Summary
이 프로토콜 설명 관찰 실시간 녹색 형광 단백질 (GFP)의 태그 인슐린 자극 및 인슐린-GLUT4에 CCR5의 생물학 역할의 특성에 따라 매매 하는 포도 당 운송업 자 4 (GLUT4) 단백질에 대 한 Deconvolution 현미경으로 통로 신호.
Abstract
타입-2 당뇨병 mellitus (T2DM)는 세계 보건 위기 인슐린 신호 및 주변 조직에 만성 염증에 의해 특징 이다. 중앙 신경 조직 (CNS)에 시상 하 부는 에너지와 인슐린 신호 응답 규칙에 대 한 제어 센터 이다. 주변 조직 및 특정 발산 (CCL5, TNFα, 일리노이-6 등)의 불균형에 만성 염증 당뇨병과 비만에 기여 한다. 그러나,는 기능 따라 장치를 마더보드에 연결 발산 및 hypothalamic 인슐린 신호 규정 여전히 불분명 남아 있습니다.
기본 신경 문화 모델 생체 외에서 hypothalamic 뉴런에 인슐린 신호 규정을 조사 하는 데 사용할 수 있는 편리 하 고 간단한 모델은. 이 연구에 GLUT4 막 전 인슐린 자극 시 추적을 기본 hypothalamic 뉴런으로 exogeneous GLUT4 단백질 GFP (GFP GLUT4)와 활용을 시행 했습니다. GFP GLUT4 단백질 매매의 시간 경과 이미지 deconvolution 현미경, 크게는 실험을 수행 하는 동안 신경 세포를 손상 없이 고속, 고해상도 이미지를 생성 하는 사용자에 의해 기록 되었다. 통제 하는 인슐린 GLUT4 translocation에 CCR5의 기여는 고립 되었고 CCR5 녹아웃 쥐에서 교양 있는 CCR5 부족 hypothalamic 뉴런에서 관찰 되었다. 우리의 결과 시연 GLUT4 막 전 효율 인슐린 자극 후 CCR5 결함 hypothalamic 뉴런에 감소 되었다.
Introduction
타입-2 당뇨병 mellitus (T2DM)는 세계 보건 위기 이다. T2DM은 인슐린 신호 및 주변 조직에 만성 염증에 의해 특징입니다. 시상 하 부는 신체의 에너지 항상성, 식욕, 그리고 circadian 리듬을 조절 하는 제어 센터 이다. 가장 중요 한 것은, 시상 하 부는 또한 조직의 대사1,2,3,,45규제 인슐린 신호 응답 중재. Hypothalamic 인슐린 신호 통로 인슐린 저항6,7을 일으킬 수 있는 방해. 시상 하 부 세포 에너지 상태 및 adipokines (예를 들어, leptin) 조직의 포도 당 대사, 인슐린 응답, 및 음식 섭취 량을 말 초 조직에서 인슐린 등 호르몬의 분 비를 조정 합니다. 인슐린 인슐린 수용 체 바인딩 인슐린 하류 신호와 같은 분자 PI3K 활성화는 인슐린 수용 체 기질 (국세청) 단백질 활성화 (phosphatidylinositol 3-kinase) 및 GLUT4 유도 AKT (단백질 키 니 아 제 B (PKB/AKT)), 막 전입니다. 신경 세포는 포도 당 통풍 관 인슐린;에 대 한 응답에 대 한 주요 대상 그러나, GLUT4 식의 상당한 수준 hypothalamic arcuate 핵 (아크) 지역에서 확인 되었습니다. 따라서, hypothalamic 뉴런에 GLUT4 규제 인슐린 뇌 주변 축에서 신호에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.
만성 염증 및 시상 하 부에 염증 성 발산 또한 당뇨병과 비만의 개발에 중요 한 역할을 재생 및 hypothalamic 염증의 억제 다이어트 유발 된 인슐린 저항을 뒤집을 수 있는 많은 연구 제안 8 , 9 , 10. 게다가, chemokine-CCL5 (C C 모티브 ligand 5, 일컬어 RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) 및 또한 T2DM11,12의 개발 연관의 CCR5 수용 체 수준. 인슐린 기능 및 포도 당 물질 대사에 있는 CCL5의 CCR5 역할 불분명 남아 있습니다. 한 연구 보고는 CCR5 부족 비만 유도, 대 식 세포 신규 모집, 염증과 인슐린 저항11;에서 쥐를 보호 반면, 또 다른 연구 보고 CCR5 부족 체형과 근육 인슐린 신호12뿐 아니라 조직의 포도 당 내성 손상. 그러나 CCL5은 T 세포에 포도 당 통풍 관을 증가 하 고 시상 하 부13,14,, 두 행동의 메커니즘에는 작업을 통해 음식 섭취를 줄일 수 있고 관련 된 수용 체는 아직 확인할 수 있습니다.
