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Cancer Research

लक्ष्य सेल पूर्व संवर्धन और पूरे जीनोम प्रवर्धन एकल कोशिका बहाव लक्षण वर्णन के लिए

Published: May 15, 2018 doi: 10.3791/56394
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 3, 4, 1,5, 1
1Institute of Cell Biology, Histology and Embryology, Medical University of Graz, 2Institute of Pathology, Medical University of Graz, 3Fraunhofer Institute for Toxicology and Experimental Medicine ITEM, 4Department of Tumor Biology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 5Sahlgrenska Cancer Center, University of Gothenburg
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल को ठीक है और गैर के साथ एक मिश्रण से दुर्लभ लक्ष्य कोशिकाओं को तैयार करने के लिए है एकल कोशिका स्तर पर आणविक आनुवंशिक लक्षण वर्णन के लिए लक्ष्य पृष्ठभूमि कोशिकाओं । डीएनए की गुणवत्ता गैर-इलाज एकल कोशिकाओं के बराबर है और एकल सेल आवेदन (दोनों स्क्रीनिंग आधारित और लक्षित विश्लेषण) के लिए अनुमति देता है ।

Abstract

दुर्लभ लक्ष्य कोशिकाओं के लक्ष्य कोशिकाओं की सतह प्रोटीन के लिए विशेष एंटीबॉडी का उपयोग गैर लक्ष्य कोशिकाओं की एक उच्च पृष्ठभूमि से अलग किया जा सकता है । हाल ही में एक विकसित विधि एक चिकित्सा विरोधी के साथ कार्यात्मक-उपकला कोशिका आसंजन अणु (EpCAM) एंटीबॉडी परिचालित ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs)1के अलगाव में के लिए बहुआयामी तार का उपयोग करता है. गैर में एक रोगी मिलान पलटन-मेटास्टेटिक प्रोस्टेट कैंसर से पता चला कि vivo अलगाव तकनीक में एक उच्च प्रतिशत के परिणामस्वरूप रोगियों CTCs के लिए सकारात्मक के रूप में अच्छी तरह से उच्च सीटीसी गिनती के रूप में सीटीसी गणन में वर्तमान स्वर्ण मानक की तुलना में । के रूप में कोशिकाओं को वर्तमान चिकित्सा उपकरणों, एक नए कार्यात्मक तार से बरामद नहीं किया जा सकता है (डिवाइस के रूप में संदर्भित) कब्जा और एंजाइमी उपचार द्वारा कोशिकाओं के बाद टुकड़ी की अनुमति निर्मित किया गया । कोशिकाओं को डिवाइस के लिए संलग्न करने की अनुमति दी जाती है, एक खुर्दबीन पर visualized और एंजाइमी उपचार का उपयोग कर अलग । बरामद कोशिकाओं झिल्ली लेपित स्लाइड पर cytocentrifuged और लेजर microdissection या micromanipulation के माध्यम से व्यक्तिगत रूप से काटा जाता है । एकल सेल नमूने तो एकल सेल पूरे जीनोम प्रवर्धन स्क्रीनिंग और लक्ष्य विशेष दृष्टिकोण सहित एकाधिक बहाव विश्लेषण की अनुमति के अधीन हैं । अलगाव और वसूली की प्रक्रिया एकल कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता डीएनए पैदावार और बाद में पूरे जीनोम प्रवर्धन (WGA) ख़राब नहीं है । एक एकल कोशिका के परिवर्धित डीएनए को परखने के लिए अग्रेषित किया जा सकता है और/या लक्षित विश्लेषण जैसे सरणी तुलनात्मक जीनोम संकरण (ऐरे-CGH) या अनुक्रमण । डिवाइस कृत्रिम दुर्लभ सेल नमूनों से पूर्व vivo अलगाव की अनुमति देता है (यानी ५०० लक्ष्य कोशिकाओं परिधीय रक्त के 5 मिलीलीटर में नुकीला). जबकि कोशिकाओं की टुकड़ी की दरें स्वीकार्य हैं (५०-९०%), स्लाइड पर अलग कक्षों की पुनर्प्राप्ति दर, उपयोग की जाने वाली कक्ष लाइन पर निर्भर एक विस्तृत श्रृंखला तक विस्तारित होती है (< 10-> 50%) और कुछ और ध्यान देने की आवश्यकता है । मरीजों में इस्तेमाल के लिए यह डिवाइस क्लियर नहीं है ।

Introduction

हाल ही में, CellCollector DC01, एक चिकित्सा कैंसर रोगियों के परिधीय रक्त से अलग CTCs के लिए विरोधी EpCAM एंटीबॉडी के साथ कार्यात्मक तार, सीटीसी गणन1के व्यवस्थित स्पेक्ट्रम में जोड़ा गया था,2,3 . गैर में वर्तमान में चल रहे एक अध्ययन में मेटास्टेटिक प्रोस्टेट कैंसर, इस कार्यात्मक तार रिपोर्ट लगभग दो बार के रूप में कई रोगियों को सीटीसी-सकारात्मक और उच्च सीटीसी सीटीसी में गिना जाता है-सकारात्मक रोगियों के रूप में CellSearch की तुलना में, सीटीसी गणन 3 में स्वर्ण मानक . इस उत्साहजनक प्रदर्शन के कारण, एकल सेल विश्लेषण के लिए एक कार्यात्मक चिकित्सा तार से कोशिकाओं के अलगाव वांछनीय होगा, लेकिन न तो सेल टुकड़ी समाधान (जैसे trypsin) और न ही लेजर microdissection के साथ एंजाइमी उपचार की अनुमति देता है बरकरार कोशिकाओं की वसूली (डेटा नहीं दिखाया गया है) ।

कब्जा कर लिया कोशिकाओं की टुकड़ी की अनुमति देने के लिए, कार्यात्मक तारों की एक नई पीढ़ी एक विशिष्ट बहुलक से सुसज्जित किया गया था । इस बहुलक, जो तार को कब्जा एंटीबॉडी लिंक, एक रिलीज बफर बरकरार कोशिकाओं की टुकड़ी की अनुमति उपचार (CellCollector DC03 डिवाइस के रूप में संदर्भित करने के लिए अतिसंवेदनशील) है । नई कार्यात्मक उपकरण, कैंसर कोशिका रेखा की कोशिकाओं के विभिंन सांद्रता से अलगाव गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA)/phosphate बफर खारा (पंजाब) और परिधीय रक्त, क्रमशः में नुकीला की अनुमति देता है ।

डिवाइस पर और वसूली के बाद कोशिकाओं के दृश्य का पता लगाने को कम करने के लिए, लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) और उबरने उपचार (यानीचार्ज और अलग) से पहले एक डीएनए दाग के साथ लेबल कर रहे हैं । एकल कोशिकाओं के डीएनए की गुणवत्ता पर इलाज के प्रभाव पहले एक गुणवत्ता नियंत्रण के माध्यम से WGA के बाद मूल्यांकन किया गया था पीसीआर4,5, ऐरे-CGH6,7 और लक्षित अनुक्रमण7 कोई अंतर नहीं दिखा गैर-स्वास्थ्यकर्मी कक्षों की तुलना में कक्ष निलंबन7से micromanipulated । इस विधि का लाभ दुर्लभ लक्ष्य के संयोजन में निहित है-सेल पूर्व संवर्धन और एकल के लिए कोशिकाओं की वसूली-कक्ष बहाव विश्लेषण (चित्र 1) । वर्तमान CE-लेबल vivo संग्रह डिवाइस में आम तौर पर CTCs के बजाय एकल-सेल आणविक लक्षण वर्णन2,8के लिए गणन के लिए किया जाता है । हालांकि, CTCs के बीच विविधता की जांच करने के लिए और अधिक व्यापक विश्लेषण व्यक्तिगत सेल स्तर पर विश्लेषण के लिए (यानी एकल-कक्ष स्तर पर लक्षित अनुक्रमण) । अंय सेल आधारित तरीकों EpCAM के immunomagnetic अलगाव पर आधारित है-सकारात्मक CTCs और एकल सेल हैंडलिंग बाद आणविक आनुवंशिक विश्लेषण के लिए dielectrophoresis के आधार पर9,10। CTCs के आणविक लक्षण वर्णन एक नैदानिक सेटिंग में उनके उपयोगी कार्यान्वयन के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है और मेटास्टेटिक झरना के बुनियादी अनुसंधान में समान रूप से महत्वपूर्ण है. CTCs के समानांतर में, परिसंचारी ट्यूमर डीएनए (ctDNA) बहुत महत्व का हो गया है के रूप में यह ंयूनतम तकनीकी अलगाव प्रक्रियाओं11,12के साथ ट्यूमर के बोझ के डीएनए विश्लेषण की अनुमति देता है । सेल आधारित दृष्टिकोण एक पूरक योगदान के रूप में सेवा के रूप में यह आरएनए13,14 और प्रोटीन15 अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए अनुमति देता है और सीटीसी व्युत्पंन सेल संस्कृतियों या xenografts16के लिए भी कर सकते हैं, 17. हालांकि कम सेल वसूली और रोगियों में उपयोग के लिए मंजूरी के रूप में इस तरह की बाधाओं को अभी भी दूर करने की जरूरत है, पकड़ और रिलीज विधि दुर्लभ लक्ष्य कोशिकाओं के लक्षण वर्णन की दिशा में एक महत्वपूर्ण अगले कदम लेता है ।

Protocol

मेडिकल यूनिवर्सिटी ऑफ चरने (25-240 ex 12/13) की एथिक्स कमेटी द्वारा सभी प्रक्रियाओं को अनुमोदित कर दिया गया है । spiking प्रयोगों के लिए परिधीय रक्त स्वस्थ व्यक्तियों से नमूना लिया गया.

