Summary
Denne protokol beskriver en teknik til observation af real-time grøn fluorescens Protein (NGL) mærket glukose Transporter 4 (GLUT4) protein handel på insulin stimulation og karakterisering af CCR5 biologiske rolle i insulin – GLUT4 signalering pathway med Deconvolution mikroskopi.
Abstract
Type 2 diabetes mellitus (T2DM) er en global sundhedskrise, som er karakteriseret ved insulin signalering værdiforringelse og kronisk betændelse i perifere væv. Hypothalamus i centralnervesystemet (CNS) er kontrolcenter for energi og insulin signal svar forordning. Kronisk betændelse i perifere væv og ubalancer af visse kemokiner (f.eks. CCL5, TNFα og IL-6) bidrage til diabetes og fedme. Men de funktionelle mekanismer forbinder kemokiner og hypothalamus insulin signal forordning stadig er uklare.
In vitro primære neuron kultur modeller er praktisk og enkle modeller, som kan bruges til at undersøge insulin signal forordning i hypothalamus neuroner. I denne undersøgelse indført vi exogeneous GLUT4 protein konjugeret med normal god landbrugspraksis (NGL-GLUT4) i primære hypothalamus neuroner til at spore GLUT4 membran translokation på insulin stimulation. Time-lapse billeder af normal god landbrugspraksis-GLUT4 protein handel blev indspillet af deconvolution mikroskopi, der tillod brugere at generere høj hastighed og høj opløsning billeder uden at beskadige neuronerne betydeligt mens foretage forsøget. Bidrag af CCR5 i insulin reguleret GLUT4 omplantningen blev observeret i CCR5 mangelfuld hypothalamus neuroner, der blev isoleret og kulturperler fra CCR5 knockout mus. Vores resultater viste, at GLUT4 membran translokation effektivitet blev reduceret i CCR5 mangelfuld hypothalamus neuroner efter insulin stimulation.
Introduction
Type 2 diabetes mellitus (T2DM) er en global sundhedskrise. T2DM er præget af insulin signalering værdiforringelse og kronisk betændelse i perifere væv. Hypothalamus er det kontrolcenter, som regulerer kroppens energi homøostase, appetit og døgnrytmen. Vigtigst, medierer hypothalamus også insulin signal lydhørhed for at regulere systemisk stofskifte1,2,3,4,5. Forstyrre hypothalamus insulin signalering pathway kunne fremkalde insulin resistens6,7. Hypothalamus koordinerer cellulære energi status og udskillelsen af hormoner, som insulin og adipokines (fx, leptin) fra de perifere væv, at regulere systemisk glukosemetabolismen, insulin lydhørhed og fødeindtagelse. Insulin binding til insulin receptor aktiveres insulin receptor substrat (IRS) proteiner, som derefter aktivere insulin downstream signaling molekyler, såsom PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) og AKT (protein kinase B (PKB/AKT)), til at fremkalde GLUT4 membran translokation. Neuroner er ikke de store mål for glukoseoptagelse i svar til insulin; dog er betydelige niveauer af GLUT4 udtryk blevet identificeret i regionen hypothalamus arcuate kernen (ARC). Derfor, regulering af GLUT4 i hypothalamus neuroner kan spille en vigtig rolle i insulin signalering i hjernen-perifere akse.
Mange undersøgelser har antydet, at kronisk inflammation og inflammatoriske kemokiner i hypothalamus spiller også en vigtig rolle i udviklingen af diabetes og fedme, og hæmning af hypothalamus betændelse kan tilbageføre kost-induceret insulinresistens 8 , 9 , 10. Desuden, chemokine-CCL5 (C-C motiv ligand 5, også kendt som RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) og dens receptor CCR5 niveauer også hænger sammen med udviklingen af T2DM11,12. CCL5 og CCR5 roller i insulin funktion og glukose metabolismen er uklare. En undersøgelse rapporteret at CCR5 mangel beskyttet mus fra fedme-induceret inflammation, makrofag rekruttering og insulin resistens11; i modsætning, rapporterede en anden undersøgelse, at CCR5 mangel forringer systemisk glukosetolerance, samt adipocyt og muskel insulin signalering12. CCL5 er fundet at øge glukoseoptagelse i T-celler og reducere fødeindtagelse gennem sin indsats på hypothalamus13,14, men både virkningsmekanismen og de involverede receptorer er endnu at blive identificeret.
