, en medicinsk tråd functionalized med anti-EpCAM antikroppar för att isolera CTCs från perifert blod av cancerpatienter, till metodiskt spectrumen av CTC uppräkning1,2,3 . I en pågående studie med icke-metastaserande prostatacancer, denna functionalized tråd rapporterar nästan dubbelt så många patienter att vara CTC-positiv och högre CTC räknar i CTC-positiva patienter jämfört med CellSearch, guldmyntfoten i CTC uppräkning3 . På grund av detta uppmuntrande resultat, isolering av celler från en functionalized medicinsk tråd för encelliga analys vore önskvärt, men varken enzymatisk behandling med cell avlossning lösningar (t.ex. trypsin) eller laser lokalt tillåter återvinning av intakta celler (inga data anges).
För att möjliggöra avskildheten av fångade celler, var en ny generation av functionalized ledningar utrustad med en specifik polymer. Denna polymer, som länkar de fånga antikropparna till tråd, är mottagliga för en release buffert behandling möjliggör avlossning av intakta celler (CellCollector DC03 kallas enhet). Den nya functionalized enheten, kan isolering av målceller från olika koncentrationer av cancerceller cell linje spetsade in bovint serumalbumin (BSA) / fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och perifert blod, respektive.
För att lindra visuell upptäckt av celler på enheten och efter återhämtning, mål cancercellerna är märkta med carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) och en DNA fläcken innan den återhämtar sig behandlingen (dvs. laddning och ta loss). Behandlingens effekter på DNA kvaliteten på enstaka celler har tidigare utvärderats efter WGA med hjälp av en kvalitetskontroll PCR-4,5, array-CGH6,7 och riktade sekvensering7 visar ingen skillnad jämfört med icke-behandlade celler micromanipulated från cell suspensioner7. Fördelen med denna metod ligger i kombinationen av sällsynta målcellen före berikning och återvinning av celler för encelliga nedströms analys (figur 1). Den aktuella CE-märkt i vivo samling enheten används i allmänhet för uppräkning av CTCs istället för encelliga molekylär karakterisering2,8. Dock mer omfattande analys för att undersöka heterogenitet bland CTCs länge för analys på enskild cellnivå (dvs. riktade sekvensering på enskild cell nivå). Andra cellbaserade metoder baseras på immunmagnetisk isolering av EpCAM-positiva CTCs och encelliga hantering utifrån dielectrophoresis för efterföljande molekylära genetiska analyser9,10. Molekylär karakterisering av CTCs är en viktig förutsättning för deras användbara genomförande i en klinisk miljö och är lika viktigt i grundforskning i metastaserande kaskad. Parallellt till CTCs har cirkulerande tumör DNA (ctDNA) blivit av stor betydelse eftersom det tillåter DNA-analys av tumören bördan med minimal teknisk isolering förfaranden11,12. De cellbaserade metoderna kan fungera som ett kompletterande bidrag eftersom det ger RNA13,14 och protein15 uttryck analys och även för CTC härleds cell kulturer eller xenograft16, 17. även om hinder såsom lågt återhämtning och clearance för användning hos patienter fortfarande behöver övervinnas, fånga och släpp metoden tar ett viktigt nästa steg mot karakterisering av sällsynta målceller.
Protocol
Alla förfaranden har godkänts av den etiska kommittén av medicinska universitetet i Graz (25-240 ex 12/13). Perifert blod för tillsatta experiment samplades från friska individer.
Obs: Det här protokollet beskriver isolering av HT-29 celler (mänskliga kolon cancer cell linje) från PBS eller konstgjorda blandningar av HT-29 celler och perifert blod. Samma experiment utfördes med två ytterligare cellinjer (LNCaP och VCaP, experimentella data i representativa resultat) och kan teoretiskt utföras med alla celler som uttrycker EpCAM.
1. beredning av målceller
- Cellodling och märkning av celler
Obs: I detta protokoll, celler odlas i 75 cm² kultur kolvar. Vänligen justera beloppen för reagenser om andra cell kultur enheter används (t.ex. 25 cm² kultur rätter, 6-väl tallrikar, etc.). Alla vätskor som används värms före till 37 ° C i ett vattenbad. Om inte annat anges, utförs alla protokoll steg vid rumstemperatur (RT).- Kultur HT-29 celler i McCoys 5a modifierade Medium kompletteras med 2 mM L-glutamin, 20 mM Hepes, 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär.
- När cellerna är 90% konfluenta, avlägsna mediet och skölj cellerna med 10 mL 1 x PBS.
- För att skörda celler, tillsätt 2 mL av cell avlossning lösningen (tabell av material och reagens) till cellerna och inkubera cellerna under cirka 5 minuter vid 37 ° C.
Obs: Avlossning lösningen innehåller proteolytiska och collagenolytic enzymer i 1 x PBS, 0,5 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) och 3 mg/L fenolrött. Minska före uppvärmningen tiden av cell avlossning lösningen till ett minimum eftersom detta kommer att vara inaktiv efter 1 h vid 37 ° C. Täcka hela cellen lagret för att få optimal cell avlossning. - Kontrollera avskildheten av celler med ett inverterat Mikroskop.
- Överföra alla fristående celler till en 50 mL tub förfyllda med 10 mL cellodlingsmedium (samma som används i steg 1.1.1.) och resuspendera cellerna genom pipettering.
- Placera de återstående cellsuspensionen på en horisontell rulle mixer på RT och vidare till märkning steg.
- Levande cellen märkning av målceller
- Späd 1 µL 5 mM CFSE (medföljer i dimetyl sulfoxid, DMSO) i 1 mL 1 x PBS värmas före vid 37 ° C att skaffa 5 µM ready-to-use CFSE märkning lösning.
Obs: Använd nyberedda lösningar för optimal färgning resultat. - Förbereda en ready-to-use DNA färglösningen (tabell av material och reagens) i 1 x PBS och lagra vid 2-6 ° C skyddas från ljus.
Obs: Använd nyberedda lösningar för optimal färgning resultat. - Få celler från horisontell rulle mixer (steg 1.1.6.) och pellet cellerna vid 300 x g i 10 min. ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 mL 1 x PBS.
- Skölj cellerna igen med 1 x PBS och återsuspendera cellpelleten i 500 µL ready-to-use CFSE märkning lösning.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i 15 min och samla cellerna efter centrifugering vid 300 x g i 3 min.
- Resuspendera märkta cellerna i 1 mL av pre värmde cellodlingsmedium och låta celler att regenerera vid 37 ° C i 30 min.
- Skörda cellerna genom centrifugering vid 300 x g i 3 min och resuspendera cell pellets i 1 mL klar att använda DNA färgning lösning vid 37 ° C i 10 min.
- Pellet cellerna, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 4 mL 1 x PBS. Bedöma cell densiteten med hjälp av en hemocytometer och kontrollera för fluorescens märkning med fluorescens Mikroskop utrustade med 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) och fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) filter (figur 2A och 2E).
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 3 min och resuspendera cellpelleten enligt cell tätheterna behövs för respektive experimentet som ges i nästa avsnitt och plats på is.
- Späd 1 µL 5 mM CFSE (medföljer i dimetyl sulfoxid, DMSO) i 1 mL 1 x PBS värmas före vid 37 ° C att skaffa 5 µM ready-to-use CFSE märkning lösning.
2. laddning av tråd
Obs: Celler kan isoleras från målet cellen/perifera blod spikings i milliliter skala eller genom att ge låga antalet celler i mikroliter skala. Medan den tidigare metoden tillåter för att imitera sällsynta-cell villkoret i perifert blod, kan det senare vara det bästa sättet att fästa några celler i syfte att protokollet optimering/testning.
- Laddning tråd med hjälp av en stor volym av cellsuspensioner
- Förbereda en 2% BSA blockerar lösning genom att lösa upp 0,8 gram BSA i 40 mL 1 x PBS (cell kultur använder). Lös upp BSA genom inledande vortexa och efterföljande inkubation vid RT på en horisontell rulle mixer för 10-20 min.
- Skölj tomma EDTA-rör, natrium heparin rör med 2 mL 2% BSA att avlägsna blodförtunnande rester och kassera lösningen. Blockera om röret genom inkubation vid RT med 5 mL av 2% BSA på en horisontell rulle mixer på 15 rpm i 30 min och kassera lösningen.
- Späd märkta celler (avsnitt 1.2) till en densitet på 100 000 celler/mL och Använd 5 mL för att debitera tråd.
- Tillsätt 5 mL av den märkta cellsuspensionen (500 000 celler i totalt) till röret. Undvik bubblor när du lägger till cellsuspension.
- Ta bort kabeln från förvaringsutrymmet samt gummi locket håller tråden och skölj den i 1 x PBS (figur 3).
- Penetrera gummi tube jordbrukspolitik i EDTA-rör (steg 2.1.4.) med hjälp av en spruta nål (20G) och trä in tråden så att den funktionella delen är helt nedsänkt i cellsuspensionen när locket tillbaka på röret och röret placeras på lutande rullen mixern.
Obs: De triple-spiralformade funktionell del av tråden bör täckas med cellsuspension i hela laddningen. - Rotera rören på en lutande rullen mixer på 5 varv i 30 min så att cellerna att bifoga till tråd.
- Skölj tråd med 5 mL 1 x PBS och lagra den i mörker vid 2-6 ° C i en 15 mL tub som innehåller 1 x PBS förrän okulärbesiktning.
Obs: Den funktionella delen av kabeln måste alltid vara nersänkt i PBS att undvika att skada cellerna.
- Isolera målceller från konstgjorda blandningar med perifert blod (alternativ laddning metod till: 2.1. Ladda tråd med hjälp av en stor volym av cellsuspensioner)
- Späd märkta celler (avsnitt 1.2) för att erhålla cellsuspensioner med hög cell densiteten (> 1 000 000 unika celler/mL), och därmed hålla volymen av cellsuspensionen tillsätts perifert blod låg.
- Tillsätt 500 till 500 000 celler till 5 mL av perifert blod och blanda dem genom att vända tuben.
- Ta bort kabeln från förvaringsutrymmet, ta bort gummi locket håller tråden och skölj den i 1 x PBS.
- Penetrera en ny tube-mössa med icke-funktionella delen av enheten med en sprutans nål (20G) sådan att den funktionella delen är helt nedsänkt i spetsiga blodet när locket tillbaka på röret och röret placeras på lutande rullen mixern.
Obs: De triple-spiralformade funktionell del av tråden bör täckas med cellsuspension i hela laddningen. - Inkubera röret på lutande rullen mixern på 5 varv för 30 min vid RT.
- Skölj tråd 3 gånger i 1 x PBS och lagra den i mörker i en 15 mL tub som innehåller 1 x PBS förrän okulärbesiktning.
Obs: Den funktionella delen av kabeln måste alltid vara nersänkt för att undvika att skada cellerna.
- Laddning ledningen låg volym cellsuspensioner (alternativ laddning metod till: 2.1. Ladda tråd med hjälp av en stor volym av cellsuspensioner)
- Att resuspendera märkta cellerna på 1 000 000 unika celler/mL i 1 x PBS.
- Fixa en 150 mm engångsglas Pasteur-pipett horisontellt på ett galler.
- Ta bort kabeln från förvaringsutrymmet men förvara gul gummi locket håller tråden.
- Placera tråden i pipetten så att den functionalized delen ligger i spetsen av Pasteur pipetten inte röra glaset.
Obs: Spetsen av tråden bör inte sticka av Pasteur pipettspetsen. Undvika att ansluta bakkanten av Pasteur pipettspetsen med gummi locket håller tråden. Om fäst tight, kan inte cellsuspensioner läsas från den andra sidan in i pipettspetsen. - Läsa in 15 µL av cellsuspensionen i spetsen av den Pasteur-pipett som täcker den functionalized delen av tråden.
- Inkubera tråd för 10 min. manuellt kvart-sväng monterade tråd/Pasteur pipettspetsen varje minut.
- Ta bort kabeln från Pasteur pipettspetsen, skölj den i 5 mL 1 x PBS och lagra den i mörker vid 2-6 ° C i en 15 mL tub som innehåller 1 x PBS förrän okulärbesiktning.
Obs: Den funktionella delen måste alltid vara nedsänkt i 1 x PBS att undvika att skada cellerna.
3. räkna celler på tråd
Obs: Alltid hålla den funktionella delen av tråden nedsänkt i 1 x PBS att undvika att skada cellerna.
- Använda en fett penna för att rita en rektangel område på en glasskiva och tillsätt 500 µL av 1 x PBS.
- Böj den icke-funktionella delen av kabeln och placera det i glas-bilden så att den funktionella delen är nedsänkt i 1 x PBS.
Obs: Passa området av rektangeln och volym 1 x PBS att helt täcka den funktionella delen av tråden. Använd en double-faced tejp för att montera den icke-funktionella delen av tråden på bilden. - Inspektera båda sidor av tråd att räkna upp de infångade cellerna (figur 2B och 2F).
Obs: Närvaron av celler bestäms med fluorescens Mikroskop utrustat med filter för DAPI och FITC. Båda sidor av tråd kan inspekteras och antalet celler antingen bedömts (för hög cell nummer) eller räknas (endast möjligt om det låga antalet celler bifogas till tråd). Detta steg kan hoppas över om uppräkning av celler inte är nödvändigt. - Efter skanning, placera tråden tillbaka i 15 mL röret som innehåller 1 x PBS (se anmärkning av 2.3.6. och avsnitt 3.), lagra den tråden i mörkret.
Obs: De flesta av de icke-funktionella delen av kabeln kan klippas (inklusive böj) och bort lättnader lagring.
4. lösgörande och återvinning av målceller
Obs: Avlossning av cellerna ska ske inom 4 h efter isolering.
- Lös 4 mg komponenten release buffert (tabell av material och reagens) per mL 1 x PBS och filtrera lösningen genom ett 0,2 µm sterila filter att få redo att använda bufferten.
Obs: Polymeren av tråden består av en hydrogel som är functionalized med anti-EpCAM-antikroppar som möjliggör bindning till EpCAM-presenterande målceller. Release bufferten innehåller ett kol och syre proteolytiska enzym kan klyva hydrogel. Proteolytisk klyvning resulterar i nedbrytning av polymeren och därmed avlossning av fångade celler. - Pre varma release bufferten vid 37 ° C i 5 min.
- Tillsätt 1,6 mL release buffert att fylla en 1,5 mL reaktionsröret.
Obs: Tuber avsedda för 1,5 mL reaktion volymer tillåter tillämpning av 1,6 mL vilket är nödvändigt för att dränka den funktionella delen av tråden. - Inkubera den funktionella delen av kabeln i release bufferten vid 37 ° C (vattenbad) för 20 min. Använd gummi locket skickat med tråd i stället för den gemensamma jordbrukspolitiken tube fixar tråden i 1,5 mL röret för att undvika kontaminering under inkubation i vattenbadet.
- Överföra den tråd/tube församlingen till en shaker på RT och 500 rpm i 15 min.
Obs: Shakern har en omloppsbana på 1,5 mm. - Placera den tråd/tube församlingen i en centrifug och spinna vid 300 x g i 10 min.
- Ta bort kabeln från röret, Stäng locket och centrifugera röret igen vid 300 x g i 10 min.
Obs: Tråden kan lagras i 1 x PBS på 2-6 ° C i mörker för cell inventering för att bedöma avlossning effektivitet/kontrollera för celler kvar på linan. - För att minska volymen av cellsuspensionen, ta bort alla utom 100 µL (mikromanipulation) eller alternativt 300 µL (cytocentrifugation och efterföljande laser lokalt) av supernatanten och genast fortsätta till enskild cell provtagning.
