Summary
Denne protokollen beskriver en teknikk for observasjon av sanntids Green fluorescens Protein (GFP) merket glukose Transporter 4 (GLUT4) protein handel på insulin stimulering og karakterisering av biologiske rollen CCR5 i insulin-GLUT4 signalveien med Deconvolution mikroskopi.
Abstract
Type 2 diabetes mellitus (T2DM) er en global helse-krise som er preget av insulin signalering verdifall og kronisk betennelse i perifere vev. Hypothalamus i sentralnervesystemet (CNS) er kontrollsenteret for energi og insulin signal svar regulering. Kronisk betennelse i perifere vev og ubalanser av visse chemokines (som CCL5, TNFα og IL-6) bidra til diabetes og fedme. Men forbli de funksjonelle mechanism(s) chemokines og hypothalamus insulin signal regulering fortsatt uklare.
In vitro primære Nevron kultur modeller er praktisk og enkel modeller som kan brukes til å undersøke insulin signal regulering i hypothalamus nevroner. I denne studien introdusert vi exogeneous GLUT4 protein konjugert med GFP (GFP-GLUT4) i primære hypothalamus nevroner spore GLUT4 membran translokasjon på insulin stimulering. Tid-lapse bilder av GFP-GLUT4 protein handel ble registrert av deconvolution mikroskopi, som tillot brukere å generere høy hastighet, høyoppløselige bilder uten skade neurons betydelig mens gjennomføre eksperimentet. Bidraget av CCR5 i insulin regulert GLUT4 translokasjon ble observert i CCR5 mangelfull hypothalamus nevroner, som var isolert og kultivert fra CCR5 knockout mus. Resultatene viste at GLUT4 membran translokasjon effektiviteten ble redusert i CCR5 mangelfull hypothalamus nevroner etter insulin stimulering.
Introduction
Type 2 diabetes mellitus (T2DM) er en global helse-krise. T2DM er preget av insulin signalering verdifall og kronisk betennelse i perifere vev. Hypothalamus er kontrollsenteret som regulerer kroppens energi homeostase, appetitt og biologiske rytmer. Viktigst, formidler hypothalamus også insulin signal respons å regulere systemisk metabolisme,1,,2,,3,,4,,5. Forstyrre hypothalamus insulin signalering veien kan indusere insulin resistens6,7. Hypothalamus koordinerer celleenergien status og utskillelse av hormoner som insulin og endotelial (f.eks, leptin) fra perifere vev, å regulere systemisk glukose metabolisme, insulin respons og matinntaket. Insulin binding til insulin receptor aktiveres insulin receptor substrat (IRS) proteiner, som deretter aktivere insulin nedstrøms signalnettverk molekyler, som PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) og AKT (protein kinase B (PKB/AKT)), å indusere GLUT4 membran translokasjon. Neurons er ikke store målet for glukoseopptaket svar på insulin; Imidlertid er betydelige nivåer av GLUT4 uttrykk blitt identifisert i regionen hypothalamus arcuate nucleus (ARC). Regulering av GLUT4 i hypothalamus nevroner kan derfor spille en viktig rolle i insulin signalering i hjernen-tilleggsutstyr aksen.
Mange studier har antydet at kronisk betennelse og inflammatoriske chemokines i hypothalamus også spille en viktig rolle i utviklingen av diabetes og fedme, og hemming av hypothalamus betennelse kan reversere kosthold-indusert insulinresistens 8 , 9 , 10. videre, chemokine-CCL5 (C-C motiv ligand 5, også kjent som RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) og dens reseptor CCR5 nivåer også korrelerer med utviklingen av T2DM11,12. Rollene CCL5 og CCR5 i insulin funksjon og glukose metabolisme fortsatt uklare. En studie rapporterte at CCR5 mangel beskyttet mus fra fedme-indusert betennelser, macrophage rekruttering og insulin resistens11; i kontrast, rapporterte en annen studie at CCR5 mangel svekker systemisk glukosetoleranse, samt adipocyte og muskel insulin signalering12. CCL5 er funnet å øke glukose opptak i T-celler og redusere inntaket av mat gjennom sin handling på den hypothalamus13,14, men begge virkningsmekanismen og receptors involvert ennå identifiseres.
Det er vanskelig å studere mobilnettet mekanismene bak effekten av eksterne tissue betennelse på insulin fungerer i hypothalamus nevroner. Dette skyldes mobilnettet heterogenitet og Nevron krets tilbakemelding forskrifter. Derfor gir en i vitro celle kultur-modellen en ren modell for å undersøke effekten av chemokine på hypothalamus insulin signal regulering. Men det er mange etablerte udødeliggjort hypothalamus neuronal cellelinjer til forskningsbruk, disse cellelinjer uttrykt forskjellige markører, og derfor representerer ulike typer hypothalamus nevroner15. Selv om primære hypothalamus kulturer kan være vanskelig å vedlikeholde, de kan gi den mest realistiske responsen av hypothalamus nevroner på insulin stimulering, og kan også unngå potensialet ukjente effekter som kommer i spill når vedlikeholde celler langsiktig kultur medium med kunstig vekstfaktorer.
Her, vi anvende primære hypothalamus nevroner fra både C57BL/6 wildtype (WT) mus og CCR5 knockout (CCR5- / -) mus og transfect begge typer celler med GFP-GLUT4 konstruksjon. Undersøke bidrag av CCR5 insulin mediert GLUT4 membran smugling, ble GFP-GLUT4 transfekterte neurons behandlet med insulin eller rekombinant CCL5. Vi deretter karakteriserer bevegelse av GFP-GLUT4 på plasma membranen i primære hypothalamus nevroner med Deconvolution mikroskopi.
Protocol
Alle protokollene og metodene som brukes i dyr fag er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer (IACUC) i Taipei medisinske universitet (protokoll tall: LAC-2013-0278; LAC-2015-0397)
1. primære Nevron kultur
- Forberedelser før kultur
- Coat kultur retter med poly-D-Lysine (tabell 1) en dag før kultur. For en 6-vel rett, legger du til 1,5 mL poly-D-Lysine (0,05 mg/mL) i hver brønn. For live bildebehandling, kultur celler på en 12 x 12 mm dekkglassvæske i en standard belagt 6-vel plate.
- Fjern/resirkulering poly-D-lysine og vaske to ganger med 2 mL ddH2O.
- Forberede de kirurgiske redskaper: et par mikro-dissekere saks, buet-tipped tang og standard rett-tipped tang. Sterilisere de kirurgiske redskaper og holde dem i 75% etanol under operasjonen.
- Fyll 10 cm petri retter med 20 mL vask medium (tabell 1) og hold på is.
- Fyll en 15 mL reagensglasset med 15 mL vask medium og holde røret på is.
- Hjernen vev isolasjon fra forskjellige hjernen regioner
- Ofre 16-19 dag gammel gravid kvinne mus med standard euthanization-protokoller ved å plassere mus i et ikke-ventilasjon bur og deretter berusende med CO2. E15.5 ~ E16.5 embryo anbefales for hypothalamus neuronal kultur og E16.5 ~ E17.5 er mer egnet for hippocampus og kortikale neuronal kultur.
- Sterilisere plattform, dissecting mikroskop og kirurgi verktøy med 75% etanol å unngå forurensning.
- Kuttet rundt navlestreng området (mørk røde området, figur 1A, 1B dash-linje) for å isolere pups lett uten å skade dem (figur 1 c, 1 D).
- Fjern hodet delen på hver valp med en saks (figur 1E, F), så sikre hodet delen i stedet bruker tynn rett tang for øye regionen (figur 1G). Bruk en tynn buet pinsett for å fjerne ytre huden og kraniet to sider og løsner dem fra det fremre dorsal retning (figur 1 H, svarte pilen peker i retning). Hjernen skal isoleres uten skade (figur 1I).
Merk: Det er viktig å opprettholde integriteten til hjernen for å sikre nøyaktighet når isolere regioner av hjernen. - Holde isolert hjernen i en ren Petriskål med iskald vask medium for følgende.
- Flip hjernen og holde på ventral side. Hypothalamus er en runde struktur i hjernen (figur 1J, pilen peker til hypothalamus-regionen). Isolere hypothalamus vevet med tynn buet tang. Fjerne meninges (som har en gulaktig-rød farge) nøye.
FORSIKTIG: Fullstendig fjerning av meninges er et kritisk steg til unngå fibroblast forurensning. - Hold olfactory lobe med skarpe tang og løsner tynn meninges omgir hele hjernen med buet tang (figur 1 K, L).
- Hippocampus er en banan-aktig figur som er innebygd i nedre del av cortex. Bla til undersiden av cortex og skille hippocampus fra cortex ved å dra den til siden med buet tang (figur 1 MN, og O). Vær sikker på fjerne alle resterende meninges omgir hjernevev.
- Når alle regioner av hjernen har vært isolert, hogge disse vev i 15 mL rørene som inneholder iskald vask medium ved hjelp av pinsett (trinn 1.1.5).
Merk: Hjernen vev kan holdes i iskalde vask medium for 2-3 h.
- Vev fordøyelsen, plating og kultur
- Skyll vev ved å snu vev inneholder 15 mL tube 2 - 3 ganger, og deretter holde røret rett å tillate vev å slå seg ned (1-3 min).
- Fjerne øvre mediet bruker glass Pasteur pipette knyttet til et system. For å vaske vevet, legger 15 mL isen kalde vask medium og invertere røret 2 - 3 ganger. Gjenta vask 3 ganger før neste trinn.
FORSIKTIG: Vær forsiktig av vev på bunnen når øvre mediet bruker et system. - Etter siste vask, fjerne vask mediet med hjelp av en 1 mL pipette.
- Inkuber vev med Papain-Trypsin fordøyelsen buffer (tabell 1) i en 37 ° C vannbad i 7-14 min. riste rør hver to minutter å sikre alle vev er riktig eksponert for fordøyelsen bufferen.
Merk: Inkubasjonstiden og volumet av fordøyelsen bufferen kan bli justert basert på vev størrelsen. Hypothalamus vev fra 6-8 pups, anbefales 300 µL Papain-Trypsin fordøyelsen buffer og 7 min incubation tid. Flere vev vil kreve mer fordøyelsen buffer. - Nøytralisere den enzym aktivitet ved å legge til 1-volum av fetal bovin serum. Riste reagensglasset 3 - 5 ganger ved romtemperatur.
- Holde røret på stativer og vente på 1-2 min tillate vev å slå seg ned; fjerne nedbryting med en 1 mL pipette.
- Legge til 6 mL plating medium (tabell 1) i reagensglasset og Pipetter vevet opp 50 ganger med en 5 mL Pipetter forsiktig (for en 6-vel plate, 1,5 mL plating medium per brønn anbefales). De fleste cellene vil oppheve tilknytningen til enkeltceller etter gjentatte pipettering.
Merk: Prøv å unngå dannelse av bobler mens gjennomfører dette trinnet. De fleste laboratorier bruk flammet glass beite Pipetter for flergangsbruk for å distansere vevet. En 5 mL pipette med smale tips kan være et godt alternativ for dette trinnet. - Holde et rør på stativet og vent 1-2 min tillate tykk, un dissosiert vev å slå seg ned. Ta den øvre fase som inneholder dissosiert cellene til en ny tube og fortynn med plating medium (5 x volum plating medium per 1 x volum dissosiert celler. For eksempel legge 5 mL plating medium for 1 mL dissosiert celler).
- Beregne celle tettheten ved hjelp av en hemocytometer og frø antall celler i kultur plate belagt med poly-D-lysine som i trinn 1.1.1. Vi anbefaler 2-4 x 105 celler per brønn for en 6 vel rett/35 mm rett ble anbefalt for Nevron imaging studier. En høyere tetthet ville være nødvendig for protein innsamling og analyse.
Merk: Ikke Legg for mye plating medium, 1-1,5 mL plating medium i en 6-vel rett er tilstrekkelig for vedlegg. Mye middels vil forlenge tiden det tar for riktig celle vedlegg. - Vente 2-3 h og sjekk seeded neurons under mikroskopet. Neurons begynner å vokse nevritt når de legger riktig.
- Fjern plating mediet og legge 2 mL varmet vask medium (37 ° C) i retten til å vaske av plating medium. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Legge til 2 mL fullstendig kultur medium (tabell 1) i hver brønn i 6-vel parabolen.
- Endre halvparten av mediet hver 3-4 dager. Forberede komplett mediet fersk hver gang. Neurons kultivert fra annen mus hjernen regioner har forskjellige morfologi og egenskaper (figur 2).
2. hva av plasmider DNA i primære Nevron med Liposome System
FORSIKTIG: En endotoxin-fri plasmider DNA rensing kit (Materialer tabell) anbefales For Nevron transfection, for DNA forberedelse. Ekstra etanol nedbør kan fjerne overflødig løsemiddel og forbedrer DNA konsentrasjon.
-
Liposome-baserte DNA transfection i primære neurons.
Merk: Hva tiden avhenger av statusen modning i eksperimenter. Hypothalamus nevroner var transfekterte på DIV 7-10 (DIV, dager i vitro).- DNA: Liposome blanding forberedelse: fortynne GFP-GLUT4 plasmider DNA16 (2 µg) i et microcentrifuge rør med 300 µL lav serum kultur medium. Forberede en annen microcentrifuge rør med 2 µL liposome 300 µL lav serum kultur medium, og ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
- Kombinere innholdet i begge rør og ruge i 20-30 min ved romtemperatur.
- Fjern Nevron kultur medium fra kultur parabolen. Legg 600 µL DNA-liposome blandingen i hver brønn og ruge på 37 ° C for 4-6 h.
- Etter 4-6 h, Fjern DNA-liposome blanding og tilsett 2 mL kultur medium.
- Fluorescerende signaler, for eksempel GFP alene og GLUT4 protein konjugert med GFP koden (Figur 3 og Figur 4), kan observeres etter 18-72 h.
3. levende bilde opptak
-
Forberede celler for Live bildebehandling
- Kultur WT og CCR5- / - hypothalamus Nevron celler uttrykke grønne fluorescens protein kalt glukose transportør 4 (GFP-GLUT4) på #1.5 (eller 0,17 mm tykkelse) glass dekkglassvæske som har vært pre-belagt med poly-D-lysin i trinn 1.1.1 6-brønnen plate.
- Nøye fjerne coverslips med neurons ved hjelp av pinsett og sett den på glass lysbilder med forsiktighet.
- Fjern overflødig medium og væske med delikate oppgaven kluter. Brett kluter to ganger, og forsiktig plassere dem over på dekkglassvæske. Trykk forsiktig ned kluter uten å flytte dekkglassvæske.
FORSIKTIG: Ikke trykk dekkglassvæske mot av objektglass kraftig. Formålet med dette trinnet er å sikre at den dekkglassvæske ikke flytte/drift under bildeopptak skyldes høy styrke. - Plass coverslips og lysbilder på deconvolution mikroskop scenen, med dekkglassvæske vendt ned og sikret skikkelig. Dette trinnet er å sikre at lysbildet stillingen forblir konstant slik at brukere kan spore det samme settet av målcellene senere.
- Observere WT og CCR5- / - hypothalamus Nevron celler med en 60 x / 1,42 NA olje nedsenking linsen.
- Behandle merkede cellen prøvene med CCL5 (10 ng/mL) eller insulinresistens (10 U/mL) for en min. legge 1.5 µL av utvannet insulin på kanten av dekkglassvæske.
- Visualisere og registrere merkede cellen prøvene umiddelbart. Programmet videoopptak programvaren til posten i 30 min.
-
Deconvolution mikroskopi og analyse
Merk: Denne delen av protokollen krever bruk av en deconvolution mikroskop og spesialisert programvare for analyse.- Slå på strømmen av tenkelig system, tillate mikroskop scenen for å starte riktig, og deretter slå på LED-lyskilde.
- Legge til neddyppingsolje (brytningsindeks 1.520 for live prøver på 37 ° C) på en 60 x 1.42 NA linsen. Plasser prøven lysbildet på mikroskopet med dekkglassvæske vender mot linsen, og sikre lysbildet riktig.
- Bruk lyse-feltet eller fluorescens belysning for å identifisere målet celler. Juster fokus til målcellene klart kan observeres. Ikke Flytt linsen utenfor området dekkglassvæske å unngå unødvendige klore merker.
- Identifisere grønn fluorescens protein konjugert glukose Transporter 4 (GFP-GLUT4) av GFP signalet. Identifisere ønsket målcellene for bildeopptak. Valgte målet cellen posisjon kan lagres for fremtidig referanse (Figur 4).
- Oppsett riktige eksperimentelle parametere (inkludert antallet piksler, eksitasjon bølgelengde, overføring prosent, eksponeringstid, stabel tykkelse, tidsintervall og tenkelig totaltiden) på hver målcellen. For dette eksperimentet, ble hvor bildet pixel satt på 512 x 512 (det kan settes på 1024 x 1024 for høyere oppløsning) for GFP signaler. Eksponeringstid ble satt mellom 0.025 til 0,05 s for hver 5 min. mindre lateral x, y og z justeringer kan kontrolleres av anbefalte (materialer tabell).
- