Summary
Gözlem gerçek zamanlı yeşil Floresans Protein (GFP), glukoz taşıyıcı 4 (GLUT4) protein insülin stimülasyon ve biyolojik rolü CCR5 insülin-GLUT4 karakterizasyonu üzerine kaçakçılığı öğesini için bu iletişim kuralı bir teknik anlatılmaktadır yolu Deconvolution mikroskobu ile işaret.
Abstract
Tip 2 diabetes mellitus (T2DM) bozukluğu ve periferik dokularda kronik inflamasyon sinyal insülin ile karakterize bir küresel sağlık krizdir. Merkezi sinir sistemi (MSS) hipotalamus enerji ve insülin sinyal yanıt düzenlemesine yönelik kontrol merkezidir. Kronik inflamasyon periferik dokulara ve dengesizlikler belirli kemokinler (örneğin, CCL5, TNFα ve Il-6), şeker hastalığı ve obezite için katkıda bulunur. Ancak, kemokinler ve hipotalamik insülin sinyal yönetmelik hala bağlama fonksiyonel mechanism(s) belirsiz kalır.
Hipotalamik nöronlar insülin sinyal yönetmelikte araştırmak için kullanılan uygun ve basit modeller vitro birincil nöron kültürü modellerdir. Bu çalışmada, biz GLUT4 membran translocation insülin stimülasyon üzerine izlemek için birincil hipotalamik nöronlar GFP (GFP-GLUT4) ile Birleşik exogeneous GLUT4 protein girmiştir. GFP-GLUT4 protein ticareti hızlandırılmış görüntüleri nöronlar önemli ölçüde deney sırasında zarar vermeden yüksek hızlı, yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak kullanıcılara izin deconvolution mikroskobu tarafından kaydedildi. CCR5 katkı düzenlenir insülin GLUT4 translocation izole ve CCR5 nakavt fareler kültürlü CCR5 eksik hipotalamik nöronlar, gözlendi. Sonuçlarımız GLUT4 membran translocation verimliliği insülin stimülasyon sonra CCR5 eksik hipotalamik nöronlarda düşürüldü gösterdi.
Introduction
Tip 2 diabetes mellitus (T2DM) bir küresel sağlık krizdir. T2DM bozukluğu ve periferik dokularda kronik inflamasyon sinyal insülin ile karakterizedir. Hipotalamus vücudun enerji Homeostazı, iştah ve sirkadiyen ritim düzenleyen kontrol merkezidir. En önemlisi, hipotalamus aynı zamanda sistemik metabolizma1,2,3,4,5düzenleyen insülin sinyal yanıt aracılık eder. Hipotalamik insülin yolu insülin direnci6,7neden sinyal kesintiye. Hipotalamus hücresel enerji durumu ve salgılanması hormonlar, insülin ve adipokines (örneğin, leptin) Sistemik glikoz metabolizması, insülin yanıt ve gıda alımı düzenleyen periferik dokulara gelen gibi düzenler. İnsülin reseptör insülin bağlama etkinleştirir ardından PI3K gibi insülin aşağı akım sinyal molekülleri harekete geçirmek insülin reseptör substrat (IRS) proteinler (phosphatidylinositol 3-kinaz) ve GLUT4 ikna etmek için AKT (protein kinaz B (PKB/AKT)), membran translocation. Sinir hücreleri insülin yanıt olarak glikoz alımı için uğrak değildir; Ancak, GLUT4 ifade önemli düzeyde hipotalamik arcuate çekirdeği (ARC) bölgede tespit edilmiştir. Bu nedenle, hipotalamik nöronlar GLUT4 yönetmelikte beyin-periferik eksen sinyal insülin önemli bir rol oynayabilir.
Birçok çalışma kronik inflamasyon ve inflamatuar kemokinler hipotalamus aynı zamanda şeker hastalığı ve obezite gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır ve hipotalamik iltihap inhibisyonu diyet kaynaklı insülin direnci ters kaydedebilirsiniz tavsiye ettiler 8 , 9 , 10. Ayrıca, Kemokin-CCL5 (C-C motifi ligand 5, olarak da bilinen RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) ve onun reseptör CCR5 düzeyleri de T2DM11,12gelişimi ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. CCR5 ve CCL5 roller insülin işlevi ve glikoz metabolizması belirsiz kalır. Bir çalışmada obezite kaynaklı iltihabı, makrofaj işe alım ve insülin direnci11CCR5 eksikliği fareler korunan rapor; Buna ek olarak, başka bir çalışmada CCR5 eksikliği sistemik glikoz toleransı, hem de12sinyal adipocyte ve kas insülin bozar bildirdi. CCL5 T-hücreleri glukoz alımını artırmak için ve hipotalamus13,14, ancak, her iki etki mekanizması üzerine eylem yoluyla gıda alımını azaltmak için bulunur ve reseptörleri dahil henüz tespit edilmesi.