Det er vanskeligt at undersøge de cellulære mekanismer bag virkningen af perifere væv betændelse på insulin funktion i hypothalamus neuroner. Dette er på grund af cellulære heterogenitet og neuron kredsløb feedback bestemmelser. Af denne grund giver en in vitro- celle kultur model en ren model til at undersøge virkningerne af chemokine på hypothalamus insulin signal forordning. Selvom der er mange etableret udødeliggjort hypothalamus neuronal cellelinjer til forskning brug, disse cellelinjer udtrykt forskellige markører, og derfor repræsenterer forskellige typer af hypothalamus neuroner15. Selvom primære hypothalamus kulturer kan være vanskelige at vedligeholde, de kan levere de mest realistiske svar af hypothalamus neuroner ved insulin stimulation, og kan også undgå potentiale ukendte virkninger, som kommer i spil når opretholdelse af celler langsigtet dyrkningsmedium med kunstige vækstfaktorer.
Heri, vi udnytte primære hypothalamus neuroner fra både C57BL/6 vildtype (WT) musen og CCR5 knockout (CCR5- / -), og transfect begge typer af celler med normal god landbrugspraksis-GLUT4 konstruktion. For at undersøge CCR5 bidrag til insulin medieret GLUT4 membran handel, blev normal god landbrugspraksis-GLUT4 transfekteret neuroner behandlet med insulin eller rekombinante CCL5. Vi karakteriserer derefter bevægelighed for normal god landbrugspraksis-GLUT4 på plasmamembran i primære hypothalamus neuroner med Deconvolution mikroskopi.
Protocol
Alle de protokoller og metoder, der anvendes i animalsk emner er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Taipei medicinske universitet (protokol numre: LAC-2013-0278; LAC-2015-0397)
1. primære Neuron kultur
- Forberedelse før kultur
- Coat kultur retter med poly-D-lysin (tabel 1) én dag før kultur. For en 6-godt parabol, tilføje 1,5 mL poly-D-lysin (0,05 mg/mL) i hver brønd. For live-imaging, kultur celler på en 12 mm x 12 mm coverslip i en standard belagt 6-godt plade.
- Fjern/genanvende poly-D-Lysin og vaske op to gange med 2 mL ddH2O.
- Forberede de kirurgiske værktøjer: et par micro-dissekere saks, buet spids pincet og standard straight-tippet pincet. Sterilisere de kirurgiske værktøjer og holde dem i 75% ethanol under kirurgi.
- Fylde 10 cm petriskåle med 20 mL vask medium (tabel 1) og holde på is.
- Fyld en 15 mL reagensglas med 15 mL vask medium og holde røret på is.
- Hjernens væv isolation fra forskellige hjerneregioner
- Ofre 16-19 dage gamle gravid hunmus med standard euthanization protokoller ved at placere mus i en ikke-ventileret bur og derefter berusende med CO2. E15.5 ~ E16.5 embryoner anbefales til hypothalamus neuronal kultur og E16.5 ~ E17.5 er mere velegnede til hippocampus og kortikale neuronal kultur.
- Sterilisere platform, dissekere mikroskop og kirurgi værktøjer med 75% ethanol til at undgå forurening.
- Skær omkring området navlestrengen (mørke rød område, figur 1A, 1B -streg-linje) til at isolere pups nemt uden at beskadige dem (figur 1 c, 1 D).
- Fjerner den hoved del af hver hvalp med en saks (figur 1E, F), så sikkert den hoved del på plads ved hjælp af den fine spids lige pincet for regionen øjet (figur 1 g). Brug en anden bøde-tippes buet pincet til at fjerne den ydre huden og kraniet fra to sider og skræl dem fra den forreste til den dorsale retning (figur 1 H, sort pil peger i retningen). Hjernen skal holdes isoleret uden skader (figur 1I).