5. single-cell provtagning
- Mikromanipulation
Obs: Enstaka celler kommer att läggas till 2 µL av cell lysis huvudmixen tillåta WGA. Förbereda huvudmixen enligt antalet celler att bearbetas, beräkna extra volymer för förlust på grund av pipettering och plats cell lysis master mix på is.- Förbereda cell lysis huvudmixen (komponenter av WGA-kit, tabell för material och reagenser) enligt protokollet beskrivs av Czyż et al18. Kort, blanda 2.0 µL av reaktion buffert, 1.3 µL av octylphenoxypolyethoxyethanol (10% lösning), 1.3 µL av 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) fenyl-polyetylenglykol (10% lösning), 2.6 µL av en proteinas K lösning och 12,8 µL RNase/DNAS-fritt vatten för att få en Master mix för 10 prover (total volym 20 µL).
Obs: För mer prover, öka volymerna med detta. Sammansättningen av cell lysis huvudmixen skiljer sig från den som används i den alternativa proceduren använder laser lokalt prover (se 5.2.). - Använd en fett penna för att rita ett område som håller cellsuspension på plats. Justera området och volym om cell densiteten är för hög (dvs. Markera ett större område på en glasskiva, lasta 1 x PBS och en alikvot av cellsuspensionen).
- Pipettera hela färgade cellsuspensionen (erhålls i steg 4.8.) på en glasskiva.
- Överföra glasskiva till ett mikroskop som är utrustat med en micromanipulator. Låt cellerna nöja sig med 5 min (figur 2D och 2 H).
- Förbereda 0,2 mL PCR-rören laddad med 2.0 µL av cell lysis master mix (se punkt 5.1.1.) och lagra den på isen.
- Samla in enstaka celler i 1 µL 1 x PBS använder micromanipulator och överföra cellerna i ett rör som innehåller cell lysis huvudmixen.
Obs: För att överföra micromanipulated celler in i cell lysis bufferten placera kapillären direkt i de 2 µL lysis lösning och mata ut tills bubblor kan ses. - Kort snurra ner provet vid 2000 x g i 3 s med en stationär microfuge för att samla all vätska på botten av röret. Placera proverna på is.
- Direkt vidare till encelliga WGA (se avsnitt 6. och Czyż o.a. ( 19).
- Förbereda cell lysis huvudmixen (komponenter av WGA-kit, tabell för material och reagenser) enligt protokollet beskrivs av Czyż et al18. Kort, blanda 2.0 µL av reaktion buffert, 1.3 µL av octylphenoxypolyethoxyethanol (10% lösning), 1.3 µL av 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) fenyl-polyetylenglykol (10% lösning), 2.6 µL av en proteinas K lösning och 12,8 µL RNase/DNAS-fritt vatten för att få en Master mix för 10 prover (total volym 20 µL).
- Laser lokalt (alternativa encelliga urvalsmetoden till: 5.1. Mikromanipulation)
Obs: Sammansättningen av huvudmixen används i detta avsnitt skiljer sig från den som används i avsnitt 5.1 för mikromanipulation. Enstaka celler kommer att läggas till 4,5 µL av cell lysis master mix (komponenter av WGA-kit, tabell för material och reagenser) för WGA.- Förbereda cell lysis huvudmixen enligt Czyż o.a. 19 genom att blanda 5.0 µL av reaktion buffert, 1.3 µL av octylphenoxypolyethoxyethanol (10% lösning), 1.3 µL av 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) fenyl-polyetylenglykol (10% lösning), resp., 2.6 µL av en proteinas K lösning och 34,8 µL av RNase / DNAS-fritt vatten för att få en master mix för 10 prover (total volym 45 µL). Placera huvudmixen på is.
Obs: För mer prover, öka volymerna med detta. - UV-treat membran-belagd bilder passar laser lokalt. Därför placera glasen i en DNA cross linker enheten och utsätt för högsta UV i ca 10 min.
- Montera den membran-belagd bilden i en cytocentrifuge och cytospin hela cellsuspension vid 300 x g i 5 min.
Obs: När du använder ett i-flytande system, där cellerna är cytocentrifuged in i bilden i lösning, avlägsna supernatanten efter cytocentrifugation och tillämpa en torr-spin vid 1140 x g i 1 min. - Direkt vidare till laser lokalt eller låt cytospins lufttorka övernattning och frysa proverna vid-20 ° C för långtidsförvaring.
- Pipettera 4,5 µL av cell lysis master mix i den gemensamma jordbrukspolitiken av en 0,2 mL PCR-rör och skörda enstaka celler med hjälp av laser lokalt.
- Hämta PCR-röret från mikroskopet laser lokalt och nära röret. Samla all vätska på botten av röret genom kort-spin och placera provet på is.
- Fortsätt med encelliga WGA eller lagra de isolerade proverna vid-80 ° C i upp till 1 månad innan vidare behandling.
- Förbereda cell lysis huvudmixen enligt Czyż o.a. 19 genom att blanda 5.0 µL av reaktion buffert, 1.3 µL av octylphenoxypolyethoxyethanol (10% lösning), 1.3 µL av 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) fenyl-polyetylenglykol (10% lösning), resp., 2.6 µL av en proteinas K lösning och 34,8 µL av RNase / DNAS-fritt vatten för att få en master mix för 10 prover (total volym 45 µL). Placera huvudmixen på is.
