Summary
Dieses Protokoll ist zu erholen und molekulare genetische Charakterisierung der Ebene der einzelligen seltene Zielzellen aus einer Mischung mit Nichtziel-hintergrundzellen vorbereiten. DNA-Qualität entspricht nicht behandelten Einzelzellen und einzellige Anwendung (sowohl Screening basiert und gezielte Analyse) ermöglicht.
Abstract
Seltene Zielzellen können aus einem hohen Hintergrund von nicht-Ziel-Zellen Antikörper spezifisch für Oberflächenproteine von Zielzellen mit isoliert werden. Eine neu entwickelte Methode verwendet einen medizinische Draht funktionalisiert mit Anti-Epithelzelle Adhäsion Molekül (EpCAM) Antikörper zur in-Vivo -Isolierung zirkulierender Tumor Zellen (CTCs)1. Eine Patient abgestimmt Kohorte in nicht-metastatischem Prostatakrebs zeigte, dass die in-Vivo -Isolierung-Technik führte zu einen höheren Prozentsatz von Patienten positiv für CTC sowie höhere CTC zählt im Vergleich zu den aktuellen Goldstandard in CTC-Enumeration. Wie Zellen aus aktuellen medizinischen Geräten wiederhergestellt werden können, wurde ein neues funktionalisierten Kabel (als Gerät bezeichnet) durch enzymatische Behandlung hergestellt ermöglicht Erfassung und anschließende Ablösung der Zellen. Zellen sind Anfügen an das Gerät, auf dem Mikroskop sichtbar gemacht und gelöst mit enzymatischen Behandlung erlaubt. Wiederhergestellte Zellen sind Cytocentrifuged auf Membran-beschichtete Folien und einzeln mittels Laser Mikrodissektion oder Mikromanipulation geerntet. Einzellige Proben werden dann ganze Genom einzellige Verstärkung erlaubt mehrere nachgelagerte Analyse einschließlich Screening und Target-spezifische Ansätze unterzogen. Das Verfahren der Isolation und Erholung liefert qualitativ hochwertige DNA aus einzelnen Zellen und anschließende ganze Genom Verstärkung (WGA) nicht beeinträchtigt. Eine einzelne Zelle amplifizierten DNA kann auf Screening weitergeleitet werden und/oder gezielte Analyse wie Array vergleichende Genom Hybridisierung (Array-CGH) oder Sequenzierung. Das Gerät ermöglicht ex Vivo Isolation von künstlichen seltene Zellproben (d.h. 500 Zielzellen in 5 mL des peripheren Blutes versetzt). Während Loslösung der Zellen akzeptabel (50-90 %) sind, die Wiederfindungsrate freistehende Zellen auf Folien umfasst ein breites Spektrum hängt von der Zell-Linie verwendet (< 10 - > 50 %) und einige weitere Aufmerksamkeit benötigt. Dieses Gerät ist nicht für die Anwendung bei Patienten gelöscht.
Introduction
Vor kurzem wurde CellCollector DC01, eine medizinische Leitung funktionalisiert mit Anti-EpCAM Antikörper zur Isolierung von CTCs aus dem peripheren Blut von Krebspatienten, das methodische Spektrum der CTC-Enumeration1,2,3 hinzugefügt . In einer laufenden Studie mit nicht-metastatischem Prostatakrebs funktionalisierten Draht berichtet fast doppelt so viele Patienten CTC-positiv sein und höhere CTC zählt im CTC-positiven Patienten im Vergleich zu CellSearch, den Goldstandard in CTC-Enumeration3 . Aufgrund dieser erfreulichen Entwicklung Isolation von Zellen aus dem funktionalisierten medizinische Draht für einzellige Analyse wäre wünschenswert, aber weder enzymatische Behandlung mit Zelle Ablösung Lösungen (z.B. Trypsin) Laser Mikrodissektion ermöglicht die Wiederherstellung der intakten Zellen (Daten nicht gezeigt).
Um das Ablösen der erfassten Zellen zu ermöglichen, wurde eine neue Generation von funktionalisierten Drähte mit einem speziellen Polymer ausgestattet. Dieses Polymer, das die Capture-Antikörper auf den Draht verbindet, ist anfällig für eine Veröffentlichung Puffer Behandlung ermöglicht Ablösung der intakte Zellen (CellCollector DC03 bezeichnet als Gerät). Das neue funktionalisierten Gerät ermöglicht Isolation der Zielzellen aus verschiedenen Konzentrationen von Krebszellen Zelle Zeile versetzt in Rinderserumalbumin (BSA) / Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und peripheren Blut, beziehungsweise.
Um die visuelle Erkennung von Zellen auf dem Gerät und nach der Genesung zu erleichtern, sind die Krebszellen mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-) und eine DNA-Fleck vor der Wiederherstellung Behandlung beschriftet (i.e. Lade- und abnehmen). Die behandlungseffekte auf DNA-Qualität einzelner Zellen wurden zuvor nach WGA mittels einer Qualitätskontrolle PCR4,5, Array-CGH6,7 bewertet und gezielte Sequenzierung7 zeigen keinen Unterschied im Vergleich zu unbehandelten Zellen Micromanipulated Zelle Suspensionen7. Der Vorteil dieser Methode liegt in der Kombination von seltenen Zielzelle Voranreicherung und die Erholung der Zellen für einzellige nachgelagerte Analyse (Abbildung 1). Die aktuellen CE-Kennzeichnung in Vivo sammelvorrichtung dient in der Regel für die Enumeration von CTC nicht für einzellige molekulare Charakterisierung2,8. Jedoch umfassendere Analyse zu untersuchen, Heterogenität unter CTCs lang für Analysen auf der Ebene der einzelnen Zelle (d. h. gezielte Sequenzierung der Ebene der einzelligen). Andere Zell-basierte Methoden basieren auf Immunomagnetic Isolierung von EpCAM-positiven CTCs und einzellige Handling basierend auf Dielektrophorese für nachfolgende molekulargenetisch analysiert9,10. Molekulare Charakterisierung von CTCs ist eine wichtige Voraussetzung für ihre nützliche Umsetzung in einem klinischen Umfeld und ist ebenso wichtig für die Grundlagenforschung der metastatischen Kaskade. Parallel zur CTCs zirkulierenden Tumor-DNA (CtDNA) von großer Bedeutung geworden es DNA-Analyse der tumorlast mit minimalen technischen Isolierung Verfahren11,12erlaubt. Die zellbasierte Ansätze als einen ergänzenden Beitrag dienen könnte, denn es ermöglicht eine RNA13,14 und Eiweiß15 Expressionsanalyse und auch für CTC abgeleitet Zelle Kulturen oder Xenotransplantate16, 17. Obwohl Hindernisse wie niedrige Zelle Erholung und Freiraum für die Anwendung bei Patienten noch überwunden werden müssen, die fangen und freilassen-Methode akzeptiert einen wichtigen nächsten Schritt zur Charakterisierung der seltenen Zielzellen.