Bemærk: Det er vigtigt at bevare integriteten af hjernen for at sikre nøjagtighed, når isolere forskellige regioner af hjernen. - Holde isolerede hjerner i en ren petriskål med iskold vask medium for følgende trin.
- Flip hjernen og holde den ventrale side. Hypothalamus er en rund struktur i midten af hjernen (figur 1J, pil peger i hypothalamus regionen). Isolere hypothalamus vævet med fine spids buet pincet. Fjerne meninges (som har en gullig-rød farve) omhyggeligt.
Forsigtig: Fuldstændig fjernelse af meninges er et afgørende skridt til at undgå fibroblast forurening. - Hold den olfaktoriske lap med den skarpe pincet og skrælle tynde meninges omkring hele hjernen med buet pincet (figur 1 K, L).
- Hippocampus er en banan-lignende figur, der er indlejret i den nederste del af cortex. Flip til undersiden af cortex og adskille hippocampus fra cortex ved at trække den til side med buet pincet (figur 1 MN og O). Sørg for at fjerne alle resterende meninges omkringliggende hjernevæv.
- Når alle regioner af hjernen har været isoleret, hugge disse væv i 15 mL rør indeholdende iskold vask medium ved hjælp af pincet (trin 1.1.5).
Bemærk: Hjernen væv kan opbevares i det iskolde vask medium for 2-3 h.
- Væv fordøjelse, plating og kultur
- Skyl væv af invertere væv-holdige 15 mL tube 2 - 3 gange, og derefter holde røret lige tillade væv til at slå sig ned (1-3 min).
- Fjern den øverste medium ved hjælp af glas Pasteur pipette knyttet til et vakuum system. For at vaske væv, tilføje 15 mL is kold vask medium og vend røret 2 - 3 gange. Gentag vask trin 3 gange før det næste skridt.
FORSIGTIGHED: Vær forsigtig med væv på bunden, når du fjerner det øverste medium ved hjælp af et vakuum system. - Efter den sidste vask, tag vask medium ved hjælp af 1 mL pipette.
- Inkuber væv med Papain-Trypsin fordøjelsen buffer (tabel 1) i et 37 ° C vandbad i 7-14 min. Ryst rørene hver to min til at sikre, at alle væv er korrekt eksponeret til fordøjelsen buffer.
Bemærk: Inkubationstiden og mængden af fordøjelsen buffer kan justeres baseret på væv størrelsen. Hypothalamus væv indsamlet fra 6-8 unger, anbefales 300 µL Papain-Trypsin fordøjelsen buffer og 7 min inkubationstiden. Mere væv vil kræve flere fordøjelsen buffer. - Neutralisere enzymets aktivitet ved at tilføje 1 bind af føtal bovint serum. Ryst reagensglas 3 - 5 gange ved stuetemperatur.
- Holde røret på stativer og vente 1-2 min til at tillade væv til at slå sig ned; Fjern supernatanten omhyggeligt med 1 mL pipette.
- Tilføj 6 mL plating medium (tabel 1) ind i reagensglas og afpipetteres væv up-and-down 50 gange med 5 mL pipette forsigtigt (for en 6-godt plade, 1,5 mL plating medium pr. brønd anbefales). De fleste celler vil tage afstand til enkelt celler efter gentagen pipettering.
Bemærk: Prøv at undgå dannelsen af boblerne mens du udfører dette trin. De fleste laboratorier anvender flammede glas græs pipets for at adskille væv. 5 mL pipette med en smal spids kan være et godt alternativ til dette trin. - Holde et rør på rack og vente 1-2 min til at tillade de chunky, un-dissocierede væv til at slå sig ned. Tage den øverste fase, der indeholder dissocieres celler til et nyt rør og fortyndes med plating medium (5 x volumen plating medium pr. 1 x mængden af dissocierede celler. For eksempel, tilsættes 5 mL plating medium til 1 mL dissocieres celler).
- Beregne den celle tæthed ved hjælp af en hemocytometer og frø det krævede antal celler i kultur pladen beklædt med poly-D-lysin i trin 1.1.1. Vi anbefaler, 2-4 x 105 celler pr. brønd for en 6 godt parabol/35 mm parabol blev anbefalet til neuron billeddiagnostiske undersøgelser. En højere tæthed vil være behov for protein indsamling og analyse.