6. adapter-linker baserat hela genomet förstärkning 18,19
Notera: Se till att alla nödvändiga master mixar (komponenter av WGA-kit, tabell för material och reagenser) är beredd och lagras på isen klar att använda. Master mixar inkluderar DNA matsmältningen mixen 1 för micromanipulated (se 5.1) prover (innehållande 2,0 µL av reaktion buffert, 2.0 µL av Msejag restriktionsenzym och 16,0 µL RNase/DNAS-gratis vatten) eller DNA matsmältningen blanda 2 för laser lokalt (se 5.2). prover (som innehåller 2,5 µL av Msejag restriktionsenzym och 2,5 µL RNase/DNAS-gratis vatten), före glödgning master mix (innehållande 5,0 µL av reaktion buffert, 5.0 µL av varje av de preannealing PCR-adaptrarna och 15,0 µL RNase/DNAS-gratis vatten), ligatur Master mix (som innehåller 30,0 µL av pre glödgad PCR-adaptrar, 10,0 µL adenosintrifosfat lösning och 10,0 µL T4 ligase lösning) och primära PCR master mix (som innehåller 30,0 µL av PCR-buffert, 20,0 µL 10 mM deoxynucleotide mix lösning, 10,0 µL av ett polymeras Mix och 340,0 µL RNase/DNAS-fritt vatten). Alla volymer ges för att förbereda 10 prover. Justera därefter att antalet prover.
- För cellen lysis, placera micromanipulated/laser lokalt proverna i en termocykel och kör single-cell lysis av ruvning cellen vid 42 ° C i 45 min, 65 ° C i 30 min och 80 ° C i 10 min.
Obs: Använd en termocykel med uppvärmd lock. Cellys kan göras O/N för 10 till 15 h. I så fall utelämna INKUBERINGSSTEGET vid 65 ° C. - Kör före glödgning av PCR-adaptrarna. Därför Inkubera före glödgning huvudmixen i en termocykel vid 65 ° C i 1 min följt av ytterligare 49 cykler, 1 min vardera, med successivt minskande temperatur med 1 ° C/cykel. Efter 50 cykler (vid 15 ° C), inkubera huvudmixen vid 15 ° C tills vidare användning.
Obs: Detta steg är nödvändigt för att generera asymmetrisk adaptrar passar ligatur (se steg 6,6.) med encelliga DNA utsätts för Msejag begränsning digest. - Efter cellys, snurra ner lyserat proverna vid 2000 x g i 3 s att samla all vätska i botten och placera den på is.
- För att fragmentera DNA, tillsätt 2 µL DNA matsmältningen mix 1 i varje lyserat micromanipulated prov eller 0,5 µL av DNA matsmältningen blanda 2 till laser lokalt provet och köra begränsning digest. Använd en termocykel med uppvärmd lock vid 37 ° C under 5 minuter följt av ett restriktionsenzym inaktivering steg vid 65 ° C i 5 min.
Obs: Rötning vid 37 ° C kan förlängas till 3h. Detta är det enda protokoll steget skiljer sig mellan prover som erhållits från mikromanipulation och prover som erhållits från laser lokalt. - Snurra ner proverna att samla all vätska i botten och placera den på is.
- För ligating begränsning rötas DNA och pre glödgad adaptrar, tillsätt 5,0 µL av ligering master blanda till varje smält DNA-prov och ligera det i en termocykel vid 15 ° C för 1 h.
Obs: Detta steg kan utökas till 12 h eller utföra O/N. - Snurra ner proverna att samla all vätska i botten och placera den på is.
- För WGA tillsätt 40,0 µL master mix av den primära PCR i varje ligatur och köra WGA i en termocykel med uppvärmd lock som följer: första, inkubera proverna vid 68 ° C för 3 min. Det andra cykel för 15 gånger vid 94 ° C i 40 s, 57 ° C för 30 s och 68 ° C för 1 min 30 s + 1 s/cykel. Lägg sedan till 9 cykler vid 94 ° C i 40 s, 57 ° C + 1 ° C/cykel för 30 s, 68 ° C för 1 min 45 s + 1 s/cykel. Därefter cykel för 23 gånger vid 94 ° C i 40 s, 65 ° C i 30 s, 68 ° C för 1 min 53 s + 1 s/cykel. Slutligen, utföra en sista förlängning vid 68 ° C för 3 min 40 s och chill proven till 4 ° C.
- Snurra ner proverna att samla all vätska på botten och kontrollera DNA kvaliteten eller lagra proverna vid-20 ° C eller -80 ° C för långsiktig lagring.
7. kvalitetskontroll av WGA produkter
Obs: Kontrollera kvaliteten på WGA produkter baserade på spänna av DNA utstryket och antalet förstärkning produkter efter att ha kört en 4plex QC-PCR 5. Köra WGA alikvoter och respektive QC-PCR prov på en 1,0% agarosgel för utvärdering.
- Förbereda 100 µM stamlösningar av alla primers används för 4plex kvalitetskontroll PCR (tabell 1). Tillsätt 8 µL av varje primer till 136.0 µL av PCR-grade vatten att generera 200 µL primer pool. Vortex lösningen för 3 s, snurra den ner vid 2000 x g i 3 s och alikvot 20 µL för lagring vid-20 ° C.
- Använd standard PCR kit att förbereda en multiplex PCR-master mix innehållande 6,0 µL av 2 x PCR komponenter (utom primers), 4,5 µL av PCR-grade vatten och 0,5 µL av primer poolen.
- Tillsätt 1,0 µL av WGA produkter, snurra den ner och köra PCR vid 94 ° C under 2 minuter följt av 35 cykler av denaturering vid 94 ° C i 1 min, primer glödgning vid 56 ° C i 1 min och primer filändelsen vid 72 ° C i 1 min 30 s och en sista förlängning steg vid 72 ° C under 7 min. Chill det till 4 ° C, snurra den ner och placera proverna på is för gel analys samma dag eller vid-20 ° C för senare analys.