기본 hypothalamic 뉴런에 작용 하는 인슐린에 주변 조직 염증의 영향 세포 메커니즘을 연구 하는 것이 어렵습니다. 이것은 세포질이 질 및 신경 회로 피드백 규정 때문입니다. 이 체 외에서 세포 문화 모델을 hypothalamic 인슐린 신호 규정에는 chemokine의 효과 조사 하기 위해 깨끗 한 모델을 제공 합니다. 비록 많은 연구 사용에 대 한 불멸 하 게 hypothalamic 신경 세포 라인을 설립 이러한 셀 라인 다른 마커를 표현 하 고 따라서 hypothalamic 뉴런15의 종류를 나타냅니다. 기본 hypothalamic 문화는 유지 하기 어려울 수 있습니다., 비록 그들은 인슐린 자극 시 hypothalamic 뉴런의 가장 현실적인 응답을 제공할 수 있습니다. 및 또한 잠재력에와 서는 알 수 없는 효과 재생 세포를 유지 하는 경우를 피할 수 있습니다. 장기 인공 성장 요인으로 문화 매체에.
여기, 우리가 C57BL/6 wildtype (WT) 마우스를 CCR5 녹아웃 (CCR5-/-) 마우스, 기본 hypothalamic 뉴런을 활용 하 고 transfect GFP GLUT4 구조와 세포의 두 종류. 인슐린 중재 GLUT4 막 매매에 CCR5의 기여를 조사, 인슐린 또는 재조합 CCL5 GFP GLUT4 페 신경 치료 했다. 우리는 다음 Deconvolution 현미경으로 기본 hypothalamic 신경 세포의 원형질 막에 GFP GLUT4 운동의 특징.
Protocol
모든 프로토콜 및 동물 주제에 사용 되는 방법 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 타이베이 의학 대학에 의해 승인 되었습니다 (번호를 프로토콜: 락-2013-0278; LAC-2015-0397)
1. 기본 신경 문화
- 문화 전에 준비
- 폴 리-D-리 (표 1)와 문화 요리 문화 전에 1 일 코트. 6-잘 접시에 대 한 각 우물에 1.5 mL 폴 리-D-리 (0.05 mg/mL)을 추가 합니다. 라이브 영상에 대 한 표준 코팅된 6 잘 플레이트에 12 m m x 12 m m coverslip 셀 문화.
- 제거/재활용 폴 리-D-리 신 및 2 mL ddH2오로 두 번 설거지
- 수술 도구 준비: 마이크로 해 부가 위, 집게 곡선 밀고 및 표준 똑바로 밀고 집게의 쌍. 수술 도구를 소독 하 고 수술 하는 동안 75% 에탄올에 그들을 유지.
- 20 mL 세척 매체 (표 1)와 10 cm 배양 접시를 얼음에 계속.
- 15 mL 세척 매체와 15 mL 테스트 튜브를 얼음에 튜브를 유지.
- 서로 다른 뇌 영역에서 뇌 조직 분리
- 비 풍에 마우스를 놓고 다음 공동2중독 표준 euthanization 프로토콜 16-19 일 이전 임신 여성 쥐를 희생. E15.5 ~ E16.5 배아 hypothalamic 신경 문화 및 E16.5에 대 한 권장 ~ E17.5 hippocampal 및 대뇌 피 질의 신경 문화에 대 한 더 적당 하다.
- 플랫폼, 해 현미경 및 오염을 피하기 위하여 75% 에탄올과 수술 도구를 소독.
- (그림 1C, 1d) 손상 없이 쉽게 (어두운 빨간색 영역, 그림 1A, 1B 대시 선) 새끼를 격리 탯 주변 잘라.
- 가 위 (그림 1E, F)와 함께 각 강아지의 머리 부분을 제거 후 눈 영역 (그림 1G)에 대 한 뾰족한 스트레이트 집게를 사용 하는 장소에서 머리 부분을 보호. 사용 다른 뾰족한 곡선 두 가지 측면에서 외부 피부와 두개골을 제거 하 고 등 쪽 방향으로 (그림 1 H, 검은 화살표 방향에 포인트) 앞쪽에서 그들을 껍질을 집게. 뇌 손상 (그림 1I) 없이 격리 되어야 합니다.
참고: 두뇌의 다른 지구를 분리 하는 경우 정확도 보장 하기 위해 뇌의 무결성을 유지 하기 위해 필수적 이다. - 다음 단계에 대 한 차가운 세척 매체와 깨끗 한 페 트리 접시에 고립 된 두뇌를 유지.
- 두뇌를 플립 하 고 복 부 측면을 유지. 시상 하 부 뇌 (그림 1J, hypothalamic 지역에 화살표 포인트)의 한가운데에 둥근 구조 이다. 뾰족한 곡선된 겸 자와 hypothalamic 조직 분리. (이 노란 레드 색상) meninges 제거 신중 하 게.
주의: meninges의 완전 한 제거 섬유 오염 방지 하려면 중요 한 단계입니다. - 날카로운 집게와 후 엽 고 곡선된 겸 자 (그림 1 K, L)와 함께 전체 뇌를 둘러싼 얇은 meninges 벗기다.
- 해 마는 바나나 모양 피 아래 부분에 포함 되는 이다. 외피의 밑면에 튀기 십시오 그리고 곡선된 겸 자 (그림 1 MN, 및 O)와 측면을 당겨 피 질에서 해 마를 분리. 모든 나머지 meninges 주변 뇌 조직의 제거를 해야 합니다.
- 두뇌의 모든 지역 고립 되었을 때, 집게 (단계 1.1.5)의 도움으로 얼음 처럼 차가운 세척 매체를 포함 하는 15 mL 튜브에이 조직 들어온다.
참고: 뇌 조직은 2-3 h에 대 한 차가운 세척 매체에 보관할 수 있습니다.
- 조직 소화, 도금 및 문화
- 반전 조직 포함 된 15 mL 튜브, 2-3 시간 여 조직을 헹 구 고 튜브 (1-3 분) 정착 조직 수 있도록 똑바로 유지.
- 상단 중간 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 진공 시스템에 연결 된 제거. 조직, 씻어 15 mL 얼음 차가운 세척 매체를 추가 하 고 반전 튜브 2-3 번. 다음 단계 전에 3 번 세척 단계를 반복 합니다.
주의: 위 매체는 진공 시스템을 사용 하 여 제거할 때 바닥에 직물의 주의 해야 합니다. - 최종 세척 후 세척 매체 1 mL 피 펫의 도움으로 제거 합니다.
- Papain 트립 신 소화 버퍼 (표 1) 7 월 14 일 분 쉐이크에 대 한 37 ° C 물 욕조에 조직 되도록 모든 조직 마다 두 분 제대로 소화 버퍼에 노출 되는 튜브를 품 어.
참고: 보육 시간 및 소화 버퍼의 양을 조정할 수 있습니다 조직 크기에 따라. 6-8 새끼에서 수집 hypothalamic 조직, 300 µ L Papain 트립 신 소화 버퍼와 7 분 보육 시간 것이 좋습니다. 더 많은 조직 더 소화 버퍼를 요구할 것 이다. - 소 태아 혈 청의 1 볼륨을 추가 하 여 효소의 활동을 무력화. 실 온에서 3-5 회 테스트 튜브 흔들.
- 선반에 튜브를 유지 하 고 정착; 조직 수 있도록 1-2 분 기다립니다 1 mL 피 펫으로 신중 하 게 상쾌한을 제거 합니다.
- 6 mL 도금 매체 (표 1) 테스트 튜브 및 피펫으로 위아래 조직에 50 시간 5 mL 피 펫 부드럽게 (대 6-잘 접시, 잘 당 1.5 mL 도금 매체 권장)를 추가 합니다. 대부분의 세포 pipetting 반복 후 단일 세포로 분리 됩니다.
참고:이 단계를 수행 하는 동안 거품의 형성을 방지 하려고 합니다. 대부분 실험실 염증이 유리 목장 pipets를 사용 하 여 조직의 해리. 좁은 팁 5 mL 피 펫이이 단계에 대 한 좋은 대안이 될 수 있습니다. - 선반에는 튜브를 유지 하 고 정착 chunky, 유엔 천연 조직 수 있도록 1-2 분 기다립니다. 위 단계를 포함 하는 새로운 튜브에 세포를 해리와 매체 (해리 셀의 1 x 볼륨 당 볼륨 도금 매체 x 5 도금을 희석. 예를 들어 5 mL 매체 1 mL 해리 셀에 대 한 도금 추가).