Bemærk: Læg ikke for meget plating medium, 1-1,5 mL plating medium i en 6-godt parabol er tilstrækkelig for vedhæftet fil. En stor mængde af medie vil forlænge den nødvendige tid til ordentlig celle vedhæftet fil. - Vente 2-3 h og kontrollere de seedede neuroner under mikroskop. Neuroner vil begynde at vokse neuritis, når de lægger korrekt.
- Fjern plating medium og tilsæt 2 mL varmede vask medium (37 ° C) i skålen til vaske plating medium. Gentag dette trin to gange.
- Tilsættes 2 mL komplet næringssubstratet (tabel 1) i hver brønd i 6-godt parabol.
- Ændre halvdelen af medium hver 3-4 dage. Forberede det fuldstændige medium frisk hver gang. Neuroner kulturperler fra forskellige mus hjerneregioner vil have forskellige morfologi og karakteristika (figur 2).
2. Transfektion af Plasmid DNA i primære Neuron med Liposom System
Forsigtig: For neuron Transfektion anbefales en endotoxin-fri plasmid DNA rensning kit (Materialer tabel) for DNA forberedelse. Yderligere ethanol nedbør kan fjerne overskydende opløsningsmiddel og forbedrer DNA koncentration.
-
Liposom-baseret DNA Transfektion i primære neuroner.
Bemærk: Transfektion tid afhænger modning status kræves i eksperimenter. Hypothalamus neuroner var transfekteret på DIV 7-10 (DIV, dage in vitro).- DNA: Liposom blanding forberedelse: Fortynd normal god landbrugspraksis-GLUT4 plasmid DNA16 (2 µg) i et microcentrifuge rør indeholdende 300 µL lavt serum næringssubstratet. Forberede et andet microcentrifuge rør med 2 µL Liposom 300 µL lavt serum dyrkningsmedium, og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
- Kombinere indholdet af begge rør og Inkuber i 20-30 min. ved stuetemperatur.
- Fjerne neuron næringssubstratet fra kultur parabol. Tilføje 600 µL DNA-Liposom blandingen i hver brønd og inkuberes ved 37 ° C i 4-6 h.
- Efter 4-6 h, Fjern DNA-Liposom blandingen og tilsæt 2 mL næringssubstratet.
- Fluorescerende signaler, som normal god landbrugspraksis alene og GLUT4 protein konjugeret med normal god landbrugspraksis tag (figur 3 og figur 4), kan overholdes efter 18-72 h.
3. levende billede optagelse
-
Forbereder celler til Live Imaging
- Kultur WT og CCR5- / - hypothalamus neuron celler, der udtrykker grønne fluorescens protein mærket glukose transporter 4 (normal god landbrugspraksis-GLUT4) på #1.5 (eller 0,17 mm tykkelse) glas coverslip, der har været præ-coatede med poly-D-lysin i trin 1.1.1 i 6-godt plade.
- Forsigtigt fjerne coverslips med neuroner ved hjælp af pincet og placere den på glas dias med forsigtighed.
- Fjern overskydende medie/væske med delikat opgave klude. Fold Vådservietterne to gange, og anbring dem forsigtigt oven på coverslip. Tryk forsigtigt ned af vådservietter uden at flytte coverslip.
Forsigtig: Tryk ikke coverslip mod glas slide kraftigt. Formålet med dette trin er at sikre, at den coverslip ikke flytte/drift under image erhvervelse forårsaget af kraftig kraft. - Placere coverslips og dias på stadiet deconvolution mikroskop, med coverslip vendt ned, og sikret korrekt. Dette trin er at sikre, at stillingen dias forbliver konstant, så brugere kan spore det samme sæt af målceller senere.
- Observere WT og CCR5- / - hypothalamus neuron celler med en 60 x / 1,42 NA olie fordybelse mål linse.
- Behandle de markerede celle prøver med CCL5 (10 ng/mL) eller insulin (10 U/mL) for en min. tilføje 1,5 µL fortyndede insulin på kanten af coverslip.