नोट: यह प्रोटोकॉल पंजाब से या एचटी-29 कोशिकाओं और परिधीय रक्त के कृत्रिम मिश्रण से एचटी-29 कोशिकाओं (मानव बृहदांत्र कैंसर सेल लाइन) के अलगाव का वर्णन करता है । एक ही प्रयोग दो अतिरिक्त सेल लाइनों के साथ प्रदर्शन किया गया था (LNCaP और VCaP, प्रतिनिधि परिणामों में प्रयोगात्मक डेटा) और सैद्धांतिक रूप से सभी EpCAM व्यक्त कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है.

1. लक्ष्य कोशिकाओं की तैयारी

  1. कक्ष संस् कृति और कक्षों की लेबलिंग
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं ७५ सेमी ² संस्कृति कुप्पी में संस्कृति रहे हैं । अंय सेल संस्कृति उपकरणों (जैसे 25 सेमी ² संस्कृति व्यंजन, 6 अच्छी तरह से प्लेटें, आदि) का उपयोग किया जाता है, तो तदनुसार एजेंट की मात्रा समायोजित करें । सभी तरल पदार्थ का इस्तेमाल किया पूर्व एक पानी स्नान में ३७ ° c करने के लिए गरम कर रहे हैं । अंयथा संकेत नहीं, तो सभी प्रोटोकॉल चरण कक्ष तापमान (RT) पर किया जाता है ।
    1. संस्कृति एचटी-29 में McCoy के 5 सेल संशोधित माध्यम 2 मिमी एल के साथ पूरक-glutamine, 20 मिमी Hepes, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और 1% पेनिसिलिन/streptomycin पर ३७ ° c में एक ५% CO2 वातावरण ।
    2. जब कोशिकाओं ९०% धाराप्रवाह हैं, मध्यम निकालें और 1x पंजाबियों के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला ।
    3. कोशिकाओं को फसल के लिए, सेल टुकड़ी समाधान (सामग्री और रिएजेंट की मेज) के 2 मिलीलीटर कोशिकाओं को जोड़ने और ३७ डिग्री सेल्सियस पर लगभग 5 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
      नोट: टुकड़ी समाधान 1x पंजाबियों में proteolytic और collagenolytic एंजाइमों, ०.५ mM ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), और 3 मिलीग्राम/एल phenol लाल शामिल हैं । एक ंयूनतम के लिए सेल टुकड़ी समाधान के पूर्व वार्मिंग समय को कम करने के रूप में यह ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के बाद निष्क्रिय हो जाएगा । पूरे सेल परत को कवर करने के लिए इष्टतम सेल टुकड़ी प्राप्त करते हैं ।
    4. एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं की टुकड़ी की जाँच करें.
    5. एक ५० मिलीलीटर के लिए सभी अलग कोशिकाओं स्थानांतरण सेल संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ एक से अधिक (1.1.1 कदम में प्रयोग किया जाता है.) और pipetting द्वारा कोशिकाओं reसस्पेंड ।
    6. आरटी पर एक क्षैतिज रोलर मिक्सर पर शेष सेल निलंबन प्लेस और लेबलिंग कदम के लिए आगे बढ़ना ।
  2. लक्ष्य कक्षों की लाइव सेल लेबलिंग
    1. 5 मिमी CFSE के 1 µ एल पतला (dimethyl sulfoxide में आपूर्ति की, DMSO) 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने के लिए 5 µ एम तैयार करने के लिए उपयोग CFSE लेबलिंग समाधान प्राप्त करने के लिए ।
      नोट: इष्टतम धुंधला परिणाम के लिए, नए सिरे से तैयार समाधानों का उपयोग करें ।
    2. 1x पंजाब में एक तैयार करने के लिए उपयोग डीएनए धुंधला समाधान (सामग्री और रिएजेंट की मेज) और प्रकाश से सुरक्षित 2-6 ° c पर यह दुकान तैयार करते हैं ।
      नोट: इष्टतम धुंधला परिणाम के लिए, नए सिरे से तैयार समाधानों का उपयोग करें ।
    3. क्षैतिज रोलर मिक्सर से कोशिकाओं को प्राप्त करें (step 1.1.6.) और 10 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं गोली । supernatant निकालें और 1x पंजाबियों के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड ।
    4. फिर 1x पंजाबियों के साथ कोशिकाओं कुल्ला और ५०० µ l के लिए तैयार उपयोग CFSE लेबलिंग समाधान में सेल गोली reसस्पेंड ।
    5. 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन और 3 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक के बाद कोशिकाओं को इकट्ठा ।
    6. पूर्व-उष्ण कक्ष संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर में लेबल किए गए कक्षों को पुनः निलंबित करें और कक्षों को 30 मिनट के लिए ३७ ° c में पुनः जेनरेट करने की अनुमति दें.
    7. 3 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं फसल और 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर तैयार करने के लिए उपयोग डीएनए धुंधला समाधान के 1 मिलीलीटर में सेल छर्रों reसस्पेंड ।
    8. गोली कोशिकाओं, supernatant निकालें और 1x पंजाब के 4 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड । एक hemocytometer का उपयोग कर सेल घनत्व का आकलन और प्रतिदीप्ति लेबलिंग 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) और fluorescein isothiocyanate (FITC) फिल्टर (चित्रा 2a और 2E) के साथ सुसज्जित एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर के लिए जाँच करें ।
    9. 3 मिनट के लिए ३०० एक्स जी में कोशिकाओं के केंद्रापसारक और सेल घनत्व के अनुसार सेल गोली reसस्पेंड संबंधित प्रयोग के लिए आवश्यक के रूप में अगले अनुभाग और बर्फ पर जगह में दी गई ।

2. तार चार्ज

नोट: कोशिकाओं milliliter पैमाने पर या एक microliter पैमाने पर कोशिकाओं की कम संख्या प्रदान करके लक्ष्य सेल/परिधीय रक्त spikings से अलग किया जा सकता है । पूर्व दृष्टिकोण परिधीय रक्त में दुर्लभ सेल हालत नकल उतार के लिए अनुमति देता है जबकि, उत्तरार्द्ध प्रोटोकॉल अनुकूलन के प्रयोजन के लिए कुछ कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए पसंदीदा तरीका हो सकता है/