- hemocytometer를 사용 하 여 셀 밀도 계산 하 고 폴 리-D-리 신 단계 1.1.1에서 코팅 문화 접시에 셀의 필요한 수를 시드하십시오. 2-4 x 6 잘 접시/35 m m 음식에 대 한 잘 당 105 세포 이미징 연구 하는 신경에 대 한 권장 하는 것이 좋습니다. 높은 밀도 단백질 수집 및 분석을 위해 필요할.
참고: 추가 하지 마십시오 너무 많은 도금 매체 한 6-잘 접시에 1-1.5 mL 도금 매체는 첨부 파일에 대 한 충분 한. 매체의 과도 한 양의 적절 한 세포 부착에 필요한 시간을 연장할 것 이다. - 2-3 h 기다립니다 고 현미경 시드 뉴런을 확인 합니다. 신경 그들은 제대로 연결 신경 염을 성장 하기 시작 합니다.
- 도금 매체를 제거 하 고 도금 매체를 씻어 접시에 따뜻하게 2 mL 세척 매체 (37 ° C)를 추가 합니다. 이 단계를 두 번 반복 합니다.
- 6-잘 접시에 각 음에 2 mL 전체 문화 매체 (표 1)를 추가 합니다.
- 매체의 절반 매 3-4 일 변경. 완전 한 매체 준비 갓 각 시간. 다른 마우스 두뇌 지역에서 경작 하는 신경 세포는 다른 형태 및 특성 (그림 2) 있을 것 이다.
2. 플라스 미드 DNA의 transfection Liposome 시스템 기본 신경으로
주의: 신경 세포 transfection, 위해도 무료 플라스 미드 DNA 정제 키트 (자료 테이블) DNA 준비를 위해 추천 된다. 추가 에탄올 강수량 초과 용 매를 제거할 수 있습니다 고 DNA 농도 향상 시킵니다.
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Liposome 기반 기본 신경 세포에서 DNA transfection입니다.
참고: transfection 시간 실험에 필요한 성숙 상태에 따라 달라 집니다. Hypothalamic 뉴런 DIV 7-10 (DIV, 일 체 외)에서 페 했다.- DNA: Liposome 혼합물 준비: 희석 GFP GLUT4 플라스 미드 DNA16 (2 µ g)는 microcentrifuge에서 튜브 포함 300 µ L 낮은 혈 청 문화 매체. 300 µ L 낮은 혈 청 문화 매체에서 2 µ L liposome와 다른 microcentrifuge 튜브를 준비 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.
- 두 튜브의 내용을 결합 하 고 실 온에서 20-30 분 동안 품 어.
- 문화 요리에서 신경 문화 매체를 제거 합니다. 각 우물에 600 µ L DNA liposome 혼합물을 추가 하 고 4-6 h 37 ° C에서 품 어.
- 4-6 h 후 DNA liposome 혼합물을 제거 하 고 2 mL 문화 매체를 추가 합니다.
- 18-72 h 후 혼자 GFP 등 GLUT4 단백질 GFP 태그 (그림 3 및 그림 4)와 함께 활용 된 형광 신호를 관찰할 수 있습니다.
3. 라이브 이미지 기록
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에 대 한 준비 셀 라이브 영상
- WT CCR5-/- hypothalamic 신경 세포 포도 당 운송업 자 4 (GFP GLUT4) #1.5 (또는 0.17 m m 두께)에 표시 하는 녹색 형광 단백질을 표현 문화 유리 coverslip 폴 리-D-리 6-잘에서 1.1.1 단계에서 미리 코팅 되었습니다 플레이트입니다.
- 조심 스럽게 집게를 사용 하 여 신경 세포와는 coverslips를 제거 하 고 주의 유리 슬라이드에 배치.
- 섬세 한 작업 잎사귀와 초과 매체/액체를 제거 합니다. 잎사귀를 두 번 접어 그리고 신중 하 게는 coverslip 위에 그들을 배치. 부드럽게는 coverslip 이동 하지 않고 잎사귀 아래로 누릅니다.
주의: 유리 슬라이드에 coverslip을 강제로 누르지 마십시오. 이 단계의 목적은 보장 하는 coverslip 않습니다 하지 이동/드리프트 이미지 중 부 력 힘으로 인 한 것입니다. - Coverslips 및 슬라이드에 배치 deconvolution 현미경 단계 coverslip 연결, 그리고 보안을 제대로. 이 단계는 사용자가 나중에 대상 셀의 동일한 집합을 추적할 수 있도록 슬라이드 위치 계속 유지 되도록.