Protocol
Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission der medizinischen Universität Graz (25-240 ex 12/13) genehmigt. Peripheren Blut für Spick Experimente wurde von gesunden Personen gesampelt.
Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Isolation der HT-29 Zellen (menschliche Dickdarm Krebs Zell-Linie) von PBS oder von künstlichen Mischungen von HT-29 Zellen und peripherem Blut. Das gleiche Experiment wurde mit zwei zusätzlichen Zelllinien (LNCaP und VCaP, experimentellen Daten in Vertreter Ergebnissen) durchgeführt und kann theoretisch mit allen Zellen, die mit dem Ausdruck EpCAM durchgeführt werden.
1. Vorbereitung der Zielzellen
- Zellkultur und Kennzeichnung von Zellen
Hinweis: In diesem Protokoll sind Zellen in 75 cm ² Kulturflaschen kultiviert. Bitte die Mengen von Reagenzien entsprechend anpassen, wenn andere Zelle-Kultur-Geräte verwendet werden (z.B. 25 cm ² Kultur Geschirr, 6-Well Platten, usw.). Alle verwendete Flüssigkeiten sind auf 37 ° C in einem Wasserbad vorgewärmt. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Protokoll-Schritte bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt.- Kultur HT-29 Zellen in McCoys 5a geändert Medium mit 20 mM Hepes, 2 mM L-Glutamin, 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 ° C in 5 % CO2 Atmosphäre ergänzt.
- Wenn Zellen 90 % Zusammenfluss sind, entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen mit 10 mL 1 X PBS.
- Um Zellen zu ernten, die Zellen 2 mL der Zelle Ablösung Lösung (Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) hinzu und inkubieren die Zellen für ca. 5 min bei 37 ° c
Hinweis: Die Ablösung Lösung enthält proteolytische und Collagenolytic Enzyme in 1 x PBS, 0,5 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) und 3 mg/L Phenol rot. Reduzieren Sie vor Erwärmung Zeit der Zelle Ablösung Lösung auf ein Minimum, da dies nach 1 h bei 37 ° c inaktiv sein wird Decken Sie die ganze Zellschicht um optimale Zelle Loslösung zu erhalten. - Überprüfen Sie die Loslösung der Zellen mit einem inversen Mikroskop.
- Alle freistehende Zellen auf eine 50 mL-Tube vorausgefüllt mit 10 mL Zellkulturmedium (gleiche wie in Schritt 1.1.1.) übertragen und Aufschwemmen der Zellen durch pipettieren.
- Legen Sie die restlichen Zellsuspension auf einem horizontalen Rolle Mixer bei RT und mit der Kennzeichnung Schritt fortfahren.
- Zelle Kennzeichnung von Zielzellen zu leben
- 5 mM CFSE (im Lieferumfang enthalten in Dimethyl Sulfoxid, DMSO) in 1 mL 1 X PBS verdünnen 1 µL vorgewärmt bei 37 ° C, 5 µM Ready-to-Use CFSE-Kennzeichnung Lösung zu erhalten.
Hinweis: Verwenden Sie für optimale Färbung Ergebnisse frisch zubereitete Lösungen. - Bereiten Sie ein Ready-to-Use DNA Färbelösung (Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) mit 1 X PBS-Puffer und bei 2 bis 6 ° C, vor Licht geschützt aufbewahren.
Hinweis: Verwenden Sie für optimale Färbung Ergebnisse frisch zubereitete Lösungen. - Erhalten Sie die Zellen aus horizontalen Rolle Mischer (Schritt 1.1.6.) und Pellets, die die Zellen bei 300 X g für 10 min. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL 1 X PBS.
- Spülen Sie die Zellen wieder mit 1 X PBS und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 500 µL Ready-to-Use CFSE-Kennzeichnung Lösung.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 15 min und sammeln Sie die Zellen nach der Zentrifugation bei 300 X g 3 Minuten lang.
- Aufschwemmen Sie die markierten Zellen in 1 mL vorgewärmten Zellkulturmedium und lassen Sie die Zellen regenerieren bei 37 ° C für 30 min.
- Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 300 X g 3 min und Aufschwemmen der Zelle Pellets in 1 mL Färbelösung bei 37 ° C für 10 min Ready-to-Use-DNA.
- Pellet-Zellen, Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen in 4 mL 1 X PBS. Beurteilen Sie die Zelldichte mit einem Hemocytometer und überprüfen Sie für Fluoreszenz Kennzeichnung mit einem Fluoreszenzmikroskop mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und Fluorescein erfolgt (FITC) Filter (Abbildung 2A und 2E) ausgestattet.
- Die Zellen bei 300 X g für 3 min zentrifugieren und Aufschwemmen der Zelle Pellets nach den Zelldichten benötigt für das jeweilige Experiment wie im nächsten Abschnitt und Platz auf dem Eis.
- 5 mM CFSE (im Lieferumfang enthalten in Dimethyl Sulfoxid, DMSO) in 1 mL 1 X PBS verdünnen 1 µL vorgewärmt bei 37 ° C, 5 µM Ready-to-Use CFSE-Kennzeichnung Lösung zu erhalten.
2. Laden den Draht
Hinweis: Zellen können von Ziel Zelle/peripheren Blut Spikings an der Milliliter-Skala oder durch eine geringe Anzahl von Zellen in einem Mikroliter Maßstab isoliert werden. Während der ehemaligen Ansatz ermöglicht für die Nachahmung Zustand selten-Zellen im peripheren Blut, kann letztere die bevorzugte Methode für einige Zellen zum Zwecke der Optimierung/Protokolltests zu befestigen sein.
- Laden den Draht mit einer großen Anzahl von Zellsuspensionen
- Bereiten Sie einen 2 % BSA Blockaden Lösung durch Auflösen von 0,8 g der BSA in 40 mL 1 X PBS (Zelle Kultur verwenden). BSA durch anfängliche aufschütteln und anschließenden Inkubation bei RT auf einem horizontalen Rolle Mixer für 10-20 min auflösen.
- Spülen leer EDTA Röhrchen/Natrium Heparin Röhrchen mit 2 mL 2 % BSA, Antikoagulans Rückstände entfernen und entsorgen Sie die Lösung. Blockieren Sie die Rohroberfläche durch Inkubation bei RT mit 5 mL von 2 % BSA auf einem horizontalen Rolle Mixer bei 15 u/min für 30 min und verwerfen Sie die Lösung zu.
- Verdünnen Sie markierte Zellen (Abschnitt 1.2) zu einer Dichte von 100 000 Zellen/mL und verwenden Sie 5 mL, um den Draht zu berechnen.
- Das Röhrchen 5 mL der markierten Zelle Suspension (500 000 Zellen insgesamt) hinzufügen. Vermeiden Sie Luftblasen, wenn die Zellsuspension hinzufügen.