Hipotalamik nöronlarda işleyen insülin periferik doku iltihabı etkisi altında yatan hücresel mekanizmaları incelemek zordur. Hücresel heterojenite ve nöron devre geribildirim düzenlemeleri nedeniyle bu. Bu nedenle vitro hücre kültür modeli hipotalamik insülin sinyal yönetmelik Kemokin etkilerini araştırmak için temiz bir model sağlar. Birçok araştırma kullanım ölümsüzleştirdi hipotalamik nöronal hücre hatlarında kurulmuş olsa da, bu hücre satırları farklı işaretleri ifade ve bu nedenle, hipotalamik nöronlar15farklı türlerini temsil eder. Birincil hipotalamik kültürleri korumak zor olabilir rağmen onlar insülin stimülasyon üzerine hipotalamik nöronların en gerçekçi yanıt sağlayabilir ve ayrıca bilinmeyen etkileri hangi gelmek içine oyun ne zaman hücreleri korumak potansiyel önleyebilirsiniz yapay büyüme faktörleri ile Kültür ortamında uzun vadeli.
Burada, biz birincil hipotalamik nöronlar C57BL/6 wildtype (WT) fare ve CCR5 nakavt (CCR5- / -) fare kullanmak ve her iki tip hücre GFP-GLUT4 yapısı ile transfect. CCR5 katkısını aracılı insülin GLUT4 membran kaçakçılığı için araştırmaya, GFP-GLUT4 transfected nöronlar insülin veya rekombinant CCL5 ile tedavi edildi. Biz o zaman GFP-GLUT4 harekette plazma zarı içinde birincil hipotalamik nöronlar Deconvolution mikroskobu ile karakterize eder.
Protocol
Tüm iletişim kuralları ve yöntemleri hayvan bireylerde kullanılan kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komiteleri (IACUC), Taipei Tıp Üniversitesi tarafından onaylanmıştır (protokol numaraları: LAC-2013-0278; LAC-2015-0397)
1. birincil nöron kültürü
- Kültür öncesi hazırlık
- Kültür yemekleri Poli-D-lizin (Tablo 1) ile bir gün önce kültür kat. 6-iyi yemek için her kuyuya 1,5 mL Poli-D-lizin (0,05 mg/mL) ekleyin. 12 mm x 12 mm coverslip bir çift kaplamalı 6-şey plaka üzerinde canlı görüntüleme, kültür hücreler için.
- Kaldır/Poli-D-lizin geri dönüşüm ve 2 mL GKD2O. ile iki kez bulaşıkları yıkamak
- Cerrahi alet hazırlamak: bir çift mikro diseksiyon makası, kıvrık uçlu forseps ve standart düz uçlu forseps. Cerrahi .aletleri sterilize ve ameliyat sırasında % 75 etanol içinde saklayın.
- 10 cm petri yemekler ile 20 mL yıkama orta (Tablo 1) doldurmak ve buz üzerinde tutmak.
- 15 mL tüp bebek 15 mL yıkama orta ile doldurmak ve tüp buz üzerinde tutmak.
- Beyin dokusu farklı beyin bölgelerini izolasyonu
- 16-19 gün eski hamile kadın fareler standart euthanization protokol ile sigara havalandırılmış bir kafeste fareler yerleştirip CO2ile sarhoş edici kurban. E15.5 ~ E16.5 embriyo hipotalamik nöronal kültür ve E16.5 için önerilir ~ E17.5 daha Hipokampal ve kortikal nöronal kültür için daha uygundur.
- Platform, diseksiyon mikroskop ve ameliyat araçları kirlenmesini önlemek için % 75 etanol ile sterilize.
- (Koyu kırmızı alan, şekil 1A, 1B kesik çizgi) belgili tanımlık pups yalıtmak için göbek kordonu çevresini kolayca onları (şekil 1 c, 1 D) zarar vermeden kes.