- Visualisere og optage de markerede celle prøver straks. Program for videooptagelse software til at optage i 30 min.
-
Deconvolution mikroskopi og analyse
Bemærk: Denne del af protokollen kræver brug af en deconvolution mikroskop og specialiseret software til analyse.- Tænde den billedbehandlingssystem magt, tillade mikroskop fase til initialisere ordentligt, og tænd derefter LED-lyskilde.
- Tilføje immersionsolie (brydningsindeks 1.520 for levende prøver ved 37 ° C) på en 60 x 1.42 NA mål linse. Placere eksempeldias på mikroskopet med coverslip vender mod mål linse, og sikre diaset korrekt.
- Brug lyse-felt eller fluorescens belysning til at identificere target-cellerne. Justere fokus, indtil target-cellerne ses tydeligt. Flyt ikke objektive linse uden for området coverslip for at undgå unødvendige ridser.
- Identificere grøn fluorescens protein konjugeret glukose Transporter 4 (normal god landbrugspraksis-GLUT4) af normal god landbrugspraksis signal. Identificere ønskede målceller for image erhvervelse. Markerede celle motivpositionen kan udenad for fremtidig reference (figur 4).
- Setup korrekt eksperimentelle parametre (herunder pixel nummer, excitation bølgelængde, transmission procentdel, eksponeringstid, stak tykkelse, tidsinterval og billedbehandling totaltid) på hver målcellen. For dette eksperiment, var billede pixel nummer sat på 512 x 512 (det kan indstilles på 1.024 x 1.024 for højere opløsning) for normal god landbrugspraksis signaler. Eksponeringstiden blev sat mellem 0.025 til 0,05 s for hver 5 min. mindre laterale x, y og z justeringer kan styres af den anbefalede software (materialer tabel).
- Angiv parameteren eksponering til cirka 2.000 til 3.000 tæller til at opnå maksimal pixel intensitet. For at minimere fluorescens photobleaching, reducere andelen af excitation lystransmission så meget som muligt, mens holde eksponering tid mindre end 1 s. Gentag disse trin for hvert yderligere fluorescens kanaler og hver enkelt område af interesse.
- Angiv den øvre og nedre grænse af Z-stak hver målcellen. Dette kan opnås ved at flytte mikroskop fase indtil toppen og bunden af målcellen er begge lidt ude af fokus. Brugere kan justere opløsning af z-aksen ved at angive antallet af billeder mellem den øvre og nedre grænse (som kan gøres ved at angive afstanden mellem hvert billede).
- Stakke af billeder var deconvolved og senere analyseret ved hjælp af de respektive software-Velocity fra PerkinElmer i dette tilfælde.
Representative Results
Hypothalamus neuroner kulturperler fra mus blev yderligere identificeret ved immunfarvning med hypothalamus specifikke protein - pro-opiomelanocortin (POMC) antistof og neuronal markør - mikrotubulus-forbundet protein 2 (MAP2) (figur 2A). Vi bekræftede de primære kulturperler hypothalamus neuroner udtrykt hypothalamus protein POMC. Udtryk for CCR5 receptor og CCL5 i hypothalamus neuroner blev identificeret med specifikke antistoffer og co mærket med POMC antistof (figur 2A, 2B).
Efter 3 dages dyrkning, neuroner var transfekteret med normal god landbrugspraksis DNA (figur 3) eller normal god landbrugspraksis konjugeret GLUT4 (figur 4). Normal god landbrugspraksis udtryk kan normalt findes over hele cellen uden et bestemt mønster (figur 3) men GLUT4-normal god landbrugspraksis vil express som en punktformet-lignende struktur i cytosol (figur 4). Transfektion kit bruges i denne undersøgelse er ikke den mest effektive metode til neuron Transfektion; men det er en mindre strenge metode til bedre celle overlevelse efter Transfektion, som bidrager til bedre live-celle imaging/optagelse senere. Billeder af normal god landbrugspraksis-GLUT4 udtrykker neuroner blev taget før time-lapse film (figur 4A-B, supplerende video 1, 2) på insulin stimulation eller CCL5 stimulation (figur 4 c, supplerende video 3). Signaler af normal god landbrugspraksis og normal god landbrugspraksis-GLUT4 er klar og stærk i neuroner.