  1. सेल सस्पेंशन की एक बड़ी मात्रा का उपयोग कर तार चार्ज
    1. 1x पंजाब के ४० मिलीलीटर (सेल संस्कृति उपयोग) में BSA के ०.८ g को भंग करके एक 2% BSA अवरुद्ध समाधान तैयार करें । प्रारंभिक भंवर और 10-20 मिनट के लिए एक क्षैतिज रोलर मिक्सर पर आरटी पर बाद में मशीन द्वारा भंग BSA ।
    2. कुल्ला खाली EDTA ट्यूबों/सोडियम हेपरिन ट्यूबों 2% की 2 मिलीलीटर के साथ BSA थक्कारोधी अवशेषों को हटाने और समाधान त्यागें । 30 मिनट के लिए 15 rpm पर एक क्षैतिज रोलर मिक्सर पर 2% BSA के 5 मिलीलीटर के साथ आरटी पर मशीन द्वारा ट्यूब सतह ब्लॉक और समाधान त्यागें ।
    3. लेबल कोशिकाओं पतला (धारा १.२.) के घनत्व के लिए १०० ००० कोशिकाओं/एमएल और 5 मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए तार चार्ज ।
    4. बला सेल सस्पेंशन (कुल में ५०० ००० कोशिकाओं) के 5 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए जोड़ें । सेल निलंबन जोड़ते समय बुलबुले से बचें ।
    5. भंडारण डिब्बे से तार हटाने के साथ ही रबर टोपी पकड़े तार और यह 1x पंजाब में कुल्ला (चित्रा 3) ।
    6. EDTA ट्यूब के रबर ट्यूब कैप घुसना (कदम 2.1.4 ।) एक सिरिंज सुई (20G) की मदद से और तार डालने के लिए इस तरह के कार्यात्मक हिस्सा पूरी तरह से सेल निलंबन में डूब गया है जब टोपी ट्यूब और झुका रोलर मिक्सर पर रखा ट्यूब पर वापस आ गया है.
      नोट: तार के ट्रिपल-पेचदार कार्यात्मक हिस्सा चार्ज भर में सेल निलंबन के साथ कवर किया जाना चाहिए ।
    7. 30 मिनट के लिए 5 rpm पर एक झुका रोलर मिक्सर पर ट्यूबों घुमाने के लिए कोशिकाओं तार करने के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    8. 5 मिलीलीटर 1x पंजाबियों के साथ तार कुल्ला और एक 15 एमएल दृश्य परीक्षा तक 1x पंजाब युक्त ट्यूब में 2-6 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में यह दुकान ।
      ध्यान दें: कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए वायर का कार्यात्मक हिस्सा हमेशा पंजाब में जलमग्न होना चाहिए ।
  2. बाह्य परिधीय रक्त के साथ कृत्रिम मिश्रण से लक्ष्य कोशिकाओं को अलग (वैकल्पिक चार्ज करने के लिए विधि: २.१. कोशिका निलंबन की एक बड़ी मात्रा का उपयोग कर तार चार्ज)
    1. उच्च कोशिका घनत्व (> १ ००० ००० कक्ष/एमएल) के साथ सेल सस्पेंशन को प्राप्त करने के लिए लेबल वाले कोशिकाओं (धारा १.२.) पतला, जिससे सेल निलंबन की मात्रा परिधीय रक्त कम करने के लिए जोड़ा रखते हुए ।
    2. ५०० परिधीय रक्त के 5 मिलीलीटर के लिए ५०० ००० कोशिकाओं को जोड़ने और उन्हें ट्यूब पलटने से मिश्रण.
    3. भंडारण डिब्बे से तार निकालें, रबर टोपी पकड़े तार हटाने और यह 1x पंजाबियों में कुल्ला ।
    4. इस तरह के कार्यात्मक हिस्सा पूरी तरह से नुकीला रक्त में डूब जाता है जब एक सिरिंज सुई (20G) का उपयोग कर डिवाइस के गैर-कार्यात्मक हिस्सा के साथ एक नया ट्यूब कैप घुसना जब टोपी ट्यूब पर वापस आ गया है और झुका रोलर मिक्सर पर रखा ट्यूब.
      नोट: तार के ट्रिपल-पेचदार कार्यात्मक हिस्सा चार्ज भर में सेल निलंबन के साथ कवर किया जाना चाहिए ।
    5. आरटी पर 30 मिनट के लिए 5 rpm पर झुका रोलर मिक्सर पर ट्यूब मशीन ।
    6. 1x पंजाब में तार 3 बार कुल्ला और एक 15 मिलीलीटर दृश्य परीक्षा तक 1x पंजाबियों युक्त ट्यूब में अंधेरे में स्टोर ।
      नोट: तार के कार्यात्मक हिस्सा हमेशा कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए जलमग्न होना चाहिए ।
  3. कम मात्रा में सेल सस्पेंशन से तार चार्ज (वैकल्पिक चार्ज करने के लिए विधि: २.१ । कोशिका निलंबन की एक बड़ी मात्रा का उपयोग कर तार चार्ज)
    1. 1x पंजाब में १ ००० ००० कोशिकाओं/एमएल में लेबल कोशिकाओं reसस्पेंड ।
    2. एक रैक पर एक १५० mm डिस्पोजेबल ग्लास पाश्चर पिपेट क्षैतिज ठीक करें ।
    3. भंडारण डिब्बे से तार निकालें लेकिन पीली रबर की टोपी पकड़े तार रखें ।
    4. पिपेट में तार की जगह ऐसी है कि कार्यात्मक हिस्सा पाश्चर के टिप में स्थित है पिपेट कांच नहीं छू ।
      नोट: तार की नोक बाहर पाश्चर पिपेट टिप से चिपके नहीं होना चाहिए । तार पकड़े रबर टोपी के साथ पाश्चर पिपेट टिप के रियर अंत plugging से बचें । अगर तंग संलग्न, सेल निलंबन पिपेट टिप में दूसरी तरफ से लोड नहीं किया जा सकता है ।
    5. पाश्चर पिपेट के टिप में सेल निलंबन के 15 µ एल लोड तार के कार्यात्मक भाग को कवर ।
    6. 10 min. मैंयुअल रूप से तिमाही के लिए तार मशीन-इकट्ठे तार बारी/पाश्चर पिपेट टिप हर मिनट ।
    7. पाश्चर पिपेट टिप से तार निकालें, 1x पंजाबियों के 5 मिलीलीटर में यह कुल्ला और एक 15 मिलीलीटर दृश्य परीक्षा तक 1x पंजाबियों युक्त ट्यूब में 2-6 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में यह दुकान ।
      नोट: कार्यात्मक हिस्सा हमेशा कोशिकाओं को नुकसान से बचने के लिए 1x पंजाब में जलमग्न होना चाहिए ।

3. तार पर कोशिकाओं गिनती

नोट: हमेशा कोशिकाओं को नुकसान से बचने के लिए 1x पंजाब में जलमग्न तार के कार्यात्मक हिस्सा रखने के लिए ।

  1. एक गिलास स्लाइड पर एक आयत क्षेत्र आकर्षित और 1x पंजाब के ५०० µ एल जोड़ने के लिए एक तेल कलम का प्रयोग करें ।
  2. तार का गैर-कार्यात्मक हिस्सा मोड़ और कांच स्लाइड पर जगह है कि इस तरह के कार्यात्मक हिस्सा 1x पंजाब में डूब जाता है ।
    नोट: पूरी तरह से तार के कार्यात्मक हिस्सा कवर करने के लिए आयत और 1x पंजाब की मात्रा के क्षेत्र में फिट । स्लाइड पर वायर के गैर-कार्यशील भाग को माउंट करने के लिए डबल-झेली गई चिपकने वाली टेप का उपयोग करें ।
  3. नेत्रहीन तार के दोनों ओर का निरीक्षण करने के लिए कब्जा कर लिया कोशिकाओं की गणना (चित्र बी और 2F) ।
    नोट: कोशिकाओं की उपस्थिति DAPI और FITC के लिए फिल्टर से सुसज्जित एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है. तार के दोनों ओर का निरीक्षण किया जा सकता है और कोशिकाओं की संख्या या तो मूल्यांकन (उच्च कोशिका संख्या के लिए) या गिना (केवल संभव अगर कोशिकाओं की कम संख्या तार से जुड़े हैं) । यदि कक्षों की गणन आवश्यक नहीं है, तो यह चरण छोड़ा जा सकता है ।
  4. स्कैनिंग के बाद, तार को 15 मिलीलीटर ट्यूब में वापस प्लेस 1x पंजाबियों (2.3.6. and धारा 3 के नोट देखें.), यह अंधेरे में तार की दुकान ।
    नोट: तार के गैर कार्यात्मक हिस्सा के अधिकांश (मोड़ सहित) काटा जा सकता है और आसान भंडारण हटा दिया ।

4. लक्ष्य कोशिकाओं की टुकड़ी और वसूली

नोट: कोशिकाओं की टुकड़ी अलगाव के बाद 4 एच के भीतर किया जाएगा ।

  1. रिलीज बफर घटक की 4 मिलीग्राम (सामग्री और रिएजेंट की मेज) 1x पंजाबियों के प्रति मिलीलीटर और एक ०.२ µm बाँझ फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करने के लिए तैयार करने के लिए उपयोग बफर प्राप्त करने के लिए ।
    नोट: तार की बहुलक एक hydrogel जो विरोधी के साथ कार्यात्मक है से बना है EpCAM एंटीबॉडी EpCAM के बंधन की अनुमति-लक्ष्य कोशिकाओं को पेश । रिलीज बफर एक कार्बन ऑक्सीजन proteolytic hydrogel सट में सक्षम एंजाइम शामिल हैं । Proteolytic दरार बहुलक के क्षरण में परिणाम और, इस प्रकार, कब्जा कर लिया कोशिकाओं की टुकड़ी ।
  2. पूर्व गर्म ३७ ° c पर रिलीज बफर 5 मिनट के लिए ।
  3. एक १.५ मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब को भरने के लिए रिलीज बफर के १.६ मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: १.५ मिलीलीटर प्रतिक्रिया संस्करणों के लिए डिजाइन ट्यूबों १.६ मिलीलीटर के आवेदन की अनुमति है जो तार के कार्यात्मक हिस्सा विलय के लिए आवश्यक है ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस (पानी स्नान) पर रिलीज बफर में तार के कार्यात्मक हिस्सा गर्मी 20 मिनट के लिए. रबर टोपी का उपयोग करने के बजाय ट्यूब टोपी के तार के साथ भेज दिया १.५ मिलीलीटर ट्यूब में तार को ठीक करने के लिए पानी स्नान में मशीन के दौरान संक्रमण से बचने के लिए ।
  5. 15 मिनट के लिए आर टी और ५०० rpm पर एक शेखर को तार/
    नोट: शेखर १.५ मिमी की एक कक्षा है ।
  6. एक केंद्रापसारक में तार/ट्यूब विधानसभा प्लेस और 10 मिनट के लिए ३०० x g पर स्पिन ।
  7. ट्यूब से तार निकालें, टोपी बंद करें और 10 मिनट के लिए ३०० x g पर फिर से ट्यूब केंद्रापसारक ।
    नोट: तार 1x में 2-6 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है सेल गिनती के लिए टुकड़ी क्षमता का आकलन करने के लिए/तार पर शेष कोशिकाओं के लिए जांच करें ।
  8. सेल निलंबन की मात्रा को कम करने के लिए, सभी लेकिन १०० µ एल (micromanipulation) या वैकल्पिक रूप से ३०० µ एल (cytocentrifugation और microdissection के बाद लेजर supernatant) को हटा दें और तुरंत एकल-सेल नमूना करने के लिए आगे बढ़ें ।

5. एकल सेल नमूना

  1. Micromanipulation
    नोट: एकल कोशिकाओं WGA की अनुमति सेल lysis मास्टर मिक्स के 2 µ एल करने के लिए जोड़ दिया जाएगा । संसाधित किया जा करने के लिए कोशिकाओं की संख्या के अनुसार मास्टर मिश्रण तैयार करें, बर्फ पर pipetting और जगह सेल lysis मास्टर मिश्रण के कारण नुकसान के लिए अतिरिक्त मात्रा की गणना ।
    1. सेल lysis मास्टर मिक्स (WGA किट, सामग्री और रिएजेंट की मेजके घटकों) Czyż एट अल18द्वारा उल्लिखित प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार करें । संक्षेप में, मिश्रण २.० प्रतिक्रिया बफर के µ l, १.३ µ एल के octylphenoxypolyethoxyethanol (10% समाधान), १.३ µ l के 4-(1, 1, 3, 3-tetramethylbutyl) फिनाइल-पॉलीथीन ग्लाइकोल (10% समाधान), २.६ µ l के एक proteinase K समाधान, और १२.८ µ l RNase/DNase-नि: शुल्क जल प्राप्त करने के लिए एक 10 नमूनों के लिए मास्टर मिश्रण (कुल मात्रा 20 µ एल).
      नोट: अधिक नमूनों के लिए, तदनुसार वॉल्यूम बढ़ाएं । सेल lysis मास्टर मिक्स की संरचना वैकल्पिक लेजर microdissection नमूनों का उपयोग प्रक्रिया में इस्तेमाल एक से अलग है (५.२ देखें.) ।
    2. जगह में सेल निलंबन पकड़ क्षेत्र आकर्षित करने के लिए एक तेल कलम का प्रयोग करें । क्षेत्र और मात्रा समायोजित करें यदि सेल घनत्व बहुत अधिक है (यानीकांच स्लाइड पर एक बड़ा क्षेत्र मार्क, 1x पंजाबियों और सेल निलंबन के एक aliquot लोड) ।
    3. कांच स्लाइड पर पूरे सना हुआ सेल निलंबन (४.८ चरण में प्राप्त.) पिपेट ।
    4. एक micromanipulator से सुसज्जित एक खुर्दबीन के लिए गिलास स्लाइड हस्तांतरण । कोशिकाओं को 5 मिनट (चित्रा 2d और 2H) के लिए व्यवस्थित करते हैं ।
    5. तैयार ०.२ एमएल पीसीआर ट्यूबों सेल lysis मास्टर मिश्रण के २.० µ एल के साथ भरी हुई (कदम 5.1.1 देखें.) और यह बर्फ पर दुकान ।
    6. micromanipulator का उपयोग कर 1x पंजाबियों के 1 µ एल में एकल कोशिकाओं को इकट्ठा करने और सेल lysis मास्टर मिश्रण युक्त ट्यूब में कोशिकाओं को हस्तांतरण ।
      नोट: सेल lysis बफर में micromanipulated कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए lysis समाधान के 2 µ एल में सीधे केशिका जगह और बुलबुले देखा जा सकता है जब तक बेदखल ।
    7. संक्षेप में २००० x g पर नमूना नीचे स्पिन 3 एस के लिए एक डेस्कटॉप microfuge का उपयोग करने के लिए ट्यूब के तल पर सभी तरल इकट्ठा । नमूनों को बर्फ पर लगाएं ।
    8. एकल-कक्ष WGA से सीधे आगे बढ़ें (अनुभाग 6. और Czyż एट al देखें. 19).
  2. लेज़र microdissection (वैकल्पिक एकल-कक्ष नमूना विधि: ५.१ । Micromanipulation)
    नोट: इस खंड में प्रयुक्त मास्टर मिश्रण की संरचना micromanipulation के लिए खंड ५.१ में प्रयुक्त एक से भिन्न है । एकल कोशिकाओं के लिए ४.५ µ एल सेल lysis मास्टर मिश्रण के (wga किट के घटकों, wga के लिए सामग्री और रिएजेंट की मेज) जोड़ दिया जाएगा ।
    1. Czyż एट अल के अनुसार सेल lysis मास्टर मिक्स तैयार करें । 19 मिश्रण से ५.० µ प्रतिक्रिया बफर के एल, १.३ µ l के octylphenoxypolyethoxyethanol (10% हल), १.३ µ l के 4-(1, 1, 3, 3-tetramethylbutyl) फिनाइल-पॉलीथीन ग्लाइकोल (10% हल), resp., २.६ µ l का एक proteinase K हल और ३४.८ µ l के RNase/ DNase-मुक्त पानी 10 नमूनों के लिए एक मास्टर मिश्रण प्राप्त करने के लिए (कुल मात्रा ४५ µ एल). मास्टर मिक्स को बर्फ पर लगाएं ।
      नोट: अधिक नमूनों के लिए, तदनुसार वॉल्यूम बढ़ाएं ।
    2. यूवी का इलाज झिल्ली लेपित स्लाइड लेजर microdissection के लिए उपयुक्त है । इसलिए, एक डीएनए पार linker डिवाइस में स्लाइड प्लेस और के बारे में 10 मिनट के लिए उच्चतम यूवी को बेनकाब ।
    3. एक cytocentrifuge में झिल्ली लेपित स्लाइड को इकट्ठा करने और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर पूरे सेल निलंबन cytospin ।
      नोट: जब एक में तरल प्रणाली का उपयोग कर, जहां कोशिकाओं समाधान में स्लाइड पर cytocentrifuged हैं, cytocentrifugation के बाद supernatant निकालें और 1 मिनट के लिए ११४० x g पर एक सूखी स्पिन लागू होते हैं ।
    4. सीधे लेजर microdissection के लिए आगे बढ़ना है या cytospins हवा-सूखी रात भर और नमूने पर-20 डिग्री सेल्सियस लंबी अवधि के भंडारण के लिए फ्रीज ।
    5. पिपेट ४.५ सेल के µ एल lysis लेजर microdissection के माध्यम से एक ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब और फसल एकल कोशिकाओं की टोपी में मास्टर मिश्रण ।
    6. लेजर microdissection माइक्रोस्कोप से पीसीआर ट्यूब निकालते हैं और ट्यूब बंद. कम स्पिन द्वारा ट्यूब के तल पर सभी तरल ले लीजिए और बर्फ पर नमूना जगह है ।
    7. एकल-कक्ष WGA के साथ आगे बढ़ें या अलग नमूनों को-८० ° c को आगे की प्रक्रिया से पहले 1 माह तक संग्रहीत करें ।