- Her yavru baş kısmı makas (şekil 1E, F) bir çift ile kaldırın, sonra ince uçlu düz forseps (şekil 1G) göz bölgesi için kullanmayı yerde baş kısmı güvenli. Kullanım başka ince uçlu forseps dış deri ve kafatası iki taraftan kaldırmak ve anterior dorsal yönüne (şekil 1 H, siyah ok Puan yönde) üzerinden soyulmak için kavisli. Beyin (şekil 1I) herhangi bir zarar vermeden yalıtılması gerekir.
Not: Beynin farklı bölgeler izole zaman doğruluğunu sağlamak için beyin bütünlüğünü korumak için önemlidir. - İzole beyin temiz bir petri buz gibi yıkama orta için aşağıdaki adımları ile tutun.
- Beyin flip ve ventral yan devam et. Hipotalamus (şekil 1J, hipotalamik bölgeye ok noktaları) beyin ortasında yuvarlak bir yapıdır. Hipotalamik doku ince uçlu eğri Forseps ile izole et. (Sarı-kırmızı renk olan) meninkslerde kaldırmak dikkatle.
Dikkat: Meninkslerde tümüyle kaldırılmasını fibroblast kirlenmesini önlemek için kritik bir adımdır. - Olfaktör LOB keskin Forseps ile tutun ve ince meninkslerde eğri forseps (şekil 1 K, L) ile tüm beyin çevreleyen akasındaki.
- Hipokampüs korteks alt kısmında gömülü olduğu bir muz gibi şekildir. Korteksin alt flip ve hipokampüs korteks eğri Forseps ile (şekil 1 MN ve O) tarafına çekerek ayırın. Tüm kalan meninkslerde beyin dokusu çevreleyen kaldırdığınızdan emin olun.
- Buz gibi yıkama orta (Adım 1.1.5) forseps yardımıyla içeren 15 mL tüpler bu dokuların doğrayın, ne zaman beynin tüm bölgeler izole edilmiştir.
Not: 2-3 h için buz gibi yıkama orta beyin dokuları tutulabilir.
- Doku sindirim, kaplama ve kültür
- Dokuları doku içeren 15 mL tüp 2 - 3 kez ters çevirme tarafından durulama ve sonra tüp dokuları (1-3 dk) yerleşmek izin vermek için düz tut.
- Üst orta cam Pasteur pipet kullanarak bağlı bir vakum sistemi kaldır. Doku yıkamak için 15 mL buz soğuk yıkama orta ekleyin ve 2 - 3 kez tüp tersine çevirin. Bir sonraki adım önce 3 kez yıkama adımları yineleyin.
Dikkat: bir vakum sistemi kullanarak üst orta kaldırırken alt dokulara karşı dikkatli olun. - Son yıkama sonra yıkama orta 1 mL pipet yardımıyla kaldırın.
- Doku Papain-tripsin sindirim arabelleği (Tablo 1) 7-14 dk. sallamak için 37 ° C su banyosu ile tüm dokularda emin olmak için her iki min düzgün sindirim arabelleğe maruz borular kuluçkaya.
Not: Kuluçka süresi ve sindirim arabellek hacmi doku boyutu temelinde ayarlanabilir. 6-8 pups toplanan hipotalamik doku için 300 µL Papain-tripsin sindirim arabellek ve 7 dk. kuluçka süresi önerilir. Daha fazla doku daha fazla sindirim arabellek gerektirir. - Enzim aktivitesi fetal sığır serum 1 hacmi ekleyerek etkisiz hale getirin. Tüp 3 - 5 kez oda sıcaklığında sallamak.
- Tüp rafları tutmak ve yerleşmek doku izin vermek 1-2 dk bekleyin; süpernatant 1 mL pipet ile dikkatli bir şekilde çıkarın.
- 6 mL için yavaşça (6-şey plaka, 1,5 mL kaplama orta iyi başına tavsiye edilir) orta (Tablo 1) tüp ve damlalıklı alçalarak doku 50 defa 5 mL pipet ile kaplama ekleyin. En hücreleri pipetting tekrarlanan sonra tek hücrelere ayırmak.
Not: Bu adım yürütülmesi sırasında kabarcıklar oluşumunu önlemek deneyin. Çoğu laboratuvarları durumda cam mera pipets doku ayırmak için kullanın. 5 mL pipet dar bir ipucu ile bu adımı için iyi bir alternatif olabilir. - Bir tüp raf tutun ve aşağı yerleşmeye tıknaz, un Disosiye doku izin vermek 1-2 dk bekleyin. Al üst aşama içeren yeni bir tüp hücrelere ayrışmış ve orta (5 x 1 x birim Disosiye hücre başına birim kaplama orta. kaplama ile sulandırmak Örneğin, 5 Orta 1 mL ayrışmış hücreler için kaplama mL ekleyin).