Hypothalamus neuroner med GLUT4-normal god landbrugspraksis Transfektion blev yderligere behandlet med insulin (40 U) til at karakterisere normal god landbrugspraksis-GLUT4 handel. Reprehensive videoer bevægelighed GLUT4-normal god landbrugspraksis på insulin stimulering i både WT og CCR5- / - hypothalamus neuroner er vist som Video 1 og Video 2, henholdsvis.
Figur 1: isolering af væv fra forskellige regioner af musen hjernen på fosterstadiet (dag 16,5). (A-D) Trin involveret i adskillelsen af hvalpe fra moderkagen. (E, F) Dissektion af en pup hovedet fra kroppen. (G-jeg) Trin involveret i isolation af hele hjernen fra kraniet. De sorte pil peger i retningen trækkes mens du fjerner kraniet med pincet. (J) isolering af hypothalamus. Den sorte pil peger på hypothalamus regionen mellem pincet. (K-L) Isolering af cortex af musen hjernen. Den sorte stjerne angiver kortikale regionen mus hjernen og hvide pilen peger til adskillelse af cortex fra hele hjernen. (M-O) Magtens hippocampus del fra cortex. Den øverste Hvid pil markerer den hippocampus væv og den nederste hvide pil markerer den kortikale væv. Skalere barer = 1 cm (A-F), 200 µm (G-O). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: karakterisering af hypothalamus neuronal markør - POMC og co udtryk for CCL5 og CCR5. (A) primære kulturperler hypothalamus neuroner var mærket med hypothalamus neuronal markør - POMC (rød), fælles udtryk for CCR5 (grøn) og neuron markør MAP2 (grå). (B) CCL5 (grøn) udtryk i POMC (rød) positive hypothalamus neuroner (Adapted fra den supplerende data reference17). Her, mærket DAPI kerne med blå farve. Skalere barer = 50 µm i (A) og (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: normal god landbrugspraksis protein udtryk i musen primære neuroner. Normal god landbrugspraksis plasmid DNA transfekteret til primære kulturperler neuroner efter 4 dage kultur (DIV4) med Liposom og udtryk en anden 3 dage (DIV7). (A-B) Normal god landbrugspraksis er udtrykt i både neuritis og soma. (C-D) Neuroner med mock Transfektion; DAPI mærket kernen i (B, D). Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: snapshots af normal god landbrugspraksis-GLUT4 i hypothalamus neuroner. (A, C) Normal god landbrugspraksis-GLUT4 protein udtrykt i vildtype (WT) hypothalamus neuroner og (B) CCR5- / - hypothalamus neuroner. Neuroner blev stimuleret med insulin (A, B) eller CCL5 (C). Pilene peger på normal god landbrugspraksis-GLUT4 punktformet i neuritis før (-) og efter (+) insulin eller CCL5 stimulation og stjerner peger på den overflade GLUT4-NGL før (-) og efter (+) CCL5 stimulation i (C). (Figur tilpasset fra reference17). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| 5 x Borade Buffer | Virksomheden | Butik nummer | Volumen |
| Borsyre | Sigma Aldrich | B6768 | 1.55 g |
| Borax | Sigma Aldrich | 71997 | 2.375 g |
| ddH2O | 100 mL | ||
| Filtreret, holde ved 4 ° C | |||
| 20 x Poly-D-lysin lager | Virksomheden | Butik nummer | Volumen |
| Poly-D-lysin | Sigma Aldrich | P6407 | 100 mg |
| ddH2O | 100 mL | ||
| Filtreret, holde på-20 ° C | |||
| 1 x Poly-D-lysin | Volumen | ||
| 20 x Poly-D-lysin | 5 mL | ||
| 5 x Borade Buffer | 20 mL | ||
| Hedeselskabet2O | 75 mL | ||
| I alt | 100 mL | ||
| Holde ved 4 ° C | |||
| Vask Medium | Virksomheden | Butik nummer | Volumen |
| DMEM-høj glukose | Gibco | 12800-017 | 495 mL |
| Antibiotikum-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 5 mL |
| I alt | 500 mL | ||