6. अनुकूलक-लिंकर आधारित पूरे जीनोम प्रवर्धन 18,19

नोट: सुनिश्चित करें कि सभी आवश्यक मास्टर घोला जा सकता है (WGA किट के घटक, सामग्री और रिएजेंट की मेज) तैयार है और उपयोग करने के लिए तैयार बर्फ पर संग्रहित कर रहे हैं । मास्टर घोला जा सकता है शामिल डीएनए पाचन micromanipulated के लिए 1 मिश्रण (५.१ देखें.) नमूने (२.० µ एल की प्रतिक्रिया बफर, २.० µ एल के एमएसईमैं प्रतिबंध एंजाइम और १६.० µ एल के RNase/DNase-मुक्त पानी) या डीएनए पाचन मिश्रण 2 के लिए लेजर microdissection (५.२ देखें.) नमूने (जिसमें से २.५ µ l का एमएसईI प्रतिबन्ध एंजाइम और २.५ µ l का RNase/DNase-मुक्त जल), प्री-एनीलिंग मास्टर मिक्स (रिएक्शन बफर के ५.० µ l युक्त, preannealing पीसीआर एडेप्टर में से प्रत्येक के ५.० µ एल, और µ/RNase-मुफ्त पानी की १५.० DNase एल), बंधाव मास्टर मिक्स (जिसमें प्री-annealed पीसीआर एडेप्टर्स की ३०.० µ एल, १०.० µ एल adenosine ट्राइफॉस्फेट सॉल्यूशन, और १०.० µ एल टी-4 ligase सॉल्यूशन) और प्राइमरी पीसीआर मास्टर मिक्स (एक पीसीआर बफर की ३०.० µ एल युक्त, २०.० µ एल के 10 एमएम deoxynucleotide मिक्स सॉल्यूशन, १०.० µ एल के एक पोलीमरेज़ RNase/DNase-फ्री वॉटर) के मिश्रण और ३४०.० µ l 10 नमूनों को तैयार करने के लिए सभी खंड दिए गए हैं । नमूनों की संख्या के अनुसार समायोजित करें ।

  1. सेल lysis के लिए, एक थर्मल साइकिल चालक में micromanipulated/लेजर microdissection नमूनों प्लेस और 10 मिनट के लिए ४५ मिनट, ६५ डिग्री सेल्सियस के लिए 30 मिनट और ८० डिग्री सेल्सियस के लिए ४२ डिग्री सेल्सियस पर सेल की मशीन द्वारा एकल सेल lysis चलाते हैं ।
    नोट: एक गर्म ढक्कन के साथ एक थर्मल साइकिल चालक का प्रयोग करें । सेल lysis 10 से 15 ज के लिए किया जा सकता हे/ उस मामले में, ६५ डिग्री सेल्सियस पर मशीन कदम छोड़ ।
  2. पीसीआर एडेप्टर की प्री-एनीलिंग चलाएं । इसलिए, 1 मिनट के लिए आगे ४९ चक्र, 1 मिनट प्रत्येक, उत्तरोत्तर 1 डिग्री सेल्सियस से तापमान को कम करने के साथ के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल साइकिल चालक में पूर्व एनीलिंग मास्टर मिक्स मशीन/ ५० चक्र के बाद (15 डिग्री सेल्सियस से कम), आगे उपयोग तक 15 डिग्री सेल्सियस पर मास्टर मिश्रण मशीन ।
    नोट: यह कदम असममित एडाप्टर बंधाव के लिए उपयुक्त उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है (चरण ६.६ देखें.) एकल-सेल डीएनए के साथ एमएसईमैं डाइजेस्ट प्रतिबंध के अधीन.
  3. सेल lysis के बाद, लीजड ड नमूने नीचे स्पिन 3 एस के लिए २००० x g पर सभी तरल इकट्ठा करने के लिए नीचे और यह बर्फ पर जगह है ।
  4. डीएनए को खंडित करने के लिए, डीएनए पाचन के 2 µ एल मिश्रण जोड़ें 1 के लिए प्रत्येक लीजड ड micromanipulated नमूना या ०.५ µ एल डीएनए पाचन मिश्रण 2 लेजर microdissection नमूना करने के लिए और चलाने के प्रतिबंध डाइजेस्ट. 5 मिनट के लिए ६५ ° c पर एक प्रतिबंध एंजाइम निष्क्रियण के द्वारा पीछा किया 5 मिनट के लिए ३७ ° c पर एक गर्म ढक्कन के साथ एक थर्मल साइकिल चालक का प्रयोग करें ।
    नोट: ३७ डिग्री सेल्सियस पर पाचन 3h के लिए बढ़ाया जा सकता है । यह केवल प्रोटोकॉल कदम micromanipulation और लेजर microdissection से प्राप्त नमूनों से प्राप्त नमूनों के बीच भिंन है ।
  5. नीचे में सभी तरल इकट्ठा करने के लिए और बर्फ पर जगह नमूने नीचे स्पिन ।
  6. ligating प्रतिबंध पचा डीएनए और पूर्व annealed एडेप्टर के लिए, प्रत्येक पचा डीएनए नमूने के लिए बंधाव मास्टर मिश्रण के ५.० µ एल जोड़ें और 15 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल साइकिल चालक में यह ligate के लिए 1 एच ।
    नोट: यह चरण 12 ज या प्रदर्शन O/N करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है ।
  7. नीचे में सभी तरल इकट्ठा करने के लिए और बर्फ पर जगह नमूने नीचे स्पिन ।
  8. के लिए wga जोड़ें ४०.० µ प्राथमिक पीसीआर मास्टर मिश्रण के एल बंधाव उत्पादों में से प्रत्येक के लिए और एक थर्मल साइकिल चालक में एक गर्म ढक्कन के साथ wga चलाने के रूप में इस प्रकार है: पहले, 3 मिनट के लिए ६८ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन । दूसरा, 15 बार के लिए चक्र ९४ ° c के लिए ४० s, ५७ ° c के लिए 30 s और ६८ ° c के लिए 1 मिनट 30 s + 1 s/ फिर ९४ ° c पर 9 चक्र जोड़ें ४० एस, ५७ डिग्री सेल्सियस के लिए + 1 डिग्री/चक्र के लिए 30 एस, ६८ ° c 1 मिनट के लिए ४५ s + 1 s/ इसके बाद, ९४ ° c के लिए 23 बार के लिए चक्र, ४० s के लिए, ६५ ° c 30 s के लिए, ६८ ° c for 1 min ५३ s + 1 s/ अंत में, 3 मिनट ४० एस के लिए ६८ डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार प्रदर्शन और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए नमूनों ठंडा ।
  9. नीचे स्पिन सभी तरल इकट्ठा करने के लिए नीचे और डीएनए की गुणवत्ता की जांच करें या लंबी अवधि के भंडारण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस या-८० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान ।

7. WGA उत्पादों की गुणवत्ता नियंत्रण

नोट: एक 4plex QC-पीसीआर 5चलाने के बाद डीएनए धब्बा की सीमा और प्रवर्धन उत्पादों की संख्या के आधार पर WGA उत्पादों की गुणवत्ता की जांच करें । के मूल्यांकन के लिए एक १.०% agarose जेल पर WGA aliquots और संबंधित QC-पीसीआर नमूने चलाएं ।

  1. 4plex क्वालिटी कंट्रोल पीसीआर (टेबल 1) के लिए इस्तेमाल होने वाले सभी प्राइमरियों के १०० µ मीटर स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें । हर प्राइमरी के 8 µ एल जोड़ें १३६.० µ एल के लिए पीसीआर ग्रेड पानी प्राइमरी पूल के २०० µ एल उत्पंन करने के लिए । भंवर 3 एस के लिए समाधान, यह स्पिन नीचे २००० पर 3 एस के लिए एक्स जी और aliquot 20 µ एल पर भंडारण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस ।
  2. एक मल्टीप्लेक्स पीसीआर मास्टर मिक्स तैयार करने के लिए मानक पीसीआर किट का प्रयोग करें 2x पीसीआर घटकों के ६.० µ एल (प्राइमरों को छोड़कर), पीसीआर के ४.५ µ एल ग्रेड पानी और ०.५ µ प्राइमर पूल के एल ।
  3. WGA उत्पादों के १.० µ एल जोड़ें, यह स्पिन नीचे और 2 मिनट के लिए ९४ ° c पर 1 मिनट, प्राइमर एनीलिंग के लिए ५६ ° c पर 1 मिनट और प्राइमर विस्तार के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस पर विकार के लिए ९४ ° c पर पीसीआर चलाने के लिए 1 ंयूनतम 30 एस और एक अंतिम विस्तार कदम 7 मिनट के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस पर यह 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा, यह नीचे स्पिन और जेल विश्लेषण के लिए बर्फ पर एक ही दिन या बाद में विश्लेषण के लिए पर-20 डिग्री सेल्सियस के नमूने जगह है ।
    नोट: Peltier तत्वों की दीर्घायु को बढ़ाने के लिए थर्मल साइकिल चालक में द्रुतशीतन 12 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया जा सकता है ।
  4. एक agarose जेल5पर WGA उत्पादों (६.८. से प्राप्त.) और संबंधित 4plex QC-पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण करें ।

Representative Results

CFSE और न्यूक्लिक धुंधला के बाद कोशिकाओं DAPI और FITC के लिए फिल्टर के साथ सुसज्जित एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । DAPI चैनल में एक उज्जवल counterstain के साथ उपस्थित नाभिक जबकि कोशिकाओं की कोशिका द्रव्य विषम अंतर-कोशिका तीव्रता (चित्र 2a और CFSE) के साथ 2E के साथ समान लेबलिंग दिखाएँ. इसी तरह के आकार और धुंधला तीव्रता तार से जुड़ी कोशिकाओं से उम्मीद कर रहे हैं (चित्रा 2 बी और 2F) और साथ ही तार से अलग और एक स्लाइड पर बरामद (चित्रा 2d और 2H).

उच्च कोशिका घनत्व (उदा. > 1 ००० ००० कक्ष/एमएल) तारों को चार्ज करते समय कोशिकाओं के साथ तार की कुल कवरेज में परिणाम हो सकता है । हालांकि, कम सेल घनत्व, मशीनीकरण के दौरान रोटेशन की गति में परिवर्तन, और अलग सेल लाइनों के उपयोग अलगाव दक्षता को प्रभावित और अलग से परीक्षण किया जा करने की आवश्यकता है । जब तारों से 5 मिलीलीटर एचटी-29 कोशिकाओं में १०० ००० कोशिकाओं/एमएल के रूप में धारा २.१ में वर्णित के रूप में की मशीन थे ।, २५४ ± १०३ कोशिकाओं का मतलब (n = 5) तारों पर कब्जा कर लिया गया । LNCaP कोशिकाओं का उपयोग कर एक ही प्रयोग के साथ, तार प्रति ४४० ± ३१९ कोशिकाओं (n = 5) का मतलब प्राप्त किया गया था ।

पेश ५००, ५ ०००, और ५० ००० एचटी-29 परिधीय रक्त के तारों को 5 मिलीलीटर की एक पृष्ठभूमि में कोशिकाओं (प्रोटोकॉल धारा २.२ के अनुसार.) ७५ ± 18 कोशिकाओं, 25 ± 9 कोशिकाओं, और ४७ ± ५७ कोशिकाओं (n = 3, प्रत्येक), क्रमशः के कब्जा में हुई । यदि तार के साथ 15 µ l के सेल निलंबन (१ ००० ००० कोशिकाओं/एमएल) धारा २.३ में प्रोटोकॉल के अनुसार चार्ज किया जाता है., अप करने के लिए १ ००० (एचटी-29) कोशिकाओं एक तार करने के लिए संलग्न कर सकते हैं.

सेल टुकड़ी क्षमता एचटी-29 कोशिकाओं में ८१% से लेकर (रेंज ५४.९%-९३.२%, और n = 5) से ८१% (श्रेणी 63.51%-९२.८७%, n = 6) और ९१% (रेंज ८४.७%-९५.३%, एन = 6) LNCaP और VCaP कोशिकाओं में क्रमशः । इसी तरह, अलग कोशिकाओं की वसूली सेल लाइनों के बीच अलग है: अलग एचटी के 28% का मतलब-29 कोशिकाओं cytocentrifugation द्वारा बरामद किए गए । जबकि LNCaP के लिए वसूली दर 10% से कम थी, VCaP कोशिकाओं के लिए मतलब वसूली दर ५५% थी ।

wga उपज उच्च गुणवत्ता wga उत्पादों के अधीन एकल कोशिकाओं के लगभग ७५%: यह 1 है) ०.१ से > 1 kb (चित्रा 4, शीर्ष पैनल) और 2) 4plex गुणवत्ता नियंत्रण पीसीआर में तीन या चार बैंड (चित्रा 4, नीचे पैनल) को लेकर WGA उत्पादों का धब्बा . wga उत्पादों 1 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) सरणी-CGH एकल सेल सरणी के लिए गुणवत्ता मानदंड-CGH प्रोफाइल 6,7 और 2) पुनः प्रवर्धन के बाद NGS लक्षित WGA बैठक रूपरेखा 7।

Figure 1
चित्र 1: एकल-कक्ष विश्लेषण के लिए लक्ष्य कक्षों को अलग करने और पुनर्प्राप्त करने के लिए कार्यप्रवाह. (क) कोशिकाओं को ९०% की संस्कृति को प्रभावित कर रहे है और (ख) के लिए एक एकल सेल निलंबन प्राप्त काटा । CFSE और न्यूक्लिक दाग के साथ दाग के बाद, (ग) कार्यात्मक तार की कोशिकाओं की उपस्थिति में या तो 5 मिलीलीटर की एक मात्रा में प्रतिक्रिया ट्यूब का उपयोग कर या एक कम मात्रा में एक पाश्चर पिपेट टिप का उपयोग कर मशीन है । उत्तरार्द्ध के रूप में सेल निलंबन संस्करणों के आवेदन के लिए अनुमति देता है के रूप में कम के रूप में 15 µ एल (घ) कोशिकाओं को चार्ज करने के बाद 4 ज के भीतर अलग किया जाना चाहिए. इसलिए, तार एक १.५ मिलीलीटर प्रतिक्रिया जारी बफर के साथ भरा ट्यूब में रखा गया है । एक झूली कुरसी और 10 ंयूनतम केंद्रापसारक पर 15 मिनट की मशीन के बाद, तार हटा दिया जाता है और सेल निलंबन के लिए कोशिकाओं गोली केंद्रापसारक है । (E) पुनर्प्राप्त कक्षों को या तो एकल-कक्ष micromanipulation (ऊपर) या cytocentrifuged के लिए एक ग्लास स्लाइड पर स्थानांतरित कर दिया जाता है और एक झिल्ली-लेपित स्लाइड पर और लेजर microdissection (नीचे) को अग्रेषित किया जाता है । (च) अंत में, काटा एकल कोशिकाओं को पूरे जीनोम प्रवर्धन (WGA) के माध्यम से परिलक्षित कर रहे हैं । WGA उत्पादों सरणी-CGH और लक्षित NGS बहाव के विश्लेषण के साथ संगत कर रहे हैं । EpCAM epitope: सेल सतह पर ग्रीन सर्कल । कार्यात्मक तार: डिवाइस, ग्रे ट्रिपल-पेचदार तारों । बहुलक: बैंगनी रेखाएं । विरोधी EpCAM एंटीबॉडी: ऑरेंज । बफ़र गतिविधि छोड़ें: लाल तीर । तेल मार्कर जगह में सेल निलंबन पकड़: डार्क ब्लू दीर्घवृत्त । बरामद सेल सस्पेंशन: लाइट ब्लू । micromanipulation के लिए केशिका: ब्लैक लाइन । आवर्धन: micromanipulation द्वारा काटा गया सेल बरामद, झिल्ली-कवर स्लाइड पर cytospin बरामद कोशिकाओं युक्त (धूसर भरा दीर्घवृत्त) । आवर्धन: बरामद किया जा रहा लेजर microdissected सेल (ग्रे परिपत्र लाइन: झिल्ली स्लाइड से झिल्ली लेजर microdissection के लिए रीढ़ के रूप में सेवारत), लेजर बीम के साथ उद्देश्य (नीली रेखा से नीचे झिल्ली स्लाइड आ) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: लेबल वाले कक्षों को विज़ुअलाइज़ करना. (A, E) चार्ज करने से पहले कोशिकाओं: कोशिकाओं CFSE और counterstained के साथ एक डीएनए intercalating डाई CFSE की एक सीमा (हरी) संकेत तीव्रता दिखा के साथ लेबल कर रहे हैं । (ख,च) लेबल के तार पर कब्जा कर लिया कोशिकाओं । (C,G) सेल के बाद वायर-टुकड़ी प्रक्रिया । (घ,ज) कोशिकाओं तार से अलग और एक स्लाइड पर cytocentrifugation द्वारा बरामद किया । CFSE: FITC चैनल (हरा) । डीएनए सना: DAPI चैनल (नीला) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: वायर और भंडारण डिब्बे । (क) तार का डिब्बा. (ख) कार्यशील भाग का विवरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: WGA उत्पादों की गुणवत्ता नियंत्रण एकल micromanipulated कोशिकाओं से प्राप्त. शीर्ष पैनल: WGA एकल कोशिकाओं से प्राप्त उत्पादों आमतौर पर डीएनए धब्बों में परिणाम ०.२ kb से लेकर > १.० केबी तक लगभग ०.५ kb में पीक तीव्रता के साथ । नमूनों की संख्या 1, 7 और 13 (तारक के साथ संकेत) दिखाने के इष्टतम या कोई डीएनए धब्बों । नीचे पैनल: WGA उत्पादों पर्याप्त गुणवत्ता के है अगर 4plex पीसीआर चार पीसीआर उत्पादों की पैदावार तीन या चार (१००, २००, ३००, और ४०० बीपी) । नमूने 1, 7, 10 और 13 से कम तीन बैंड दिखाने के लिए और आगे विश्लेषण से बाहर रखा जाएगा । लेन एम एक १०० बीपी सीढ़ी शामिल है और तारों अपर्याप्त WGA उत्पाद की गुणवत्ता के नमूनों का संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्राइमरी सीक्वेंस नोट
5 ′-gtt सीसीए ata tga टीटीसी cac सीसी-3 ′ १०० बीपी फॉरवर्ड प्राइमर
5 ′-सीटीसी ctg गाा गात ggt गात जीजी-3 ′ १०० बीपी रिवर्स प्राइमर
5 ′-agg tgg agc ढकोसला gct agc-3 ′ २०० बीपी फॉरवर्ड प्राइमर
5 ′-ttt tgc ggt gga aat गोरखा प्रशिक्षण सीटी-3 ′ २०० बीपी रिवर्स प्राइमर
5 ′-agg tga gac att ctt gct जीजी-3 ′ ३०० बीपी फॉरवर्ड प्राइमर
5 '-टीसीसी अधिनियम aac सीएजी टीसीए gcg टीसी-3 ′ ३०० बीपी रिवर्स प्राइमर
5 '-ऐका गोरखा बिल्ली जीसीसी एटीसी अधिनियम जीसी-3 ′ ४०० बीपी फॉरवर्ड प्राइमर
5 ′-gct tga caa agt ggt cgt टीजी-3 ′ ४०० बीपी रिवर्स प्राइमर