- WT CCR5-/- hypothalamic 신경 세포 60 x 관찰 / 1.42 나 기름 침수 렌즈.
- CCL5와 선택한 셀 샘플을 치료 (10 ng/mL) 또는 희석된 인슐린 coverslip의 가장자리에의 한 분 추가 1.5 µ L에 대 한 인슐린 (10 U/mL).
- 시각화 하 고 즉시 선택한 셀 샘플을 기록 합니다. 30 분 동안 녹화 비디오 기록 소프트웨어 프로그램입니다.
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Deconvolution 현미경 및 분석
참고: 분석에 대 한 프로토콜의이 부분에서 deconvolution 현미경 및 특수 소프트웨어의 사용을 해야합니다.- 이미징 시스템의 전원을 켭니다, 그리고 제대로 초기화 하 다음 LED 광원 현미경 단계를 수 있습니다.
- 60 x 1.42 나 대물 렌즈에 침수 기름 (굴절률 1.520 37 ° C에서 라이브 샘플에 대 한)를 추가 합니다. 샘플 슬라이드에 현미경 대물 렌즈 쪽으로 직면 하는 coverslip로 놓고 슬라이드를 제대로 확보.
- 밝은 분야 또는 형광 조명 사용 하 여 대상 셀을 식별. 대상 셀을 명확 하 게 관찰 될 수 있다 때까지 초점을 조정 합니다. 영역 외부에 coverslip 불필요 한 긁힌 자국을 피하기 위해 대물 렌즈를 이동 하지 마십시오.
- 식별 녹색 형광 단백질 GFP 신호에 의해 포도 당 운송업 자 4 (GFP GLUT4) 활용. 이미지 수집에 대 한 원하는 대상 셀을 식별 합니다. 선택한 대상 셀 위치 나중에 참조할 수 (그림 4)에 대 한 기억 될 수 있습니다.
- 적절 한 실험 매개 변수 (를 포함 하 여 픽셀 수, 여기 파장, 전송 비율, 노출 시간, 스택 두께, 시간 간격, 및 총 영상 시간) 각 대상 셀에 설치. 이 실험에 대 한 이미지 픽셀 수 512 x 512 (그것에서 설정할 수 있습니다 높은 해상도 1024 x 1024)에서 GFP 신호 설정 했다. 노출 시간 0.025 0.05 s 마다 5 분 사소한 측면 x, y, 및 z 조정에 대 한 권장된 소프트웨어 (자료 테이블)에 의해 통제 될 수 있다 사이 설정 했다.
- 최대 픽셀 강도 달성 하기 위해 약 3000 2000 카운트를 노출 매개 변수를 설정 합니다. 유지 노출 시간 1 s. 반복 각 추가 형광 채널 및 관심의 각 개별 영역에 대 한 다음이 단계 동안 형광 photobleaching를 최소화 하기 위해 여기 광선 전송 가능한 만큼의 비율을 줄일 수 있습니다.
- 각 대상 셀에 Z-스택의 위와 더 낮은 한계를 설정. 이 때까지 목표 셀의 위아래 모두 초점이 약간 현미경 단계를 이동 하 여 얻을 수 있습니다. 사용자는 상위 및 하위 제한 (각 이미지 사이의 거리를 설정 하 여 할 수 있습니다) 사이의 이미지의 수를 설정 하 여 z 축 해상도 조정할 수 있습니다.
- 이미지의 deconvolved 그리고 나중이 경우에 각각 소프트웨어-엘머에서 속도의 도움으로 분석 했다.
Representative Results
쥐에서 교양 hypothalamic 뉴런 hypothalamic 특정 단백질-프로-opiomelanocortin (POMC) 항 체와 신경 마커-microtubule 관련 단백질 2 (MAP2)와 immunostaining에 의해 더 확인 되었다 (그림 2A). 우리는 기본 교양된 hypothalamic 신경 표현 hypothalamic 단백질 POMC 확인 했다. Hypothalamic 신경 세포에 CCR5 수용 체 및 CCL5의 표현의 특정 항 체 발견 되었고 공동 POMC 항 체 (그림 2A, 2B)으로 표시.