Obs: Kylning i termocykel kan utföras vid 12 ° C att öka livslängden av Peltier element. - Analysera WGA (erhålls från 6,8.) och respektive 4plex QC-PCR produkter på en agaros gel5.
Representative Results
Celler efter CFSE och nucleic färgning kan utvärderas med hjälp av ett immunofluorescens Mikroskop utrustat med filter för DAPI och FITC. Atomkärnor presenterar med en ljusa motfärg i DAPI kanalen medan cytoplasman i celler visar enhetlig märkning med CFSE med heterogena mellan cell intensitet (figur 2A och 2E). Liknande form och färgning stödnivåer är förväntat från celler som bifogas tråd (figur 2B och 2F) samt fristående från tråden och återvinns på en bild (figur 2D och 2 H).
Hög cell tätheter (t.ex. > 1 000 000 unika celler/mL) kan leda till total täckning av tråd med celler när laddning trådarna. Dock sänka cell tätheter, förändringar i rotationshastighet under inkuberingen, och användningen av olika cellinjer påverka isolering effektiviteten och måste testas separat. När trådarna inkuberades med 5 mL av HT-29 celler till 100 000 celler / mL som beskrivs i avsnitt 2.1., ett medelvärde på 254 ± 103 celler (n = 5) fångades på trådarna. Med samma experimentera med LNCaP celler, ett medelvärde på 440 ± 319 celler (n = 5) per tråd erhölls.
Presenterande 500, 5 000, och 50 000 HT-29 celler i en bakgrund av 5 mL av perifert blod till ledningar (enligt protokollet avsnitt 2.2.) resulterade i gripandet av 75 ± 18 celler, 25 ± 9 celler och 47 ± 57 celler (n = 3, varje), respektive. Om tråden debiteras med 15 µL cellsuspension (1 000 000 unika celler/mL) enligt protokollet i avsnitt 2.3., upp till 1 000 (HT-29) celler kan bifoga till en tråd.
Cell avlossning effektivitetsvinster varierade från 81% i HT-29 celler (range 54,9% - 93,2% och n = 5) till 81% (intervall 63.51-92,87%, n = 6) och 91% (intervall 84,7% - 95,3%, n = 6) i LNCaP och VCaP celler, respektive. Likaså, återvinning av fristående celler skiljer sig mellan cellinjer: genomsnitt 28% av fristående HT-29 celler var täckta av cytocentrifugation. Återvinningsgraden för LNCaP var lägre än 10%, var den genomsnittliga återhämtningshastigheten för VCaP celler 55%.
Cirka 75% av enstaka celler utsätts för WGA avkastning högkvalitativa WGA produkter: Detta är 1) utstryk av WGA produkter från 0,1 till > 1 kb (figur 4, övre panelen) och (2) tre eller fyra band i 4plex kvalitet kontroll PCR (figur 4, nedre panelen) . WGA produkter kan användas för 1) array-CGH profilering uppfyller kvalitetskriterierna för encelliga array-CGH profiler 6,7 och 2) riktade NGS efter förnyad förstärkning WGA 7.
Figur 1: arbetsflöde för att isolera och återställa målceller för encelliga analys. (A) celler odlas till 90% konfluens och (B) skördas för att erhålla en encellig suspension. Efter färgning med CFSE och nucleic fläcken, (C) functionalized tråd inkuberas i närvaro av cellerna i en volym på 5 mL använda reaktionsrören eller i en låg volym med en Pasteur pipettspetsen. Det senare möjliggör applicering av cell suspension volymer så låg som 15 µL. (D) celler behöver vara fristående inom 4 h efter laddning. Därför placeras tråden i en 1,5 mL reaktionsröret fylld med release buffert. Efter 15 min inkubering på en rocker och 10 min centrifugering, tråden tas bort och cellsuspensionen centrifugeras för att pressa samman cellerna. (E) återvunna celler antingen överförs till en glasskiva för encelliga mikromanipulation (överst) eller cytocentrifuged på ett objektglas med membran-belagda och vidarebefordras för att laser lokalt (nederst). (F) slutligen skördade enstaka celler förökas med hjälp av hela genomet amplifiering (WGA). WGA produkter är kompatibla med array-CGH och riktade NGS nedströms analys. EpCAM epitop: grön cirkel på cellytan. Functionalized tråd: enhet, grå triple-spiralformade ledningar. Polymer: lila linjer. Anti-EpCAM antikroppar: orange. Släppa buffert aktivitet: röd pil. Fett markör att hålla cellsuspension på plats: Mörk blå ellips. Återvunna cellsuspension: ljusblå. Kapillär för mikromanipulation: svart linje. Förstoring: återvunna cell skördas av mikromanipulation, cytospin på membran-täckt Skjut som innehåller återvunna celler (grå fylld ellips). Förstoring: återvunna cell att laser microdissected (grå cirkellinje: membran från membran bild som fungerar som stamnät för laser lokalt), objektiv med laserstråle (blå linje närmar sig i membranet bilden nedan). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: visualisera märkta celler. (A, E) Celler innan laddningen: celler är märkt med CFSE och counterstained med en DNA infoga färgämne som visar ett urval av CFSE (grön) signalintensitet. (B,F) Märkt celler fångas på linan. (C,G) Wire efter cell-avlossning förfarande. (D,H) Celler som lossnat från tråd och återkrävas av cytocentrifugation på ett objektglas. CFSE: FITC kanal (grön). DNA fläcken: DAPI kanal (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Wire och förvaringsfack. (A) fack av tråd. (B) detalj av functionalized delen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: kvalitetskontroll av WGA produkter erhålls från enda micromanipulated celler. Övre panelen: WGA produkter som erhållits från enstaka celler normalt resultat i DNA utstryk alltifrån 0.2 kb till > 1,0 kb med en maximal intensitet på cirka 0,5 kb. Prov nummer 1, 7 och 13 (indikeras med asterisker) Visa suboptimal eller ingen DNA cellprov. Nedre panelen: WGA produkter är av tillräcklig kvalitet om 4plex PCR ger tre eller fyra av fyra PCR-produkter (på 100, 200, 300 och 400 bp). Prov 1, 7, 10 och 13 Visa färre än tre band och skulle undantas från ytterligare analys. Lane M innehåller 100 bp stege och asterisker visar proverna på otillräcklig WGA produktkvalitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Primer sekvens | OBS |
| 5′-gtt cca ata tga ttc cac cc-3′ | 100 bp framåt primer |
| 5′-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3′ | 100 bp reverse primer |
| 5′-agg tgg agc gag gct agc-3′ | 200 bp framåt primer |
| 5′-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3′ | 200 bp reverse primer |
| 5′-agg tga gac att ctt gct gg-3′ | 300 bp framåt primer |
| 5′-tcc agera aac cag tca gcg tc-3′ | 300 bp reverse primer |
| 5′-aca gtc katt gcc atc agera gc-3′ | 400 bp framåt primer |
| 5′-gct tga caa agt ggt cgt tg-3′ | 400 bp reverse primer |
Tabell 1: Primer sekvenser för 4plex kvalitetskontroll PCR
Discussion
Protokollet beskrivs syftar till att hämta celler från en functionalized tråd (kallas enhet) för ex vivo encelliga genomisk analys. Vi testade tre EpCAM-positiva cellinjer (HT-29 LNCaP och VCaP), men i princip denna metod kan tillämpas på någon cellinje som uttrycker EpCAM. EpCAM-positiva målceller kan presenteras för enheten som ren cellsuspension (se 2.1.) eller blandad till ett överskott av bakgrunden celler (t.ex. perifera blod, se 2.2.). Särskilt den senare kan användas för att testa isolering kapacitet ovanlig cell villkor, fininställning av antalet celler som bifogas tråd kan göras med den beskrivna låg volymen närma (se 2.3.). Som skillnader mellan cellinjer kan förväntas, hastighet passande cell densiteter för laddning tråd, rotation samt inkubationstiden behöver testas empiriskt genom att utvärdera antalet bifogade celler använder ett immunofluorescens Mikroskop.
För genomisk nedströms tillämpningar på enskild cell nivå WGA, krävs. Metoden WGA val kan variera mellan labs, och vår metod är i princip öppet för alla metoder än kan hantera produktproverna mikromanipulation eller laser lokalt. I detta protokoll använder vi en metod baserad på enzymatiskt fragmenterade DNA på grund av en bättre prestanda jämfört med en värme-fragmentering baserat WGA7. Tillval, enstaka celler kan vidarebefordras till isotermiska WGA så att efterföljande DNA profilering20,21.
Protokollet beskrivs syftar till att återvinna intakta celler efter att vara ansluten till en ny generation av functionalized ledningar för genomanalys encelliga. Den första generationen av functionalized trådar, som också företräder endast CE-godkända i vivo anrikning enheterna på marknaden hittills, användes för att räkna upp CTCs hos patienter med spridd cancer. Tidigare publikationer och våra egna uppgifter tyder på i vivo isolering tekniken för att vara känsligare jämfört med den nuvarande guldmyntfot teknik2. Således, utrusta denna i vivo isolering teknik med en recovery-funktionen som realiserat i enheten tillåter att kombinera hög CTC återhämtning med karakterisering på enskild cell nivå.
Men enheten rensas inte för användning hos patienter, således kliniska data är inte tillgängliga. Ex vivo applikationer (dvs. isolera CTCs från perifert blod efter provtagningen) rekommenderas inte eftersom tekniken är anpassad till inställningarna som är närvarande i kubiska förgäves, e.g. låg diametern av den fåfänga (ökar sannolikheten för direkt kontakt mellan CTCs och fästande antikroppar) och lång retentionstid (30 min, så att 2-3 L blod att passera tråd). Emellertid, som beskrivs i avsnitt 2.2. målceller kan också isoleras från blandade prover7.
Nuvarande begränsning för metoden är ineffektiva återvinning av ofixerade celler efter avskildhet från ledningarna. Detta kan dock förbättras genom en cell fixering steg före avlossning behandlingen.
Sammanfattningsvis är detta protokoll ett första steg mot den kombinerade användningen av en in-vivo isolering teknik med cell återhämtning för genetiskt kännetecknar enstaka celler. Ytterligare ansträngningar måste ta itu med optimering av cell återhämtning och clearance för dess tillämpning i patienter1,2. Personlig medicin för behandlingsbeslut övervakning och behandling är dock utöver uppräkning av CTCs. Denna metod är således ett första steg mot genomisk CTC karakterisering på enstaka cellnivå.