तालिका 1:4plex गुणवत्ता नियंत्रण पीसीआर के लिए प्राइमरी जुगाड़

Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक कार्यात्मक तार से कोशिकाओं को वापस लाने के लिए (डिवाइस के रूप में संदर्भित) के लिए पूर्व विवो एकल सेल जीनोमिक विश्लेषण. हम तीन EpCAM-सकारात्मक सेल लाइनों (एचटी-29, LNCaP, और VCaP) का परीक्षण किया, लेकिन सिद्धांत रूप में, इस विधि EpCAM व्यक्त करने के लिए किसी भी सेल लाइन के लिए लागू कर सकते हैं । EpCAM-सकारात्मक लक्ष्य कोशिकाओं शुद्ध सेल निलंबन के रूप में डिवाइस के लिए प्रस्तुत किया जा सकता है (२.१ देखें.) या पृष्ठभूमि कोशिकाओं के एक अधिशेष में मिश्रित (उदापरिधीय रक्त, २.२ देखें.) । जबकि विशेष रूप से उत्तरार्द्ध दुर्लभ कोशिका शर्तों के तहत अलगाव क्षमताओं का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तार से जुड़ी कोशिकाओं की संख्या की ठीक ट्यूनिंग वर्णित कम मात्रा दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है (२.३ देखें.) । के रूप में सेल लाइनों के बीच मतभेद की उंमीद कर रहे हैं, तार चार्ज करने के लिए उपयुक्त सेल घनत्व, रोटेशन की गति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मशीन समय की जरूरत संलग्न कोशिकाओं की संख्या का मूल्यांकन एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके empirically परीक्षण किया जाना है ।

एकल-कक्ष स्तर WGA पर जीनोमिक बहाव अनुप्रयोगों के लिए, की आवश्यकता है । पसंद की WGA विधि प्रयोगशालाओं के बीच अलग हो सकता है और, सिद्धांत रूप में, हमारे विधि से सभी तरीकों के लिए खुला है micromanipulation या लेजर microdissection से प्राप्त नमूनों को संभाल कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम एक enzymatically खंडित डीएनए के आधार पर एक गर्मी-विखंडन आधारित WGA7की तुलना में एक बेहतर प्रदर्शन के कारण विधि का उपयोग करें । वैकल्पिक, एकल कोशिकाओं इज़ोटेर्माल बाद डीएनए20,21रूपरेखा की अनुमति WGA को अग्रेषित किया जा सकता है ।

वर्णित प्रोटोकॉल जीनोमिक एकल सेल विश्लेषण के लिए कार्यात्मक तारों की एक नई पीढ़ी से जुड़ा होने के बाद बरकरार कोशिकाओं को ठीक करना है । कार्यात्मक तारों की पहली पीढ़ी है, जो भी केवल CE-बाजार पर अब तक vivo संवर्धन उपकरणों में अनुमोदित का प्रतिनिधित्व करते हैं, metastasized कैंसर रोगियों में CTCs की गणना के लिए इस्तेमाल किया गया । पिछले प्रकाशनों और हमारे स्वयं के डेटा वर्तमान सोने की मानक प्रौद्योगिकी2की तुलना में अधिक संवेदनशील होने के लिए vivo आइसोलेशन तकनीक में सुझाव देते हैं । इस प्रकार, डिवाइस में महसूस किया के रूप में एक वसूली सुविधा के साथ vivo अलगाव तकनीक में लैस एकल कोशिका स्तर पर लक्षण वर्णन के साथ उच्च सीटीसी वसूली के संयोजन की अनुमति देता है.

हालांकि, डिवाइस रोगियों में उपयोग के लिए साफ़ नहीं है, इस प्रकार, नैदानिक डेटा उपलब्ध नहीं हैं । पूर्व vivo अनुप्रयोगों (यानी अलग CTCs के बाद परिधीय रक्त से नमूना) की सिफारिश नहीं कर रहे हैं के रूप में प्रौद्योगिकी cubital व्यर्थ में मौजूद सेटिंग्स के लिए अनुकूलित है, व्यर्थ के कम व्यास उदा (की संभावना बढ़ रही है CTCs और पकड़ने एंटीबॉडी के बीच सीधा संपर्क) और लंबे समय प्रतिधारण (30 मिनट, रक्त की 2-3 एल तार पारित करने की अनुमति). हालांकि, के रूप में २.२ अनुभाग में उल्लिखित । लक्ष्य कक्षों को मिश्रित नमूनों7से भी पृथक किया जा सकता है ।

विधि की वर्तमान सीमा तारों से अलगाव के बाद स्थिर कोशिकाओं की अकुशल वसूली है । यह, तथापि, एक सेल निर्धारण कदम से सुधार किया जा सकता है टुकड़ी उपचार से पहले ।

संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से निस्र्पक एकल कोशिकाओं के लिए सेल वसूली के साथ एक vivo में अलगाव तकनीक के संयुक्त उपयोग की दिशा में पहला कदम है । इसके अलावा प्रयासों के रोगियों में अपने आवेदन के लिए सेल वसूली और मंजूरी के अनुकूलन का पता1,2की जरूरत है । हालांकि, उपचार की निगरानी और चिकित्सा के निर्णय के लिए व्यक्तिगत दवा CTCs की गणन से परे है । इस प्रकार, इस विधि एकल कोशिका स्तर पर जीनोमिक सीटीसी लक्षण वर्णन की दिशा में पहला कदम है ।