3 일 배양 후 뉴런 GFP DNA (그림 3)와 페 했다 또는 GFP GLUT4 활용 (그림 4). GFP 식 일반적으로 찾을 수 있습니다 모두 없이 특정 패턴 (그림 3) 하지만 GLUT4 GFP 셀 cytosol (그림 4)에서 punctate 같은 구조로 표현 합니다. 이 연구에 사용 된 transfection 키트 신경 transfection;에 대 한 가장 효율적인 방법이 아니다. 그러나, transfection, 더 나은 라이브 셀 이미징/녹음 나중에 기여 하는 후 더 나은 세포 생존에 대 한 덜 엄격한 방법입니다. GFP GLUT4 표현 뉴런의 이미지는 인슐린 자극 또는 CCL5 자극 (그림 4C, 보조 비디오 3) 시간 경과 영화 (그림 4A-B, 보조 비디오 1, 2) 하기 전에 촬영 했다. GFP의 GFP GLUT4 신호는 명확 하 고 신경에 강한.
GLUT4 GFP transfection와 hypothalamic 신경 더 GFP GLUT4 밀매 하 인슐린 (40 U)로 취급 했다. WT와 CCR5-/- hypothalamic 뉴런에 인슐린 자극에 GLUT4 GFP 운동의 reprehensive 비디오는 비디오 1 및 비디오 2로 각각 표시 됩니다.
그림 1: 배아 단계 (16.5 일)에서 조직 마우스 뇌의 다른 지역에서의 절연. (A-D) 태에서 강아지의 분리에 관련 된 단계. (E, F) 시체에서 강아지의 머리의 해 부. (G-난) 두개골에서 전체 뇌의 격리에 관련 된 단계. 집게를 사용 하 여 두개골을 제거 하는 동안 끌어올 방향에 검은 화살표 포인트. (J)는 시상 하 부의 절연. 검은색 화살표 집게 사이 hypothalamic 영역을 가리킵니다. (K-L) 쥐의 뇌의 피 질의 격리입니다. 검은 별표 전체 두뇌에서 외피의 분리에 흰색 화살표 점과 마우스 뇌의 피 질 영역을 나타냅니다. (남-오) 피 질에서 hippocampal 부분의 분리. 상단 흰색 화살표 표시 hippocampal 조직 하 고 낮은 흰색 화살표 표시는 대뇌 피 질의 조직. 스케일 바 = 1 cm (A-F), 200 µ m (G-O). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: hypothalamic 신경 마커 POMC-CCL5의 CCR5 공동 식의. (A) 기본 교양된 hypothalamic 뉴런 hypothalamic 신경 마커-POMC (빨간색), (녹색), CCR5와 신경 마커 MAP2의 공동 식 (회색) 표시 했다. POMC (레드) 긍정적인 hypothalamic 뉴런 (참조17의 보충 데이터에서 적응)에서 (B) CCL5 (녹색) 식입니다. 여기, DAPI 핵 블루 색상으로 표시. 바 규모에서 50 µ m = (A)와 (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 마우스 기본 뉴런에 GFP 단백질 표정. GFP 플라스 미드 DNA liposome와 4 일 문화 (DIV4) 후 기본 교양된 뉴런으로 페 하 고 또 다른 3 일 (DIV7)에 대 한 표현. (A-B) GFP는 신경 염 및 소마에서 표현 된다. (C D) 모의 transfection;와 뉴런 DAPI에서 (B, D) 핵 표시. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: hypothalamic 뉴런에 GFP GLUT4의 스냅샷. (A, C) GFP GLUT4 단백질 표현 Wildtype (WT) hypothalamic 신경 및 (B) CCR5-/- hypothalamic 신경. (A, B) 인슐린 또는 CCL5 신경 자극 했다 (C). 신경 염 (-) 전에 서에서는 punctate GFP GLUT4 가리키도록 화살표 (+) 후 인슐린 또는 CCL5 자극과 별표 (-) 전에 표면 GLUT4 GFP를 가리킵니다 (+) (C). CCL5 자극 후 (그림17참조 적응). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| Borade 버퍼 x 5 | 회사 | 카탈로그 번호 | 볼륨 |
| 붕 소의 산 성 | 시그마 올드 리치 | B6768 | 1.55 g |
| 붕 사 | 시그마 올드 리치 | 71997 | 2.375 g |
| ddH2O | 100 mL | ||
| 필터링, 4 ° C에서 유지 | |||
| 폴 리-D-리 재고 x 20 | 회사 | 카탈로그 번호 | 볼륨 |
| 폴 리-D-리 신 | 시그마 올드 리치 | P6407 | 100 mg |
| ddH2O | 100 mL | ||
| -20 ° C에서 계속 필터링, | |||
| 1 x 폴 리-D-리 신 | 볼륨 | ||