- Entfernen Sie das Kabel aus dem Staufach sowie die Gummikappe hält den Draht und spülen Sie ihn mit 1 X PBS-Puffer (Abbildung 3).
- Dringen Sie die Gummikappe Rohr von EDTA-Röhrchen (Schritt 2.1.4.) mit Hilfe einer Spritze Nadel (20G) und stecken Sie das Kabel so, dass das Funktionsteil in der Zellsuspension vollständig eingetaucht ist, wenn die Kappe wieder auf das Rohr und das Rohr auf dem geneigten Walze Mischer befindet.
Hinweis: Die Dreifach-spiralförmige Funktionsteil des Drahtes sollte mit Zellsuspension während der Aufladung abgedeckt werden. - Drehen Sie die Rohre auf einem geneigten Walze Mixer 5 u/min für 30 min damit die Zellen an den Draht befestigen.
- Spülen Sie den Draht mit 5 mL 1 X PBS und speichern Sie es im Dunkeln bei 2 bis 6 ° C in einem 15 mL Röhrchen mit 1 X PBS bis Sichtprüfung.
Hinweis: Das Funktionsteil des Drahtes muss immer mit PBS-Puffer zu vermeiden, schadet die Zellen getaucht werden.
- Isolieren von Zielzellen aus künstlichen Mischungen mit peripherem Blut (Alternative Ladeverfahren zu: 2.1. Laden den Draht mit einer großen Anzahl von Zellsuspensionen)
- Verdünnen Sie markierte Zellen (Abschnitt 1.2) um Zellsuspensionen mit hoher Zelldichte zu erhalten (> 1 000 000 Zellen/mL), wodurch das Volumen der Zellsuspension hinzugefügt, um die peripheren Blut niedrig zu halten.
- 5 mL des peripheren Blutes fügen Sie 500 bis 500 000 Zellen hinzu und mischen sie durch das Rohr zu invertieren.
- Entfernen Sie das Kabel aus dem Staufach, entfernen Sie die Gummikappe hält den Draht zu und spülen Sie ihn mit 1 X PBS-Puffer.
- Dringen Sie eine neue Röhre Kappe mit dem nicht-funktionalen Teil des Gerätes mit Hilfe einer Spritzennadel (20G), so dass Funktionsteil im Spike Blut vollständig eingetaucht ist, wenn die Kappe wieder auf das Rohr und das Rohr auf dem geneigten Walze Mischer platziert wird.
Hinweis: Die Dreifach-spiralförmige Funktionsteil des Drahtes sollte mit Zellsuspension während der Aufladung abgedeckt werden. - Inkubieren Sie das Rohr auf den geneigten Walze Mixer 5 u/min für 30 min bei RT
- Spülen Sie den Draht 3 Mal in 1 X PBS und speichern Sie es im Dunkeln in einem 15 mL Röhrchen mit 1 X PBS bis Sichtprüfung.
Hinweis: Das Funktionsteil des Drahtes darf immer getaucht werden, um zu vermeiden, die Zellen zu schädigen.
- Laden den Draht von geringem Volumen Zellsuspensionen (Alternative Ladeverfahren zu: 2.1. Laden den Draht mit einer großen Anzahl von Zellsuspensionen)
- Die markierten Zellen bei 1 000 000 Zellen/mL in 1 X PBS aufzuwirbeln.
- Befestigen Sie ein 150 mm Einweg Glas Pasteurpipette horizontal auf einem Gestell.
- Entfernen Sie das Kabel aus dem Ablagefach, aber halten Sie die Gelbe Gummikappe hält den Draht.
- Legen Sie den Draht in die Pipette, derart, dass der funktionalisierten Teil befindet sich in der Spitze der Pasteurpipette das Glas nicht berühren.
Hinweis: Die Spitze des Drahtes nicht aus der Pasteur PIPETTENSPITZE kleben sollte. Vermeiden Sie das hintere Ende des Pasteur-PIPETTENSPITZE mit der Gummikappe hält das Kabel einstecken. Wenn eng verbunden, können Zellsuspensionen von der anderen Seite in die PIPETTENSPITZE geladen werden. - Laden Sie 15 µL Zellsuspension in der Spitze der Pasteurpipette für die funktionalisierten Teil des Drahtes.
- Inkubieren Sie dem Draht für 10 min. manuell Vierteldrehung der montierten Draht/Pasteur PIPETTENSPITZE jede Minute.
- Entfernen Sie das Kabel von der Pasteur PIPETTENSPITZE, spülen Sie es in 5 mL 1 X PBS und speichern Sie es im Dunkeln bei 2 bis 6 ° C in einem 15 mL Röhrchen mit 1 X PBS bis Sichtprüfung.
Hinweis: Das Funktionsteil darf immer mit 1 X PBS-Puffer zu vermeiden, schadet die Zellen getaucht werden.
(3) zählen Zellen auf dem Draht
Hinweis: Halten Sie das Funktionsteil des Drahtes unter Wasser mit 1 X PBS-Puffer zu vermeiden, die Zellen zu schädigen.
- Verwenden Sie einen Fett-Stift zeichnen einen Rechteckbereich auf einen Glasobjektträger und 500 µL 1 X PBS.
- Biegen Sie den nicht-funktionalen Teil des Drahtes und legen Sie es auf den Objektträger, so dass das Funktionsteil in 1 X PBS eingetaucht ist.
Hinweis: Passen Sie die Fläche des Rechtecks und Volumen von 1 X PBS Funktionsteil des Drahtes vollständig bedecken. Verwenden Sie eine doppelseitige Klebeband, um den nicht-funktionalen Teil des Drahtes auf der Folie zu montieren. - Überprüfen Sie beide Seiten des Drahtes, die erfassten Zellen (Abb. 2 b und 2F) aufzulisten.
Hinweis: Das Vorhandensein von Zellen wird bestimmt mit einem Fluoreszenzmikroskop für DAPI und FITC mit Filtern ausgestattet. Beide Seiten des Drahtes können kontrolliert werden und die Anzahl der Zellen (für hohe Zellzahlen) bewertet oder gezählt (nur durchführbar, wenn niedrige Zahl von Zellen an den Draht befestigt sind). Dieser Schritt kann übersprungen werden, wenn die Aufzählung der Zellen nicht notwendig ist. - Nach dem Scannen, platzieren Sie das Kabel wieder in die 15 mL Röhrchen mit 1 X PBS (siehe Hinweis von 2.3.6. und Abschnitt 3.), speichern sie den Draht in Dunkelheit.
Hinweis: Die meisten der nicht-funktionalen Teil des Drahtes können geschnitten (einschließlich der Kurve) und Lockerung Speicher entfernt.
4. Trennung und Verwertung von Zielzellen
Hinweis: Ablösung der Zellen innerhalb von 4 Stunden nach Isolierung erfolgt.