एकल सेल transcriptome विश्लेषण की दिशा में आवेदन बरकरार कोशिकाओं काटा जाता है के रूप में संभव लग रहे हैं । तथापि, यह आकलन किया जा रहा है कि क्या उबर प्रक्रिया पर आरएनए अखंडता (उदा. अग्रेषण-qPCR22के बाद प्रत्यक्ष lysis करने के लिए एकल कक्ष पुनर्प्राप्त) पर प्रभाव पड़ता है । यदि सफल, एकल कोशिकाओं के लक्षण वर्णन (जैसे CTCs) transcriptome स्तर पर स्थानांतरित किया जा सकता है, और अधिक विस्तृत विश्लेषण की अनुमति. इस संबंध में, आरएनए-seq स्मार्ट-seq2 का उपयोग कर एकल कोशिकाओं की आरएनए अनुप्रवाह विश्लेषण के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है के रूप में प्रवर्धित सीडीएनए (आरएनए-seq पुस्तकालय की तैयारी के दौरान प्राप्त) मात्रात्मक पीसीआर के अधीन किया जा सकता है । यह एक संयुक्त लक्ष्य और स्क्रीनिंग आधारित एकल बरामद कोशिकाओं22,23के विश्लेषण की अनुमति देगा ।

वर्तमान कार्यात्मक तारों विरोधी EpCAM एंटीबॉडी जो24CTCs के सकारात्मक चयन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया उपकला मार्कर है पर आधारित हैं । कई CTCs जैसे cytokeratins या EpCAM के रूप में उपकला मार्करों downregulate हो सकता है25, HER2 के रूप में एंटीबॉडी जोड़ने/नए सीटीसी अलगाव की संभावना बढ़ जाएगी । कई एंटीबॉडी आधारित संवर्धन रणनीतियों और विकसित किया गया है फरेरा एट अलद्वारा की समीक्षा की । २०१६ में26. एक तार पर एक एंटीबॉडी मैटीरियल का मिश्रण एक उच्च संख्या और CTCs के अतिरिक्त उपप्रकार के अलगाव के लिए अग्रणी प्रौद्योगिकी का एक भविष्य में सुधार हो सकता है ।

यह सभी तार हैंडलिंग को शामिल कदम के लिए अनिवार्य समाधान में जलमग्न तार के कार्यात्मक हिस्सा रखने के लिए अपनी कार्यक्षमता बनाए रखने के लिए है । हम मूल्यांकन (माइक्रोस्कोप के दौरान 1x पंजाब में तार जगह की सिफारिश; उदा. चरण ३.१ । -३.३.) और भंडारण । अनुचित दाग से बचने के लिए, हम कदम 1.2.1 में हौसले से तैयार दाग समाधान का उपयोग करने की सलाह देते हैं । और 1.2.2 । कमजोर से सना हुआ कोशिकाओं तार पर सेल गिनती बाधित और संलग्न कोशिकाओं के अनुमान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

यह सेल निलंबन (कदम 2.3.4.) के बाद लदान के लिए पाश्चर पिपेट में तार डालने जब रबर टोपी के साथ पाश्चर पिपेट plugging से बचने के लिए आवश्यक है. रबर टोपी जगह में तार पकड़ इतना है कि कार्यात्मक हिस्सा पाश्चर पिपेट की नोक के अंदर स्थित है प्रयोग किया जाता है । यदि टोपी भी मजबूती से पाश्चर पिपेट के पीछे से जुड़ा हुआ है, सेल निलंबन की लोडिंग संभव नहीं है । इस मामले में, टोपी ऐसी है कि हवा जो लोड सेल निलंबन से विस्थापित है पिपेट छोड़ सकते है कम ।

तार झुका कदम ३.२ में सेल की गिनती के दौरान अपने अभिविन्यास के लिए महत्वपूर्ण है । और ३.३. इस तरह के तार के गैर कार्यात्मक अंत एक तरफ झूठ करने के लिए आता है कि चिपकने वाला टेप का उपयोग कर तारों माउंट । कार्यात्मक भाग की पूरी लंबाई की स्कैनिंग के बाद, तार लुढ़का १८० ° है तो अंय कार्यात्मक तार के आधे स्कैन किया जा सकता है । तार पर कोशिकाओं की संख्या का आकलन करने के लिए प्रारंभिक प्रयोगों के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है । एक बार एक निश्चित सेल लाइन और प्रक्रिया के लिए कोशिकाओं की संख्या का मूल्यांकन किया है, प्रक्रिया सेल गिनती के बिना दोहराया जा सकता है (उदाकेवल कक्षों की उपस्थिति के लिए जांच कर रहा है या इस चरण को छोड़ रहा है) । सावधान pipetting जब चरण ४.८ में supernatant की मात्रा को कम करने के लिए सेल हानि से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । सुनिश्चित करें कि pipetting सुचारू रूप से गोली करने के लिए अशांति के कारण के बिना किया जाता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन के ऑस्ट्रिया के विज्ञान कोष (FWF), परियोजना-नहीं द्वारा वित्त पोषित किया गया । मैं १२२०-B19 (पी एस के लिए) में ERANET परियोजना के भाग के रूप में अनुवाद कैंसर अनुसंधान (TRANSCAN) "प्रोस्टेट कैंसर में ंयूनतम अवशिष्ट रोग के लिए के रूप में ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी (सीटीसी-स्कैन)" । पीएचडी परीक्षार्थी एस॰सी॰ को मेडिकल यूनिवर्सिटी ऑफ चरने के पीएचडी प्रोग्राम आणविक चिकित्सा के फ्रेम के भीतर प्रशिक्षित किया गया । लेखक आभार नीना Schlögl, डैनियल Kummer, गाबी Wendt, क्लाउडिया Chudak, जूलिया Schulz, और Johanna Schiller अपने विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार करते हैं । लेखक चित्रमय डिजाइन समर्थन के लिए Georg Peinhaupt धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gilupi Release Buffer Gilupi GIL083 Used to detach cells from the wire
McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 16600-082 Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments
HEPES Buffer Solution (1 M) PAA S11-001 Supplement for McCoy's 5A Medium
Foetal Bovine Serum Gold PAA A15-151 Supplement for McCoy's 5a Modified Medium
Penicillin-Streptomycin (100x) Biowest L0018-100 Supplement for McCoy's 5a Modified Medium
Phosphate Buffered Saline (1x PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-015
Accutase Biowest L0950-100 Cell detachment solution (cell culture)
Water bath GFL Type 1003 Used for prewarming solutions
Incubator Thermo Fisher Scientific Used to incubate cells (cell culture)
50 mL reaction tubes VWR 525-0403
Roller mixer Stuart Scientific SRT6D Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher Scientific C34554 Used to label living cells (cytoplasmic label)
Hoechst 33342 H3570 Thermo Fisher Scientific Used to stain DNA (nucleic counterstain)
Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) Thermo Fisher Scientific Heraeus Megafuge 40R Used for pelleting cells
Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) Carl Zeiss Microimaging Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter)
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503-50G Used for coating glass/plastic surfaces
MS1 Minishaker Sigma-Aldrich Z404039 Used for vortexing
Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes BD 366450 (or 366480) Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells
Detektor CANCER03 DC03 Gilupi GIL003 Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R)
Syringe needles (G20) VWR 613-0554 Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it
Neubauer chamber Roth T729.1 Used to count cells
Pasteur pipettes 150 mm Volac D810 Used for the low-volume application of cells to the C&R
Grease pen Dako S2002 Used on glass slides to hold cell suspension in place
Steril syringe filter (0.2 µm) Corning 431219 For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer
Delfia PlateShaker Perkin Elmer 1296-003 Used for agitation during cell detachment
1.5 mL tubes Eppendorf 30,125,150
Ampli1 WGA Kit Silicon Biosystems To be ordered via Silicon Biosystems
Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario Zeiss/Eppendorf Use micromanipulation at hand
Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I Eppendorf 930001201 Used for micromanipulating cells
0.2 mL PCR tubes Biozym 710920
Cytocentrifuge and equippment Hettich Universal 32 Use cytocentrifuge at hand
Thermo cycler Bio-Rad DNA Engine Dyad Every thermo cycler with heated lid can be used
Microcentrifuge Roth CX73.1 Use desk-top centrifuge at hand
MembraneSlide 1.0 PET Zeiss 415101-4401-050 Membrane-coated glass slides used for laser microdissection
UV Stratalinker 1800 Stratagene 400072 Use DNA cross linker at hand
Standard PCR reagents
6x DNA Loading Thermo Fisher Scientific R0611 Use gel loading dye at hand
DNA ladder BioLabs N0551G Use 100 bp ladder at hand
Agarose Biozym 840004
Gel electorphoresis station Bio-Rad Use electrophoresis system at hand
Gel Red Nucleic Acid Stain Biotium 41003 Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels

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References

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Chen, S., El-Heliebi, A., Schmid, J., Kashofer, K., Czyż, Z. T., Polzer, B. M., Pantel, K., Kroneis, T., Sedlmayr, P. Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization. J. Vis. Exp. (135), e56394, doi:10.3791/56394 (2018).

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