| 20 x 폴 리-D-리 신 | 5 mL | ||
| Borade 버퍼 x 5 | 20 mL | ||
| ddH2O | 75 mL | ||
| 총 | 100 mL | ||
| 4 ° C에서 유지 | |||
| 워시 매체 | 회사 | 카탈로그 번호 | 볼륨 |
| DMEM 높은 포도 당 | Gibco | 12800-017 | 495 mL |
| 항생제-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 5 mL |
| 총 | 500 mL | ||
| 4 ° C에서 유지 | |||
| Papain 트립 신 소화 버퍼: | 회사 | 카탈로그 번호 | 볼륨/최종 농도 |
| Papain (10mg/mL) | 시그마 올드 리치 | P4762 | 200 µ L (2 mg/mL) |
| 트립 신-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-072 | 200 Μ L (0.05%) |
| 워시 매체 | 600 Μ L | ||
| 총 | 1000 Μ L | ||
| -20 ° C에서 유지 | |||
| 도금 매체: | 회사 | 카탈로그 번호 | 볼륨 |
| Neurobasal 매체 | Gibco | 21103-049 | 176 mL |
| 소 태아 혈 청 | Gibco | 10437-028 | 20 mL |
| L-글루타민 산 염 (200 mM) | Gibco | 25030 | 2 mL |
| 항생제-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 2 mL |
| 총 | 200 mL | ||
| 4 ° C에서 유지 | |||
| 완벽 한 문화 매체 | 회사 | 카탈로그 번호 | 볼륨 |
| Neurobasal 매체 | Gibco | 21103-049 | 95 mL |
| N 2 보충 (100 x) | Gibco | 17502-048 | 1 mL |
| B27 보충 (50 x) | Gibco | 17504-04 | 2 mL |
| L-글루타민 산 염 (200 mM) | Gibco | 25030 | 1 mL |
| 항생제-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 1 mL |
| 총 | 100 mL | ||
| 갓 준비 |
표 1: 소화 버퍼와 미디어 구성이이 연구에 사용 된.
보충 비디오 1: WT hypothalamic 뉴런에 GFP GLUT4 움직임을 자극 하는 인슐린. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 비디오 2: 인슐린 자극 CCR5-/- hypothalamic 뉴런에 GFP GLUT4 운동. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 비디오 3: CCL5 WT hypothalamic 뉴런에 GFP GLUT4 운동 자극 (비디오 참조17에서 적응). 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
CCL5 또는 인슐린 자극 시 라이브 세포를 모니터링 하는 기능 GLUT4 움직임에 CCL5 또는 인슐린의 신속한 효과 공부에 대 한 비판적으로 중요 하다. 사실, 그것은 우리가 WT 및 CCR5-/- hypothalamic 뉴런 간의 인슐린 자극에 따라 상당한 차이 시각화 수 있습니다. 우리는 인슐린 자극17후 WT 및 CCR5-/- hypothalamic 뉴런 다른 시간 시점에서 내 생 GLUT4 단백질의 표면 라벨을 수행 했습니다. 세포 표면 단백질의 라벨 낮은 배경으로 높은 특이성 항 체를 필요 합니다. 또한, 표면 형광 정량화 도전적이 고 많은 시간이 소요 될 수 있습니다. 따라서, 시간 경과 기록 될 수 있습니다 특정 CCL5의 효과 또는 인슐린은 통계 변화 보다는 실험 조건에 따라 진정한 생리 변경. 표면 내 생 GLUT4의 라벨, 함께 강력한 증거와 실험 CCL5와 CCR5 GLUT4 전 및 인슐린 신호 전달에 참여 하는 방법을 보여 주기 위해 제공 합니다.
현대 세포 생물학 및 분자 생물학 연구, 많은 실험 형광 현미경 검사 법의 사용을 요구 한다. 이 기술은 단백질 및 이동 방향 및 속도, stimulatory 효과, 형태 변화, 및 단백질 매매 세포 세포 사이 공간 관계를 시각화 하기 위해 과학자 들을 수 있습니다. 그러나,이 기술은 여전히 제한이 그것의: 대상 단백질 (또는 지역)에서 발생 하는 신호 배경 형광에 의해 압도 수 fluorophores, 흥분 하는 경우. 그 결과, 형광 이미지 배경 신호에 깊이 묻혀 예상 신호와 흐리게 나타날 수 있습니다. 이러한 현상은 특히 막-바인딩 단백질의 관찰에 대 한 명백한 것입니다.
총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)이이 어려움을 극복 하기 위해 개발 되었다. 그것은 배경 fluorophores를 영향을 주지 않고 선택한 표면 바인딩된 fluorophores의 여기를 시각화 하기 위해 과학자 들은 있습니다. 과학자 들은 선택적으로 기능 및 원형질 막 등 매우 얇은 표면 지역에 이벤트 특성을 수 있습니다. Deconvolution 현미경 계산 집중적인 화상 처리 기술과 최근 몇 년 동안에 기술 발전의 도움으로 가능 하 게 이다. 그것은 디지털 형광 이미지 해상도 개선 하기 위해 자주 이용 되어. 앞서 언급 했 듯이, fluorophores 조명 (레이저 또는 LED) 등의 모든 종류에 의해 흥분 되는 때, 모든 fluorophores가 내보냅니다 빛 신호를 관계 없이, 그들은 초점에 있다면 그래서 이미지는 항상 흐리게 나타납니다. 이 흐리게는 "포인트 확산의 기능" (PSF) 라고 작은 형광 근원 (밝은 반점)에서 빛 오는 더 밖으로 확산 되며 초점 (흐림) 되는 현상으로 발생 합니다. 원칙적으로,이 이벤트는 모래 시계 모양의 모양의 형광 신호를 생산할 예정 이다 하 고 형광 이미지 등 수많은 빛 신호 만들 수 있다. Deconvolution 프로세스는 원래 밝은 반점 형태로, 모든 형광 신호를 다시 할당 하 고 이미지 대비를 개선 하기 위해 밖으로의 초점 빛의 대부분을 제거 수 있습니다.
최근 몇 년 동안, deconvolution 알고리즘 confocal 현미경의 유사한 해상도 이미지 생성. 또한, TIRFM, 비교 하는 넓은 필드 현미경 수 있습니다 모든 빛 감지 신호 deconvolution 과정을 통해 그들의 근원 등을 맞댄 그들을 재할당 제한 여기 지역에 의해 감지 되 고 밖으로의 초점 흐림을 방지 합니다. 따라서, 실제로, deconvolution 현미경이 되고있다 더 효율적인 이미지 수집 방법 뿐만 아니라 TIRF 현미경 검사 법에 비해 더 비용 효율적인 방법.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 S-Y c 과학과 기술, 대만-담배 제품의 MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) 및 건강 및 복지 요금-MOHW106-TDU-B-212-144001에서 제공 하는 보조금에 대 한 감사
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
| SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
| VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
| Insulin | Actrapid, Denmark | ||
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
| GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
| Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
| CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
| 12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
| micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
| curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
| 5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |
References
- Levin, B. E., Sherwin, R. S. Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter? J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).
- Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., Kahn, C. R. Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function. Diabetes. 63 (7), 2232-2243 (2014).
- Duarte, A. I., Moreira, P. I., Oliveira, C. R. Insulin in central nervous system: more than just a peripheral hormone. J Aging Res. 2012, 384017 (2012).
- Vogt, M. C., Bruning, J. C. CNS insulin signaling in the control of energy homeostasis and glucose metabolism - from embryo to old age. Trends Endocrinol Metab. 24 (2), 76-84 (2013).
- Plum, L., Schubert, M., Bruning, J. C. The role of insulin receptor signaling in the brain. Trends Endocrinol Metab. 16 (2), 59-65 (2005).
- Lin, X., et al. Dysregulation of insulin receptor substrate 2 in beta cells and brain causes obesity and diabetes. J Clin Invest. 114 (7), 908-916 (2004).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. J Biol Chem. 279 (34), 35298-35305 (2004).
- Thaler, J. P., Guyenet, S. J., Dorfman, M. D., Wisse, B. E., Schwartz, M. W. Hypothalamic inflammation: marker or mechanism of obesity pathogenesis? Diabetes. 62 (8), 2629-2634 (2013).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61 (6), 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Exp Diabetes Res. 2012, 847246 (2012).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61 (7), 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (7), E897-E906 (2013).
- Chan, O., Burke, J. D., Gao, D. F., Fish, E. N. The chemokine CCL5 regulates glucose uptake and AMP kinase signaling in activated T cells to facilitate chemotaxis. J Biol Chem. 287 (35), 29406-29416 (2012).
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266 (5 Pt 2), R1711-R1715 (1994).
- Mayer, C. M., Fick, L. J., Gingerich, S., Belsham, D. D. Hypothalamic cell lines to investigate neuroendocrine control mechanisms. Front Neuroendocrinol. 30 (3), 405-423 (2009).
- Lizunov, V. A., et al. Insulin stimulates fusion, but not tethering, of GLUT4 vesicles in skeletal muscle of HA-GLUT4-GFP transgenic mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (8), E950-E960 (2012).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