- Bir hemasitometre kullanarak hücre yoğunluğu hesaplamak ve poli-D-lizin olduğu gibi adım 1.1.1 ile kaplı kültür plaka içine hücreler gerekli sayıda tohum. 2-4 x 6 iyi çanak/35 mm yemek için iyi başına 105 hücre çalışmaları Imaging nöron için tavsiye edildi öneririz. Yüksek yoğunluklu protein toplama ve analiz için gerekli olacaktır.
Not: çok fazla kaplama orta 1-1.5 mL kaplama orta bir 6-şey tabak içinde ek için yeterli eklemeyin. Orta aşırı miktarda uygun hücre eki için gereken süreyi uzatmak. - 2-3 h için bekleyin ve mikroskop altında numaralı seribaşı nöronlar kontrol edin. Nöronlar düzgün iliştirdiğinizde nörite büyümeye başlar.
- Kaplama orta kaldırın ve 2 mL sıcak yıkama orta (37 ° C) kaplama orta yıkamak için çanak içine ekleyin. Bu iki kez tekrarlayın.
- 6-iyi tabak içinde her kuyuya 2 mL tam kültür orta (Tablo 1) ekleyin.
- Orta yarısı her 3-4 gün değiştirin. Tam orta taze her zaman hazır olun. Farklı fare beyin bölgelerden kültürlü nöronların farklı morfoloji ve özellikleri (Şekil 2) var.
2. plazmid DNA transfection lipozom sistemi ile birincil nöron içine
Dikkat: nöron transfection için bir endotoksin-Alerjik plazmid DNA arıtma Kiti (Malzemeler tablo) DNA hazırlık için önerilir. Ek etanol yağış aşırı solvent kaldırabilirsiniz ve DNA konsantrasyonu artırır.
-
Lipozom tabanlı DNA transfection birincil nöronlar içinde.
Not: Transfection zaman deneylerde gerekli olgunlaşma durumuna bağlıdır. Hipotalamik nöronlar DIV 7-10 (DIV, gün içinde vitro) transfected.- DNA: Lipozom karışım hazırlama: seyreltik GFP-GLUT4 plazmid DNA16 (2 µg) bir microcentrifuge tüp içeren 300 µL düşük serum kültür orta. Başka bir microcentrifuge tüp ile 2 µL lipozom 300 µL düşük serum kültür ortamda hazırlamak ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
- Her iki tüpler içeriğini birleştirmek ve 20-30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Nöron kültürü orta kültür çanak kaldırın. Her kuyuya 600 µL DNA-lipozom karışımı ekleyin ve 4-6 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- Sonra 4-6 h, DNA-lipozom karışımı kaldırın ve 2 mL kültür orta ekleyin.
- GFP yalnız ve GFP etiketi (şekil 3 ve şekil 4), Birleşik GLUT4 protein gibi floresan sinyallerini 18-72 h sonra görülebilir.
3. canlı görüntü kaydı
-
Hazırlama hücreler için görüntüleme yaşamak
- Kültür yeşil Floresans protein glikoz taşıyıcı 4 (GFP-GLUT4) #1.5 (veya 0,17 mm kalınlığında) etiketli ifade WT ve CCR5- / - hipotalamik nöron hücreleri olan Poli-D-lizin adım 1.1.1 6-şey'ile önceden kaplanmış cam coverslip plaka.
- Dikkatle coverslips forseps kullanarak nöronlar ile çıkarın ve cam slaytlara dikkatle yerleştirin.
- Aşırı orta/sıvı hassas görev mendil ile kaldırın. İki kez mendil katlama ve dikkatle coverslip üstüne koyun. Yavaşça mendil coverslip hareket ettirmeden tuşuna basın.
Dikkat: Cam slayt karşı coverslip zorla bastırmayın. Bu adımın amacı coverslip hareket/batmaz zorla neden resim alma sırasında drift olduğunu değil emin olmaktır. - Coverslips ve slaytlar aşağı ve güvenli coverslip bakan deconvolution mikroskop sahnede düzgün yerleştirin. Bu adımı kullanıcılar aynı küme hedef hücre daha sonra takip edebilmek için slayt konumunu sabit kalır emin olmaktır.
- WT ve CCR5- / - hipotalamik nöron hücreleri 60 x olan gözlemlemek / 1,42 NA yağı daldırma objektif lens.