| Holde ved 4° C | |||
| Papain-Trypsin fordøjelsen buffer: | Virksomheden | Butik nummer | Volumen/endelig koncentration |
| Papain (10 mg/mL) | Sigma Aldrich | P4762 | 200 µL (2 mg/mL) |
| Trypsin-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200-072 | 200 ΜL (0,05%) |
| Vask Medium | 600 ΜL | ||
| I alt | 1.000 ΜL | ||
| Holde på-20 ° C | |||
| Plating medium: | Virksomheden | Butik nummer | Volumen |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | 176 mL |
| Føtal bovint Serum | Gibco | 10437-028 | 20 mL |
| L-glutamat (200 mM) | Gibco | 25030 | 2 mL |
| Antibiotikum-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 2 mL |
| I alt | 200 mL | ||
| Holde ved 4 ° C | |||
| Komplet næringssubstratet | Virksomheden | Butik nummer | Volumen |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | 95 mL |
| N2 supplement (100 x) | Gibco | 17502-048 | 1 mL |
| B27 supplement (50 x) | Gibco | 17504-04 | 2 mL |
| L-glutamat (200 mM) | Gibco | 25030 | 1 mL |
| Antibiotikum-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 1 mL |
| I alt | 100 mL | ||
| Frisklavet |
Tabel 1: Fordøjelse buffer og medierne sammensætning anvendes i denne undersøgelse.
Supplerende Video 1: Insulin stimulerede normal god landbrugspraksis-GLUT4 bevægelse i WT hypothalamus neuroner. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Video 2: Insulin stimulerede normal god landbrugspraksis-GLUT4 bevægelse i CCR5- / - hypothalamus neuroner. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Video 3: CCL5 stimuleres normal god landbrugspraksis-GLUT4 bevægelse i WT hypothalamus neuroner (Video tilpasset fra reference17). Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Evnen til at overvåge levende celler, ved CCL5 eller insulin stimulation, er af afgørende betydning for at studere den hurtige virkning af CCL5 eller insulin på GLUT4 bevægelse. I virkeligheden, det giver os mulighed at visualisere den store forskel mellem WT og CCR5- / - hypothalamus neuroner ved insulin stimulation. Vi har udført den overflade mærkning af endogene GLUT4 protein i WT og CCR5- / - hypothalamus neuroner på forskellige tidspunkter efter insulin stimulation17. Mærkning af celle overflade proteiner kræver høj specificitet antistof med lav baggrund. Derudover kan overflade fluorescens kvantificering også være udfordrende og tidskrævende. Således time-lapse optagelse tillader os at være sikker på, at virkningen af CCL5 eller insulin er et sandt fysiologiske ændringer baseret på forsøgsbetingelser, snarere end en statistiske variation. Sammen med overflade mærkning af endogene GLUT4, leverer vi stærke beviser og eksperimenter for at vise, hvordan CCL5 og CCR5 deltage i GLUT4 omplantning og insulin signalering.
I moderne cellebiologi og molekylær biologi undersøgelser kræver mange eksperimenter brugen af Fluorescens mikroskopi. Denne teknologi giver forskerne til at visualisere den rumlige forhold mellem proteiner og/eller cellulære organeller, ud over bevægelsesretning og hastighed, stimulerende virkninger, morfologiske ændringer og protein handel. Denne teknologi har dog stadig sin begrænsning: når fluorophores er glade, signaler, der udsendes fra target protein (eller område) kan blive overvældet af baggrunden fluorescens. Som et resultat, kan fluorescens billeder vises sløret med forventede signaler begravet dybt ind i baggrunden signaler. Dette fænomen er særligt tydeligt for observation af membran-bundet proteiner.