- Lösen Sie der Freigabe Puffer Komponente (Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) 4 mg pro mL 1 X PBS auf und Filtern Sie die Lösung durch einen 0,2 µm Sterilfilter, Ready-to-Use-Puffer zu erhalten.
Hinweis: Das Polymer des Drahtes besteht aus einem Hydrogel die mit Anti-EpCAM Antikörper ermöglicht Bindung an Zielzellen EpCAM-präsentierenden funktionalisiert. Der Release-Puffer enthält eine proteolytische Enzym zur Spaltung der Hydrogel Kohlenstoff und Sauerstoff. Proteolytische Spaltung führt zu Abbau des Polymers und damit Ablösung der erfassten Zellen. - Vorwärmen des Freigabe-Puffers bei 37 ° C für 5 min.
- Hinzugeben Sie 1,6 mL Version Puffer füllen eine 1,5 mL Reaktionsgefäß.
Hinweis: Rohre ausgelegt für 1,5 mL Reaktion Volumen ermöglichen Anwendung von 1,6 mL, die für das Funktionsteil des Drahtes eintauchen. - Inkubieren Sie das Funktionsteil des Drahtes in der Release-Puffer bei 37 ° C (Wasserbad), 20 min. benutzen die Gummikappe ausgeliefert mit dem Draht statt Rohr Kappe um den Draht in der 1,5 mL Tube zur Vermeidung von Kontaminationen während der Inkubation im Wasserbad zu beheben.
- Übertragen Sie Draht/Rohr-Montage auf einen Shaker für 15 min bei RT und 500 u/min.
Hinweis: Der Shaker hat eine Umlaufbahn von 1,5 mm. - Legen Sie den Draht/Rohr-Montage in einer Zentrifuge und mit 300 X g für 10 min. drehen.
- Entfernen Sie das Kabel aus der Tube, schließen Sie den Deckel und Zentrifugieren Sie das Rohr wieder auf 300 X g für 10 min.
Hinweis: Der Draht kann in 1 X PBS bei 2 bis 6 ° C im Dunkeln zum Zelle zählen um Ablösung/Effizienzprüfung für Zellen, die noch auf den Draht zu beurteilen gespeichert werden. - Um das Volumen der Zellsuspension zu verringern, entfernen Sie alle bis auf 100 µL (Mikromanipulation) oder alternativ 300 µL des Überstands (Cytocentrifugation und anschließende Laser Mikrodissektion) und fahren Sie sofort mit einzelligen Probenahme.
(5) einzellige Probenahme
- Mikromanipulation
Hinweis: Einzelne Zellen werden 2 µL der Zelle Lysis master-Mix ermöglicht WGA hinzugefügt werden. Bereiten Sie master-Mix nach der Anzahl der Zellen, die verarbeitet werden, zusätzliche Mengen für Verlust durch pipettieren und Ort Zelle Lysis master-Mix auf dem Eis zu berechnen.- Bereiten Sie die Zelle Lysis master-Mix (Komponenten der WGA-Kit, Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) gemäß dem Protokoll von Czyz Et al.18skizziert. Kurz, mischen 2.0 µL Reaktion Puffer, 1.3 µL des Octylphenoxypolyethoxyethanol (10 % ige Lösung), 1.3 µL 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) Phenyl-Polyethylenglykol (10 % ige Lösung), 2,6 µL einer Proteinase K-Lösung und 12,8 µL RNase/DNase-freie Wasser um zu erhalten eine Master-Mix für 10 Proben (Gesamtvolumen 20 µL).
Hinweis: Für weitere Beispiele, erhöhen Sie die Mengen entsprechend. Die Zusammensetzung der Zelle Lysis master-Mix unterscheidet sich von der in das alternative Verfahren nutzt Laser Mikrodissektion Proben (siehe 5.2.). - Verwenden Sie einen Fett-Stift zum Zeichnen einer Fläche die Zellsuspension in Position zu halten. Fläche und das Volumen einstellen, wenn die Zelldichte zu hoch ist (dh. Markieren Sie einen größeren Bereich auf der Glas-Folie, 1 x PBS und ein Aliquot der Zellsuspension zu laden).
- Pipette die gesamte gefärbten Zellsuspension (abgerufen im Schritt 4.8.) auf den Objektträger.
- Übertragen Sie den Objektträger an ein Mikroskop mit einem Mikromanipulator ausgestattet. Lassen Sie die Zellen, die für 5 min (Abb. 2D und 2 H) zu begleichen.
- Bereiten Sie 0,2 mL PCR-Röhrchen mit 2.0 µL Zelle Lysis Meisters geladen mischen (siehe Punkt 5.1.1.) und speichern Sie es auf dem Eis zu.
- Sammeln Sie einzelne Zellen in 1 µL 1 X PBS mit dem Mikromanipulator und übertragen Sie die Zellen in ein Röhrchen mit Zelle Lysis master-Mix.
Hinweis: Für die Übertragung von Micromanipulated Zellen in der Zelle Lysis Puffer legen Sie die Kapillare direkt in die 2 µL Lyse-Lösung und werfen Sie bis Bläschen zu sehen. - Kurz spin-down der Probe bei 2000 X g für 3 s mit einem Desktop-Microfuge, um alle Flüssigkeit an der Unterseite des Rohres zu sammeln. Legen Sie die Proben auf Eis.
- Fahren Sie direkt mit einzelligen WGA (siehe Abschnitt 6. und Czyz Et Al. ( 19).
- Bereiten Sie die Zelle Lysis master-Mix (Komponenten der WGA-Kit, Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) gemäß dem Protokoll von Czyz Et al.18skizziert. Kurz, mischen 2.0 µL Reaktion Puffer, 1.3 µL des Octylphenoxypolyethoxyethanol (10 % ige Lösung), 1.3 µL 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) Phenyl-Polyethylenglykol (10 % ige Lösung), 2,6 µL einer Proteinase K-Lösung und 12,8 µL RNase/DNase-freie Wasser um zu erhalten eine Master-Mix für 10 Proben (Gesamtvolumen 20 µL).
- Laser-Mikrodissektion (alternative einzellige Sampling-Methode an: 5.1. Mikromanipulation)
Hinweis: Die Zusammensetzung der in diesem Abschnitt verwendeten master-Mix unterscheidet sich von der in Abschnitt 5.1 für Mikromanipulation verwendet. Einzelne Zellen werden für WGA 4,5 µL Zelle Lysis master-Mix (Komponenten der WGA-Kit, Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) hinzugefügt.- Bereiten Sie die Zelle-Lyse-master-Mix nach Czyz Et al. 19 durch das Mischen von 5,0 µL Reaktion Puffer, 1.3 µL des Octylphenoxypolyethoxyethanol (10 % ige Lösung), 1.3 µL 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) Phenyl-Polyethylenglykol (10 % ige Lösung), resp., 2.6 µL einer Proteinase K-Lösung und 34,8 µL RNase / DNase-freies Wasser, einen master-Mix für 10 Proben (Gesamtvolumen 45 µL) zu erhalten. Legen Sie die master-Mix auf dem Eis.