- Seçili hücre örnekleri CCL5 ile tedavi (10 ng/mL) veya insülin (10 U/mL) bir min. 1,5 eklemek µL coverslip kenarına seyreltilmiş insülin için.
- Görselleştirmek ve seçili hücre örnekleri hemen kaydedin. Programı için 30 dk kaydetmek için video kayıt yazılımı.
-
Deconvolution mikroskobu ve analiz
Not: Bu protokolün bir parçası analiz için bir deconvolution mikroskop ve özel yazılım kullanımını gerektirir.- Görüntüleme sistemi gücüyle açmak, mikroskop sahne hakkindayla ve LED ışık kaynağı açmak için izin.
- Daldırma yağ (Kırılma indisi 1.520 37 ° C'de canlı örnekleri için) bir 60 x 1,42 NA objektif lens ekleyin. Örnek slayt mikroskop objektif lens doğru bakan coverslip yerleştirin ve slayt düzgün güvenli.
- Alan parlak veya floresan aydınlatma hedef hücreleri tanımlamak için kullanın. Hedef hücreleri açıkça görülebilir kadar odağı ayarlayın. Objektif lens gereksiz çizik izleri önlemek için coverslip alanı dışında hareket ettirmeyin.
- Yeşil tanımlamak Floresans protein glikoz taşıyıcı 4 (GFP-GLUT4) GFP sinyal ile Birleşik. Resim alma için istenen hedef hücre belirle. Seçili hedef hücre konumu için gelecek bahsetme (şekil 4) belleğe.
- Kurulum (piksel numarası, uyarma dalga boyu, iletim yüzde, pozlama süresi, yığının kalınlığı, zaman aralığı ve toplam görüntüleme süresi de dahil olmak üzere) uygun deneysel parametreleri her hedef hücre üzerinde. Bu deneme için görüntü piksel sayısı 512 x 512 (Bu 1024 x 1024 daha yüksek çözünürlük için ayarlanabilir), GFP sinyalleri için ayarlandı. Pozlama süresi 0,025 s her 5 dk. küçük yanal x, y ve z ayarlamalar için önerilen yazılım (malzemeler tablo) tarafından kontrol edilebilir-0,05 arasında kuruldu.
- Pozlama parametresi en büyük piksel yoğunluğu elde etmek için yaklaşık 2000-3000 sayıları için ayarlayın. Floresan photobleaching en aza indirmek için koruma pozlama zaman iken 1 s. Yinele adımları her ek Floresans kanal (lar) ve ilgi bireysel her alan için uyarma ışık geçirgenliği mümkün olduğunca yüzdesini azaltın.
- Z yığının alt ve üst sınır her hedef hücre ayarlayın. Bu kadar hedef hücrenin alt ve üst biraz odak dışı hem de mikroskop sahneye taşıyarak elde edilebilir. Kullanıcı-ebilmek ayarlamak z ekseni çözünürlük (ki her görüntü arasındaki mesafe ayarlanarak yapılabilir) alt ve üst sınırı arasında görüntü sayısını ayarlayarak.
- Görüntü yığınları deconvolved ve daha sonra bu durumda ilgili yazılım-hız PerkinElmer gelen yardımı ile analiz.
Representative Results
Fareler kültürlü hipotalamik nöronlar daha fazla hipotalamik belirli protein - pro-opiomelanocortin (POMC) antikor ve nöronal marker - Mikrotubul ilişkili protein 2 (MAP2) ile immunostaining tarafından tespit edilmiştir (şekil 2A). Biz birincil kültürlü hipotalamik nöronlar hipotalamik protein POMC ifade doğruladı. Hipotalamik nöronlar CCR5 reseptör ve CCL5 ifadede özel antikorlar ile tespit ve POMC antikor (şekil 2A, 2B) ile birlikte etiketli.
Kültür 3 gün sonra nöronlar GFP DNA (şekil 3) ile transfected veya GFP Birleşik GLUT4 (şekil 4). GFP ifade genellikle hücrenin belirli bir desen (şekil 3) ama GLUT4 GFP olmadan bir punctate benzeri yapıda sitozol (şekil 4) olarak ifade edecek her yerde bulunabilir. Bu çalışmada kullanılan transfection kiti nöron transfection için en verimli yöntem değildir; Ancak, daha iyi yaşamak-daha sonra görüntüleme/kayıt hücreye katkıda bulunan transfection sonra daha iyi hücre hayatta kalmak için daha az sıkı bir yöntemdir. GFP-GLUT4 ifade nöronların görüntüleri hızlandırılmış Filmler (şekil 4A-B, ek video 1, 2) daha önce insülin stimülasyon veya CCL5 uyarı (şekil 4 c, ek video 3) alındı. GFP ve GFP-GLUT4 net ve nöronlar içinde güçlü sinyaller.
Hipotalamik nöronlar GLUT4-GFP transfection ile daha fazla ile insülin (40 U)-GFP-GLUT4 kaçakçılığı karakterize etmek için tedavi edildi. WT ve CCR5- / - hipotalamik nöronlar içinde insülin stimülasyon üzerine GLUT4-GFP hareketinin reprehensive videoları Video 1 ve Video 2, sırasıyla gösterilir.
Şekil 1: fare beyin farklı bölgelerinden dokuların yalıtım embriyonik aşamada (gün 16,5). (A-D) Plasenta ve yavrularını ayrılması katılan adımlar. (E, F) Vücut yavru head diseksiyon. (G-Ben) Kafatası gelen adımları tüm beyin yalıtım modunda yer. Siyah oku Puan yönde forseps kullanarak kafatası kaldırılırken çekilecek. (J) hipotalamus yalıtım. Siyah oku hipotalamik bölge forseps arasında işaret eder. (K-L) Fare beyin korteksi yalıtım. Siyah yıldız fare beyin ve beyaz ok noktası kortikal bölge korteks ayrılması için tüm beyin gösterir. (M-O) Korteks ayrılması Hipokampal bölümü. Hipokampal doku üst beyaz ok işaretleri ve alt beyaz ok kortikal doku işaretler. Ölçek çubukları = 1 cm (A-F), 200 µm (G-O). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: hipotalamik nöronal marker - POMC ve CCL5 ve CCR5 co ifadesi karakterizasyonu. (A)birincil kültürlü hipotalamik nöronlar CCR5 (yeşil) ve nöron marker MAP2 (gri) Co ifadesidir hipotalamik nöronal işaretçisiyle - POMC (kırmızı), etiketli. (B) CCL5 (yeşil) ifadesinde POMC (kırmızı) pozitif hipotalamik nöronlar (başvuru17takıma giren verilerden uyarlama). Burada, DAPI çekirdek mavi renk ile Etiketlenmiş. Ölçek çubukları içinde 50 µm = (A) ve (B). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: fare birincil nöronlar GFP protein ifadede. GFP plazmid DNA birincil kültürlü nöronların 4 gün kültür (DIV4) sonra lipozom ile transfected ve için başka bir 3 gün (DIV7) ifade. (A-B) GFP nörite ve soma ifade edilir. (C-D) Nöronlar ile alay etmek transfection; DAPI (B, D) çekirdeğinde etiketli. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: GFP-GLUT4 anlık görüntülerde hipotalamik nöronlar. (A, C) GFP-GLUT4 protein Wildtype (WT) hipotalamik nöronlar ve (B) CCR5- / - hipotalamik nöronlar ifade. Nöronlar uyarılmış insülin (A, B) veya CCL5 (C). GFP-GLUT4 punctate (-) önce nörite okları üzerine gelin ve sonra (+) insülin veya CCL5 stimülasyon ve yıldız gelin için yüzey GLUT4 GFP (-) önce ve sonra (+) CCL5 stimülasyon (C). (Şekil) başvuru17uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Borade arabellek x 5 | Şirket | Katalog numarası | Birim |
| Borik asit | Sigma-Aldrich | B6768 | 1,55 g |
| Boraks | Sigma-Aldrich | 71997 | 2.375 g |
| ddH2O | 100 mL | ||
| Filtre, 4 ° C'de tutmak | |||
| Poly-D-lizin hisse senedi x 20 | Şirket | Katalog numarası | Birim |
| Poli-D-lizin | Sigma-Aldrich | P6407 | 100 mg |
| ddH2O | 100 mL | ||
| Filtre, tutun-20 ° c | |||
| 1 x Poly-D-lizin | Birim | ||
| 20 x Poly-D-lizin | 5 mL | ||
| Borade arabellek x 5 | 20 mL | ||
| GKD2O | 75 mL | ||
| Toplam | 100 mL | ||
| 4 ° C'de tutmak | |||
| Yıkama orta | Şirket | Katalog numarası | Birim |
| DMEM-yüksek glikoz | Gibco | 12800-017 | 495 mL |
| Antibiyotik Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 5 mL |
| Toplam | 500 mL | ||
| 4 ° C'de tutmak | |||
| Papain-tripsin sindirim arabellek: | Şirket | Katalog numarası | Birim/FINAL konsantrasyonu |
| Papain (10 mg/mL) | Sigma-Aldrich | P4762 | 200 µL (2 mg/mL) |
| Tripsin-EDTA (%0.25) | Gibco | 25200-072 | 200 ΜL (% 0.05) |
| Yıkama orta | 600 ΜL | ||
| Toplam | 1000 ΜL | ||
| -20 ° C'de tutmak | |||
| Kaplama orta: | Şirket | Katalog numarası | Birim |
| Neurobasal orta | Gibco | 21103-049 | 176 mL |
| Fetal sığır Serum | Gibco | 10437-028 | 20 mL |
| L-Glutamat (200 mM) | Gibco | 25030 | 2 mL |
| Antibiyotik Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 2 mL |
| Toplam | 200 mL | ||
| 4 ° C'de tutmak | |||
| Tam kültür orta | Şirket | Katalog numarası | Birim |
| Neurobasal orta | Gibco | 21103-049 | 95 mL |
| N2 ek (100 x) | Gibco | 17502-048 | 1 mL |
| B27 ek (50 x) | Gibco | 17504-04 | 2 mL |
| L-Glutamat (200 mM) | Gibco | 25030 | 1 mL |
| Antibiyotik Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 1 mL |
| Toplam | 100 mL | ||
| Taze hazırlanmış |
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan sindirim tampon ve medya kompozisyon.
Ek Video 1: İnsülin uyarılmış WT hipotalamik nöronlar hareketinde GFP-GLUT4. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Ek Video 2: İnsülin uyarılmış CCR5- / - hipotalamik nöronlar hareketinde GFP-GLUT4. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Ek Video 3: WT hipotalamik nöronlar hareketinde GFP-GLUT4 CCL5 teşvik (Video) başvuru17uyarlanmıştır. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Discussion
CCL5 veya insülin stimülasyon, üzerine canlı hücreleri izleme olanağı kritik GLUT4 hareketi CCL5 veya insülin etkisi hızlı çalışmak için önemlidir. Aslında, WT ve CCR5- / - hipotalamik nöronlar insülin stimülasyon üzerine arasında anlamlı bir fark görselleştirmek için bize izin verir. Yüzey WT ve CCR5- / - hipotalamik nöronların farklı zaman noktalarda endojen GLUT4 proteinin insülin stimülasyon17sonra etiketleme gerçekleştirdiniz. Hücre yüzey proteinlerin etiketleme yüksek özgüllük antikor düşük arka plan gerektirir. Buna ek olarak, yüzey Floresans miktar da zor ve zaman alıcı olabilir. Böylece, hızlandırılmış kayıt emin olmamızı sağlayan CCL5 etkisi veya insülin istatistiksel bir varyasyon yerine, deneysel koşullar dayalı bir gerçek fizyolojik değişimdir. Yüzey endojen GLUT4 etiketleme ile birlikte, biz güçlü kanıtlar ve deneyler nasıl CCL5 ve CCR5 katılmak GLUT4 translocation ve insülin sinyal göstermek için sağlar.
Modern hücre biyolojisi ve moleküler biyoloji çalışmaları, birçok deney Floresans mikroskobu kullanımını gerektirir. Bu teknoloji proteinler ve/veya ek olarak hareket yönü ve hızı, uyarıcı etkileri, morfolojik değişiklikler ve protein kaçakçılığı hücre organelleri kayma ilişkisini görselleştirmek bilim adamları sağlar. Ancak, bu teknoloji hala onun sınırlama vardır: ne zaman fluorophores heyecanlı mısın, hedef protein (ya da alan) yaydığı sinyalleri arka plan Floresans tarafından bunalmış. Sonuç olarak, derin arka plan sinyalleri gömülü beklenen sinyallerle Floresans görüntüleri bulanık görünebilir. Bu fenomen membran bağlı proteinler gözlem için özellikle belirgindir.
Toplam iç yansıma Floresans mikroskobu (TIRFM) bu zorluk üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. Arka plan fluorophores etkilemeden seçili yüzey bağlı fluorophores uyarma görselleştirmek bilim adamları sağlar. Özellikler ve olaylar çok ince yüzey bölgesindeki bir plazma zarı gibi seçmeli olarak karakterize etmek bilim adamları sağlar. Deconvolution mikroskobu son yıllarda teknolojik gelişmeler sayesinde mümkün kılan teknik işleme yoğun hesaplama bir görüntüdür. Dijital floresan görüntü çözünürlüğünü artırmak için sık sık kullanılmıştır. Eğer odak ya da değil, görüntü her zaman bulanık görünür böylece fluorophores aydınlatma (lazer veya LED gibi) herhangi bir türüne göre heyecanlı olmak zaman daha önce belirtildiği gibi tüm fluorophores ışık sinyalleri ne olursa olsun-ecek göndermek. Bu bulanıklaştırma gibi küçük bir floresan kaynak (parlak nokta) hafif gelen daha fazla dağılın ve odak dışında (blur) haline "Noktası işlevi" (PSF), yaymak denilen bir olgu nedeniyle oluşur. Prensip olarak, bu olay bir kum saati gibi şekilli floresan sinyal üretecek ve çok sayıda bu tür ışık sinyalleri bir floresan görüntü yapılabilir. Deconvolution işleminin floresan sinyallerini orijinal parlak nokta formuna yeniden atayın ve görüntü kontrastı artırmak için odak ışık çoğu ortadan kaldırmak.
Son yıllarda, deconvolution algoritmaları görüntüler confocal mikroskop olan için karşılaştırılabilir oluşturmuş. Ayrıca, TIRFM ile karşılaştırıldığında, hangi odak bulanıklık geniş alanlı mikroskobu tüm ışık sinyalleri tespit edilmesini ve onları geri deconvolution sürecinde kendi kaynağına yeniden atar sağlar sınırlı uyarma bölgeye göre tespit engeller. Bu nedenle, uygulamada, deconvolution mikroskobu sadece daha verimli bir görüntü alma yöntemi, aynı zamanda TIRF mikroskopi için karşılaştırıldığında daha düşük maliyetli bir yöntem haline gelmiştir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
S-İ C'ye Bakanlığı bilim ve teknoloji, Tayvan - MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) ve sağlık ve refah ücretli tütün ürünleri - MOHW106-TDU-B-212-144001 tarafından sağlanan hibe için minnettarız
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
| SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
| VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
| Insulin | Actrapid, Denmark | ||
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
| GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
| Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
| CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
| 12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
| micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
| curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
| 5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |
References
- Levin, B. E., Sherwin, R. S. Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter? J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).
- Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., Kahn, C. R. Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function. Diabetes. 63 (7), 2232-2243 (2014).
- Duarte, A. I., Moreira, P. I., Oliveira, C. R. Insulin in central nervous system: more than just a peripheral hormone. J Aging Res. 2012, 384017 (2012).
- Vogt, M. C., Bruning, J. C. CNS insulin signaling in the control of energy homeostasis and glucose metabolism - from embryo to old age. Trends Endocrinol Metab. 24 (2), 76-84 (2013).
- Plum, L., Schubert, M., Bruning, J. C. The role of insulin receptor signaling in the brain. Trends Endocrinol Metab. 16 (2), 59-65 (2005).
- Lin, X., et al. Dysregulation of insulin receptor substrate 2 in beta cells and brain causes obesity and diabetes. J Clin Invest. 114 (7), 908-916 (2004).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. J Biol Chem. 279 (34), 35298-35305 (2004).
- Thaler, J. P., Guyenet, S. J., Dorfman, M. D., Wisse, B. E., Schwartz, M. W. Hypothalamic inflammation: marker or mechanism of obesity pathogenesis? Diabetes. 62 (8), 2629-2634 (2013).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61 (6), 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Exp Diabetes Res. 2012, 847246 (2012).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61 (7), 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (7), E897-E906 (2013).
- Chan, O., Burke, J. D., Gao, D. F., Fish, E. N. The chemokine CCL5 regulates glucose uptake and AMP kinase signaling in activated T cells to facilitate chemotaxis. J Biol Chem. 287 (35), 29406-29416 (2012).
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266 (5 Pt 2), R1711-R1715 (1994).
- Mayer, C. M., Fick, L. J., Gingerich, S., Belsham, D. D. Hypothalamic cell lines to investigate neuroendocrine control mechanisms. Front Neuroendocrinol. 30 (3), 405-423 (2009).
- Lizunov, V. A., et al. Insulin stimulates fusion, but not tethering, of GLUT4 vesicles in skeletal muscle of HA-GLUT4-GFP transgenic mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (8), E950-E960 (2012).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