Total interne Reflection Fluorescens mikroskopi (TIRFM) blev udviklet for at overvinde denne vanskelighed. Det giver forskerne til at visualisere excitation af valgte overflade-bundet fluorophores uden at påvirke baggrund fluorophores. Det giver forskerne at selektivt karakterisere funktioner og begivenheder på en meget tynd overflade region som et plasma membran. Deconvolution mikroskopi er en beregningskrævende billedbehandling teknik, der er gjort mulig ved hjælp af teknologiske fremskridt i de seneste år. Det er ofte blevet udnyttet for at forbedre digital fluorescens billedopløsning. Som nævnt tidligere, når fluorophores er ved at blive ophidset af nogen form for belysning (f.eks. laser eller LED), vil alle fluorophores udsende lys signaler uanset om de er i fokus eller ej, så billedet altid vises sløret. Denne sløring er forårsaget af et fænomen kaldet "Punkt spredes funktion" (PSF), som lys kommer fra et lille fluorescerende kilde (lyspunkt) bliver spredt ud yderligere og blive ude af fokus (sløring). I princippet, denne begivenhed vil producere et timeglas-lignende formet fluorescerende signal og et fluorescens billede kan gøres op i mange sådanne lys signaler. Deconvolution proces kan gentildele alle fluorescens signaler til sin oprindelige lyse plet form og fjerne det meste af out-of-fokus lys for at forbedre kontrasten i billedet.
I de seneste år, har deconvolution algoritmer genererede billeder med sammenlignelige opløsning end en Konfokal mikroskop. Desuden, i forhold til TIRFM, som forhindrer out-of-fokus sløring fra at blive opdaget af en begrænset excitation region, wide-felt mikroskopi tillader alle lys signaler til at blive opdaget og omfordeler dem tilbage til deres kilde gennem deconvolution proces. Derfor i praksis er deconvolution mikroskopi blevet en mere effektiv image erhvervelse metode, men også en mere omkostningseffektiv metode i forhold til JOHANNAS mikroskopi.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for de tilskud, der er fastsat af Ministeriet for videnskab og teknologi, Taiwan - MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) og sundhed og velfærd tillæg af tobaksvarer - MOHW106-TDU-B-212-144001 til S-Y C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
| SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
| VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
| Insulin | Actrapid, Denmark | ||
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
| GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
| Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
| CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
| 12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
| micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
| curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
| 5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |
References
- Levin, B. E., Sherwin, R. S. Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter? J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).
- Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., Kahn, C. R. Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function. Diabetes. 63 (7), 2232-2243 (2014).
- Duarte, A. I., Moreira, P. I., Oliveira, C. R. Insulin in central nervous system: more than just a peripheral hormone. J Aging Res. 2012, 384017 (2012).
- Vogt, M. C., Bruning, J. C. CNS insulin signaling in the control of energy homeostasis and glucose metabolism - from embryo to old age. Trends Endocrinol Metab. 24 (2), 76-84 (2013).
- Plum, L., Schubert, M., Bruning, J. C. The role of insulin receptor signaling in the brain. Trends Endocrinol Metab. 16 (2), 59-65 (2005).
- Lin, X., et al. Dysregulation of insulin receptor substrate 2 in beta cells and brain causes obesity and diabetes. J Clin Invest. 114 (7), 908-916 (2004).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. J Biol Chem. 279 (34), 35298-35305 (2004).
- Thaler, J. P., Guyenet, S. J., Dorfman, M. D., Wisse, B. E., Schwartz, M. W. Hypothalamic inflammation: marker or mechanism of obesity pathogenesis? Diabetes. 62 (8), 2629-2634 (2013).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61 (6), 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Exp Diabetes Res. 2012, 847246 (2012).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61 (7), 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (7), E897-E906 (2013).
- Chan, O., Burke, J. D., Gao, D. F., Fish, E. N. The chemokine CCL5 regulates glucose uptake and AMP kinase signaling in activated T cells to facilitate chemotaxis. J Biol Chem. 287 (35), 29406-29416 (2012).
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266 (5 Pt 2), R1711-R1715 (1994).
- Mayer, C. M., Fick, L. J., Gingerich, S., Belsham, D. D. Hypothalamic cell lines to investigate neuroendocrine control mechanisms. Front Neuroendocrinol. 30 (3), 405-423 (2009).
- Lizunov, V. A., et al. Insulin stimulates fusion, but not tethering, of GLUT4 vesicles in skeletal muscle of HA-GLUT4-GFP transgenic mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (8), E950-E960 (2012).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