Hinweis: Für weitere Beispiele, erhöhen Sie die Mengen entsprechend. - UV-Behandlung Membran beschichtete Folien für Laser-Mikrodissektion geeignet. Daher legen Sie die Folien in eine DNA Kreuz Linker Gerät und setzen auf höchste UV für ca. 10 Minuten.
- Montieren Sie die Membran-beschichtete Folie in einer Cytocentrifuge und die gesamte Zellsuspension bei 300 X g für 5 min Cytospin.
Hinweis: Bei Verwendung eine in Flüssigkeit-System, wo sind die Zellen Cytocentrifuged auf der Folie in Lösung Entfernen des Überstands nach Cytocentrifugation und einen trocken-Spin bei 1140 X g für 1 min. - Fahren Sie direkt mit laser-Mikrodissektion oder lassen die Cytospins über Nacht an der Luft trocknen und Einfrieren der Proben bei-20 ° C für langfristige Lagerung.
- Pipette 4,5 µL Zelle Lysis-master-Mix in die Kappe einer 0,2 mL PCR-Röhre und einzelne Zellen mittels Laser Mikrodissektion zu ernten.
- Das PCR-Röhrchen aus dem Laser Mikrodissektion Mikroskop abrufen und das Röhrchen verschließen. Sammeln Sie alle Flüssigkeit an der Unterseite des Rohres durch kurz-Spin und legen Sie die Probe auf dem Eis.
- Fahren Sie mit einzelligen WGA oder speichern Sie isolierten Proben bei-80 ° C bis zu 1 Monat vor der Weiterverarbeitung zu.
- Bereiten Sie die Zelle-Lyse-master-Mix nach Czyz Et al. 19 durch das Mischen von 5,0 µL Reaktion Puffer, 1.3 µL des Octylphenoxypolyethoxyethanol (10 % ige Lösung), 1.3 µL 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) Phenyl-Polyethylenglykol (10 % ige Lösung), resp., 2.6 µL einer Proteinase K-Lösung und 34,8 µL RNase / DNase-freies Wasser, einen master-Mix für 10 Proben (Gesamtvolumen 45 µL) zu erhalten. Legen Sie die master-Mix auf dem Eis.
6. Adapter-Linker Sitz ganze Genom Verstärkung 18,19
Hinweis: Stellen Sie sicher alle notwendigen master Mixe (Komponenten der WGA-Kit, Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) vorbereitet und gespeichert auf dem Eis einsatzbereit. Master Mix gehören den DNA Verdauung Mix 1 für Micromanipulated (siehe 5.1) Proben (mit 2,0 µL Reaktion Puffer, Mse2.0 µL ich Restriktionsenzym und 16,0 µL RNase/DNase-freies Wasser) oder DNA-Verdauung 2 für Laser-Mikrodissektion zu mischen (siehe 5.2.) Proben (mit 2,5 µL Mseich Restriktionsenzym und 2,5 µL RNase/DNase-freies Wasser), Pre-glühen master-Mix (mit 5,0 µL Reaktion Puffer, 5,0 µL der einzelnen preannealing PCR-Adapter und 15,0 µL RNase/DNase-freies Wasser), Unterbindung Master-Mix (mit 30,0 µL bereits geglühten PCR-Adapter, 10.0 µL Adenosintriphosphat Lösung und 10.0 µL T4-Ligase Lösung) und primärer PCR-Master-mix (mit 30,0 µL des PCR Puffer, 20,0 µL 10 mM Deoxynucleotide Mix Lösung, 10.0 µL einer Polymerase Mix und 340.0 µL RNase/DNase-freies Wasser). Alle Bände sind für die Zubereitung von 10 Proben gegeben. Passen Sie entsprechend der Anzahl der Stichproben.
- Legen Sie für Zelle Lysis die Micromanipulated/Laser-Mikrodissektion-Proben in einem Thermocycler und einzellige Lyse von Zellen bei 42 ° C für 45 Minuten, 65 ° C für 30 min und 80 ° C für 10 min Inkubation geführt.
Hinweis: Verwenden Sie ein Thermocycler mit einem beheizten Deckel. Lyse der Zelle kann für 10 bis 15 h O/N erfolgen. In diesem Fall lassen Sie inkubationsschritt bei 65 ° C Weg. - Führen Sie vor Glühen der PCR-Adapter. Daher vorab glühen master-Mix in einem Thermocycler bei 65 ° C für 1 min, gefolgt von weiteren 49 Zyklen, jeweils 1 min inkubieren mit schrittweise verringert die Temperatur um 1 ° C/Zyklus. Inkubieren Sie nach 50 Zyklen (bei 15 ° C) den master-Mix bei 15 ° C bis zur weiteren Verwendung.
Hinweis: Dieser Schritt ist notwendig, um asymmetrische Adapter geeignet für Ligatur zu erzeugen (siehe Punkt 6.6.) mit einzelligen DNA ausgesetzt Mseich Beschränkungsauswahl. - Nach Lyse der Zelle, spin-down der lysierten Proben bei 2000 X g für 3 s zu sammeln alle Flüssigkeit unten und legen Sie ihn auf Eis.
- Um DNA-fragment, jede lysierten Micromanipulated Probe 2 µL DNA-Verdauung-Mix 1 hinzufügen oder 0,5 µL DNA Verdauung mix 2 zum Beispiel Laser Mikrodissektion und Beschränkungsauswahl ausführen. Verwenden Sie ein Thermocycler mit einem beheizten Deckel bei 37 ° C für 5 min, gefolgt von einem Restriktionsenzym Inaktivierung Schritt bei 65 ° C für 5 Minuten.
Hinweis: Verdauung bei 37 ° C, 3 h verlängert werden. Dies ist der einzige Protokoll zwischen Proben aus Mikromanipulation und Proben aus Laser-Mikrodissektion abweichend. - Spin-down die Proben zu sammeln alle Flüssigkeit unten und legen Sie ihn auf Eis.
- Für Ligation Einschränkung verdaut DNA und bereits geglühten Adapter hinzufügen 5.0 µL der Ligatur Master mix zu jeder verdauten DNA-Probe und in einem Thermocycler bei 15 ° C für 1 h verbinden.
Hinweis: Dieser Schritt kann auf 12 h verlängert werden oder durchgeführt O/N. - Spin-down die Proben zu sammeln alle Flüssigkeit unten und legen Sie ihn auf Eis.
- 40,0 µL des primären PCR-master-Mix hinzufügen für WGA der Ligatur-Produkte und WGA in einem Thermocycler mit einem beheizten Deckel wie folgt: erste ausgeführt, die Proben bei 68 ° C für 3 min inkubieren. Zweitens-Zyklus für 15 Mal bei 94 ° C 40 s, 57 ° C für 30 s und 68 ° C für 1 min 30 s + 1 s/Zyklus. Fügen Sie dann 9 Zyklen bei 94 ° C 40 s, 57 ° C + 1 ° C/Zyklus für 30 s, 68 ° C für 1 min 45 s + 1 s/Zyklus. Danach radeln für 23mal bei 94 ° C 40 s, 65 ° C für 30 s, 68 ° C für 1 min 53 s + 1 s/Zyklus. Schließlich führen Sie eine letzte Verlängerung bei 68 ° C für 3 min 40 s und kühlen Sie die Proben auf 4 ° C.
- Spin-down die Proben zu sammeln alle Flüssigkeit unten und überprüfen die DNA-Qualität oder speichern die Proben bei-20 ° C oder-80 ° C für die langfristige Lagerung.
(7) Qualitätskontrolle der WGA-Produkte
Hinweis: Überprüfen Sie die Qualität der WGA-Produkte basierend auf der DNA-Abstrich und die Anzahl der Amplifikationsprodukte nach dem Ausführen einer 4plex QC-PCR- 5. Führen Sie WGA Aliquote und jeweiligen QC-PCR Proben auf einem 1,0 % Agarose-Gel für die Bewertung.
- Bereiten Sie 100 µM Stammlösungen alle Primer verwendet für 4plex Qualitätskontrolle PCR (Tabelle 1). 136.0 µL des PCR-Grade Wasser 200 µL Grundierung Pool generieren fügen Sie 8 µL jeder Grundierung hinzu. Wirbel die Lösung für 3 s, drehen Sie es bei 2000 X g für 3 s und aliquoten 20 µL zur Lagerung bei-20 ° C.
- Verwendung standard PCR Kits zur Vorbereitung eines Multiplex-PCR-Meisters mischen mit 6,0 µL 2 X PCR Komponenten (außer Primer), 4,5 µL des PCR-Grade Wasser und 0,5 µL der Primer-Pool.
- 1,0 µL der WGA Produkte hinzufügen, nach unten drehen und laufen PCR bei 94 ° C für 2 min gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung bei 94 ° C für 1 min, Grundierung Glühen bei 56 ° C für 1 min und Primer Extension bei 72 ° C für 1 min 30 s und eine letzte Verlängerung Schritt bei 72 ° C für 7 min. Chill es auf 4 ° C, drehen Sie es nach unten und die Proben auf Eis für Gelanalyse am selben Tag oder bei-20 ° C für eine spätere Analyse.
Hinweis: In den Thermocycler kühlen kann bei 12 ° C Erhöhung der Langlebigkeit der Peltier-Elemente erfolgen. - Analysieren Sie WGA Erzeugnisse (von 6.8.) und entsprechenden 4plex QC-PCR-Produkte mit einer Agarose-Gel-5.
Representative Results
Zellen nach CFSE- und Nukleinsäuren Färbung können mit einem Immunfluoreszenz-Mikroskop ausgestattet mit Filter für DAPI und FITC ausgewertet werden. Kerne präsentieren mit einer hellen gegenfärbung im DAPI-Kanal während Zytoplasma der Zellen zeigen einheitliche Kennzeichnung mit CFSE mit heterogenen Inter Zelle Intensität (Abbildung 2A und 2E). Ähnliche Form und Färbung Intensitäten von Zellen mit dem Draht (Abb. 2 b und 2F) erwartet als auch losgelöst von den Draht und erholte sich auf einer Folie (Abb. 2D und 2 H).
Hohen Zelldichten (z. B. > 1 000 000 Zellen/mL) kann in vollständige Abdeckung des Drahtes mit Zellen führen, wenn die Drähte zu laden. Doch unteren Zelldichten, Veränderungen der Drehzahl während der Inkubation und den Einsatz von verschiedenen Zelllinien beeinflussen die Isolierwirkung und gesondert geprüft werden müssen. Wenn die Drähte wurden mit 5 mL von HT-29 Zellen auf 100 000 Einwohner Zellen inkubiert / mL als in Abschnitt 2.1 beschrieben., einen Mittelwert von 254 ± 103 Zellen (n = 5) auf den Drähten gefangen genommen wurden. Mit der gleichen Experimentieren mit LNCaP Zellen, einen Mittelwert von 440 ± 319 Zellen (n = 5) pro Draht gewonnen wurde.
Präsentieren 500, 5 000 und 50 000 HT-29 Zellen in einem Hintergrund von 5 mL des peripheren Blutes Drähte (laut Protokoll Abschnitt 2.2.) führte zu der Einnahme von 75 ± 18 Zellen, 25 ± 9 Zellen und 47 ± 57 Zellen (n = 3, jedes), beziehungsweise. Wenn der Draht mit 15 µL Zellsuspension (1 000 000 Zellen/mL) nach dem Protokoll in Abschnitt 2.3 aufgeladen ist., bis 1 000 (HT-29) Zellen zu einem Draht befestigen können.
Handy-Abteilung Wirkungsgrade zwischen 81 % in HT-29 Zellen (reichen 54,9 % 93,2 % und n = 5) auf 81 % (reichen 63.51 % 92,87 %, n = 6) und 91 % (reichen 84,7 95,3 %, n = 6) in LNCaP und VCaP Zellen, beziehungsweise. Ebenso unterscheidet sich die Erholung der freistehende Zellen zwischen Zell-Linien: ein Mittelwert von 28 % der freistehenden HT-29 Zellen wurden von Cytocentrifugation geborgen. Während die Wiederfindungsrate für LNCaP unter 10 % lag, war die mittlere Verwertungsquote für VCaP Zellen 55 %.
Etwa 75 % der Einzelzellen unterzogen WGA Ertrag WGA Qualitätsprodukte: Dies ist (1) Abstrich der WGA-Produkte von 0,1 bis > 1 kb (Abb. 4, oben) und (2) drei oder vier Bands in der 4plex Qualität kontrollieren PCR (Abbildung 4, Bodenplatte) . WGA-Produkte sind für 1) Array-CGH Profilierung erfüllt die Qualitätskriterien für einzellige Array-CGH profile 6,7 und 2) gezielte NGS nach erneuten Verstärkung WGA 7einsetzbar.
Abbildung 1: Workflow für die Isolierung und Wiederherstellung von Zielzellen für einzellige Analyse. (A) Zellen sind zu 90 % Konfluenz kultiviert und geerntet (B) um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Nach der Färbung mit CFSE- und Nukleinsäuren Fleck, (C) des funktionalisierten Drahts wird in Anwesenheit von Zellen in einem Volumen von 5 mL Reaktionsgefäße mit oder ein geringes Volumen mit einer Pasteur PIPETTENSPITZE inkubiert. Letzteres ermöglicht Anwendung der Zelle Aussetzung Bände so niedrig wie 15 µL., (D) Zellen müssen innerhalb von 4 Stunden nach der Aufladung loszubinden. Daher befindet sich der Draht in eine 1,5 mL Reaktionsgefäß mit Freigabe Puffer gefüllt. Nach 15 min Inkubation auf einer Wippe und 10 min zentrifugieren der Draht entfernt und die Zellsuspension wird zentrifugiert, um die Zellen zu Pellets. (E) Recovered Zellen sind entweder auf einen Glasobjektträger für einzellige Mikromanipulation (oben) oder Cytocentrifuged auf eine Membran-beschichtete Folie übertragen und weitergeleitet, um laser-Mikrodissektion (unten). (F) schließlich werden geerntete Einzelzellen durch ganze Genome Amplifikation (WGA) verstärkt. WGA-Produkte sind kompatibel mit Array-CGH und gezielte NGS nachgelagerte Analyse. EpCAM-Epitop: grüner Kreis auf der Zelloberfläche. Funktionalisiert Draht: Gerät, grauen Triple-spiralförmige Kabeln. Polymer: violette Linien. Anti-EpCAM-Antikörper: Orange. Lassen Sie Puffer Aktivität: roter Pfeil. Fett-Marker auf die Zellsuspension in Position zu halten: dunkel blaue Ellipse. Zellsuspension wiederhergestellt: hellblau. Kapillare für Mikromanipulation: schwarze Linie. Vergrößerung: wiederhergestellte Zelle durch Mikromanipulation geerntet, Cytospin auf Membran bedeckt schieben mit wiederhergestellten Zellen (grau gefüllte Ellipse). Vergrößerung: wiederhergestellte Zelle wird laser-Microdissected (graue Kreislinie: Membran Membran Folie dient als Rückgrat für Laser-Mikrodissektion), Objektive mit Laserstrahl (blaue Linie nähert sich die Membran Folie von unten). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Visualisierung von markierten Zellen. (A, E) Zellen vor dem Laden: Zellen sind gekennzeichnet mit CFSE und counterstained mit einer DNA verschuppen Farbstoff zeigt eine Reihe von CFSE-(grün)-Signalintensität. (B,F) Markierten Zellen auf den Draht festgehalten. (C,G) Draht nach Zelle-Ablösung Eingriff. (D,H) Zellen aus Draht getrennt und wiederhergestellt, indem Cytocentrifugation auf einer Folie. CFSE-: FITC Kanal (grün). DNA-Fleck: DAPI-Kanal (blau). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Draht und lagern. (A) Fächer des Drahtes. (B) Detail der funktionalisierten Teil. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Qualitätskontrolle WGA Produkte aus einzelnen Micromanipulated Zellen gewonnen. Oberseite: WGA-Erzeugnisse, die aus einzelnen Zellen in der Regel Ergebnis in DNA Abstriche von bis zu 0,2 kb > 1,0 kb mit einem Peak-Intensität bei rund 0,5 kb. Proben Nr. 1, 7 und 13 (mit Sternchen gekennzeichnet) suboptimale zeigen oder keine DNA schmiert. Bodenplatte: WGA Produkte sind von ausreichender Qualität, wenn die 4plex PCR drei oder vier von vier PCR Produkte ergibt (bei 100, 200, 300 und 400 bp). Proben 1, 7, 10 und 13 zeigen weniger als drei Bands und würde von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Lane M enthält eine 100 bp-Leiter und Sternchen geben die Proben nicht ausreichend WGA-Produktqualität. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Primer Sequenz | HINWEIS |
| 5′-Gtt Cca Ata Tga Ttc Cac cc-3′ | 100 bp forward primer |
| 5′-Ctc Ctg Gaa Gat Ggt Gat Gg-3′ | 100 bp-rückwärts-primer |
| 5′-Agg Tgg Agc gag gct Agc-3′ | 200 bp forward primer |
| 5′-Ttt Tgc Ggt Gga Aat AGB ct-3 ' | 200 bp-rückwärts-primer |
| 5′-Agg Tga Gac Att Ctt gct Gg-3′ | 300 bp forward primer |
| 5′-Tcc handeln Aac Cag Tca Gcg Tc-3 ' | 300 bp-rückwärts-primer |
| 5′-Aca Gtc Katze Gcc Atc handeln gc-3 ' | 400 bp forward primer |
| 5′-gct Tga caa Agt Ggt Cgt tg-3′ | 400 bp-rückwärts-primer |
Tabelle 1: Primer-Sequenzen für 4plex Qualitätskontrolle PCR
Discussion
Die beschriebene Protokoll soll Abrufen von Zellen aus dem funktionalisierten Draht (als Gerät bezeichnet) für ex-Vivo einzellige Genomanalyse. Wir testeten drei EpCAM-positiven Zellinien (HT-29, LNCaP und VCaP), aber grundsätzlich kann dieses Verfahren für jede Zelllinie EpCAM zum Ausdruck zu bringen. EpCAM-positiven Zellen können das Gerät als reines Zellsuspension vorgestellt werden (siehe 2.1.) oder in einen Überschuss von hintergrundzellen gemischt (zB. peripheren Blut, siehe 2.2.). Vor allem Letzteres verwendet werden könnte, Isolierung Kapazitäten unter seltenen Zelle Bedingungen zu testen, fine-tuning der Anzahl der Zellen an den Draht befestigt kann erfolgen mit der beschriebenen Low-Volume Ansatz (siehe 2.3.). Unterschiede zwischen Zell-Linien sind zu erwarten, Geschwindigkeit geeignet Zelldichten zum Aufladen des Drahtes, Drehung sowie Inkubationszeit empirisch geprüft werden, durch die Anzahl der angeschlossenen Zellen mit einem Immunfluoreszenz-Mikroskop auswerten müssen.
Für genomische downstream-Anwendungen auf die einzelne Zelle Ebene WGA ist erforderlich. Die WGA-Methode der Wahl variieren zwischen Labors und unsere Methode ist grundsätzlich offen für alle Methoden als Proben aus Mikromanipulation oder Laser Mikrodissektion verarbeiten kann. In diesem Protokoll verwenden wir eine Methode basierend auf enzymatisch fragmentierte DNA durch eine bessere Leistung im Vergleich zu eine Hitze-Fragmentierung basierte WGA-7. Optional, einzelne Zellen können Isotherme WGA weitergeleitet werden, so dass anschließende DNA-profiling20,21.
Das beschriebene Protokoll zielt auf Wiederherstellung intakte Zellen nach Anhaftung an eine neue Generation von funktionalisierten Drähte für einzellige Genomanalyse. Die erste Generation der funktionalisierten Drähte, die auch bisher nur CE-Zulassung in Vivo Bereicherung Geräte auf dem Markt vertreten, dienten zum Auflisten von CTCs im metastasierten Krebspatienten. Bisherige Veröffentlichungen und unseren eigenen Daten vorschlagen der in Vivo Isolation Technik, um empfindlicher sein im Vergleich zu den aktuellen Gold-Standard Technologie2. So ermöglicht diese in Vivo -Isolierung-Technik mit einem Recovery-Funktion auszustatten, da im Gerät realisiert kombiniert hohe CTC-Rückgewinnung mit Charakterisierung der Ebene der einzelligen.