Program mot encelliga transkriptom analys verkar genomförbart intakta celler skördas. Det återstår emellertid prövas huruvida förfarandet återhämta inverkar på RNA integritet (t.ex. vidarebefordra återvunna enstaka celler till direkt Lys följt av RT-qPCR22). Om det lyckas, kan karakterisering av enstaka celler (t.ex. CTCs) skiftas till transkriptom nivå, så att mer detaljerade analyser. I detta avseende, RNA-seq använder Smart-seq2 ger ett värdefullt verktyg för RNA nedströms analys av enstaka celler som den förförstärkt cDNA (erhålls under RNA-seq bibliotek beredning) kan bli föremål för kvantitativa PCR. Detta gör att en kombinerad mål och screening-baserad analys av återvunna enkelceller22,23.
De nuvarande functionalized kablarna bygger på anti-EpCAM antikroppar som är en allmänt använd epitelial markör för positiva urval av CTCs24. Som flera CTCs kanske downregulate epiteliala markörer såsom typen eller EpCAM25, skulle lägga till antikroppar såsom HER2/nya öka chansen att CTC isolering. Flera antikropp baserat anrikning strategier har utvecklats och granskats av Ferreira et al. i 201626. En blandning av antikroppar orörlig på en tråd kan vara en framtida förbättring av den teknik som leder till isolering av ett högre nummer och ytterligare subtyper av CTCs.
Det är obligatoriskt för alla åtgärder som rör tråd hantering för att hålla den funktionella delen av tråden nedsänkt i lösningen för att bibehålla dess funktionalitet. Vi rekommenderar för att placera tråden i 1 x PBS under utvärderingen (Mikroskop; t.ex. steg 3.1. -3.3.) och lagring. För att undvika olämpliga färgning, rekommenderar vi att använda färska förberedda färglösningen i steg 1.2.1. och 1.2.2. Svagt färgade celler hämmar cellen räknar på tråd och kan leda till en underskattning av de bifoga cellerna.
Det är nödvändigt att undvika att ansluta den Pasteur-pipetten med gummi locket när du sätter i kabeln i den Pasteur-pipetten för efterföljande lastning av cellsuspensionen (steg 2.3.4.). Gummi locket används för att hålla vajern på plats så att den funktionella delen ligger innanför spetsen av den Pasteur-pipetten. Om den gemensamma jordbrukspolitiken är alltför ordentligt kopplad till baksidan av Pasteur pipetten, är lastning av cellsuspensionen inte möjligt. I detta fall lindra den gemensamma jordbrukspolitiken så att luften som är fördrivna av inlästa cellsuspensionen kan lämna pipetten.
Böja tråd är avgörande för dess orientering under cellen räknar steg 3,2. och 3.3. Montera kablarna med tejpen så att den icke-funktionella änden kommer att ligga på ena sidan. Efter skanning av hela längden av den funktionella delen, rullas kabeln 180° så den andra halvan av funktionella tråd kan skannas. Detta steg är viktigt för inledande experiment att bedöma antalet celler på linan. När antalet celler för en viss cell fodrar och procedur utvärderas, proceduren kan upprepas utan att cellen räkna (t.ex. endast kontroll förekomst av celler eller utelämna detta steg). Försiktig pipettering är avgörande att undvika cellförlust när minska volymen av supernatanten i steg 4,8. Kontrollera att pipettering görs smidigt utan att orsaka turbulensen på pelleten.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie har finansierats av österrikiska Science fond (FWF), projekt-nr. Jag 1220-B19 (att P.S.) som en del av projektet ERANET i translationell Cancer Research (TRANSCAN) ”cirkulerande tumörceller som biomarkör för Minimal Residual sjukdom i prostatacancer (CTC-SCAN)”. Doktorand S.C. var utbildad inom ramen för den PhD Program molekylärmedicin vid medicinska universitetet i Graz. Författarna erkänner tacksamt Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz och Johanna Schiller för deras teknisk experthjälp. Författarna tackar Georg Peinhaupt för grafisk design stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
| McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
| Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
| Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
| Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
| 50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
| Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
| Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
| Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
| Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
| MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
| Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
| Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
| Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
| Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
| Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
| Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
| Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
| Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
| Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
| Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
| 0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
| Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
| Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
| Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
| MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
| Standard PCR reagents | |||
| 6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
| DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
| Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |
References
- Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
- Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
- Kuske, A., et al. Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients. Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).
- van Beers, E. H., et al. A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples. Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).
- El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA. Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).
- Möhlendick, B., et al. A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH. PLoS ONE. 8 (6), e67031 (2013).
- Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci Rep-UK. 7, 43424 (2017).
- Zhang, H., et al. Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck. Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).
- Carter, L., et al. Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer. Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).
- Luca, F. D., et al. Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer. Oncotarget. , (2016).
- Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection. Cell. 168 (4), 571-574 (2017).
- Page, K., et al. Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer. Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).
- Kalinich, M., et al. An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma. P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).
- Gorges, T. M., et al. Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells. Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).
- Sinkala, E., et al. Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting. Nat Commun. 8, 14622 (2017).
- Morrow, C. J., et al. Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study. Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).
- Williamson, S. C., et al. Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer. Nat Commun. 7, 13322 (2016).
- Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM. Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).
- Czyż, Z. T., Klein, C. A. Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells. Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).
- Kroneis, T., et al. Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR. J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).
- Kroneis, T., et al. Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification. Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).
- Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification. Sci Rep-UK. 7, 45219 (2017).
- Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. Potential and Challenges of Liquid Biopsies. Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).
- Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. Circulating tumor cell technologies. Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).