Aber das Gerät ist nicht für den Einsatz bei Patienten gelöscht, so liegen keine klinischen Daten. Ex-Vivo Anwendungen (d.h. CTCs nach der Entnahme aus dem peripheren Blut zu isolieren) sind nicht empfehlenswert, da die Technologie in den cubital eitel, z.B. geringen Durchmesser der eitel (erhöhen die Wahrscheinlichkeit, dass die Einstellungen angepasst ist direkter Kontakt zwischen CTCs und Fang Antikörper) und lange Verweilzeit (30 min, so dass 2-3 L des Blutes, den Draht zu übergeben). Aber, wie in Abschnitt 2.2. Ziel-Zellen können auch von Mischproben7isoliert werden.
Eine Strombegrenzung der Methode ist die ineffiziente Wiederherstellung des fixierten Zellen nach der Loslösung von den Drähten. Dies könnte jedoch durch eine Zelle Fixierung Schritt vor der Ablösung Behandlung verbessert werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen ist dieses Protokoll ein erster Schritt in Richtung der kombinierten Nutzung einer in-Vivo -Isolierung-Technik mit Handy Recovery für genetisch Charakterisierung einzelne Zellen. Weitere Anstrengungen müssen die Optimierung der Zelle Erholung und Freiraum für ihre Anwendung in Patienten1,2. Personalisierter Medizin für Behandlungsentscheidungen Überwachung und Therapie ist jedoch über die Aufzählung der CTC. Diese Methode ist somit ein erster Schritt zur genomischen CTC Charakterisierung der Ebene der einzelnen Zelle.
Anwendungen in Richtung einzellige Transkriptom-Analyse scheinen machbar, wie intakte Zellen geerntet werden. Es bleibt jedoch um zu prüfen, ob die Wiederherstellung Prozedur auf Integrität der RNA (z. B. Weiterleitung wiederhergestellten Einzelzellen zu direkten Lyse gefolgt von RT-qPCR22) auswirkt. Im Erfolgsfall kann auf die Transkriptom-Ebene, so dass detailliertere Analysen Charakterisierung einzelner Zellen (z. B. CTCs) verschoben werden. In dieser Hinsicht, RNA-Seq mit Smart-seq2 bietet ein wertvolles Werkzeug für RNA nachgelagerte Analyse einzelner Zellen, wie die preamplified cDNA (erhältlich bei RNA-Seq Bibliothek Vorbereitung) quantitative PCR ausgesetzt sein kann. Dadurch wird eine kombinierte Ziel und Screening-basierte Analyse der wiederhergestellten Einzelzellen22,23.
Die aktuellen funktionalisierten Drähte basieren auf Anti-EpCAM-Antikörper, die eine weit verbreitete epitheliale Marker für positive Selektion von CTC24ist. Wie mehrere CTCs Downregulate epitheliale Marker wie cytokeratin oder EpCAM25könnte, würden Antikörper wie HER2/neu hinzufügen erhöht die Chance der CTC-Isolation. Verschiedene Antikörper basierten Bereicherung Strategien entwickelt und bewertet von Ferreira Et Al. in 201626. Eine Mischung von Antikörpern, die unbeweglich auf einem Draht könnte eine künftige Verbesserung der Technologie führt zu die Isolierung von einer höheren Anzahl und weitere Subtypen des CTC.
Es ist obligatorisch für alle Schritte, die mit Draht Handhabung halten das Funktionsteil des Drahtes in Lösung eingetaucht, um seine Funktionalität zu erhalten. Wir empfehlen, legen Sie den Draht mit 1 X PBS-Puffer bei der Auswertung (Mikroskop; zB. Schritte 3.1. -3.3.) und Lagerung. Um unangemessene Fleckenbildung zu vermeiden, empfehlen wir mit frisch Färbelösung in Schritten 1.2.1 vorbereitet. und 1.2.2. Schwach gefärbten Zellen hemmen Zelle zählen auf dem Draht und können dazu führen, die Unterschätzung der angeschlossenen Zellen.
Es ist notwendig, um zu vermeiden, stecken die Pasteur-Pipette mit der Gummikappe beim Einfügen des Drahts in der Pasteurpipette für das anschließende Laden die Zellsuspension (Schritt 2.3.4.). Die Gummikappe wird verwendet, um den Draht in Position zu halten, so dass das Funktionsteil Geheimtipp der Pasteurpipette befindet. Wenn die Kappe an der Rückseite des Pasteur-Pipette zu fest sitzt, ist laden die Zellsuspension nicht möglich. In diesem Fall erleichtern Sie die Kappe so, dass die Luft durch die geladenen Zellsuspension verdrängte die Pipette verlassen kann.
Biege den Draht ist entscheidend für die Ausrichtung in der Zelle zählen in Schritten 3.2. und 3.3. Montieren Sie die Drähte mit Klebeband so, dass der nicht-funktionalen Ende des Drahtes auf der einen Seite zu liegen kommt. Nach dem Scannen der gesamten Länge der Funktionsteil, wird der Draht 180° gerollt, so dass die andere Hälfte des funktionalen Drahtes gescannt werden kann. Dieser Schritt ist wichtig für erste Experimente, die Anzahl der Zellen auf dem Draht zu beurteilen. Sobald die Anzahl der Zellen für eine bestimmte Zell-Linie und Verfahren ausgewertet wird, kann das Verfahren wiederholt werden, ohne Zellzählung (zB. nur Prüfung auf Vorhandensein von Zellen oder diesen Schritt weglassen). Sorgfältige pipettieren ist entscheidend für die Zelle Verlust zu vermeiden, wenn Sie die Lautstärke des Überstands im Schritt 4.8 reduzieren. Sicherstellen Sie, dass pipettieren reibungslos erfolgt ohne Turbulenzen zum Pellet.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der Wissenschaftsfonds (FWF), Projekt-Nr. finanziert. Ich 1220-B19 (für PS) im Rahmen des Projekts ERANET in Translational Cancer Research (TRANSCAN) "Zirkulierende Tumorzellen als Biomarker für minimaler Resterkrankung in Prostate Cancer (CTC-SCAN)". Doktorand S.C wurde im Rahmen des PhD Programm Molekularmedizin der medizinischen Universität Graz ausgebildet. Die Autoren erkennen dankbar Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz und Johanna Schiller für ihre kompetente technische Unterstützung. Die Autoren danken Georg Peinhaupt für grafische Gestaltung unterstützen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
| McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
| Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
| Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
| Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
| 50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
| Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
| Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
| Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
| Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
| MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
| Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
| Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
| Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
| Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
| Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
| Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
| Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
| Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
| Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
| Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
| 0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
| Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
| Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
| Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
| MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
| Standard PCR reagents | |||
| 6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
| DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
| Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |
References
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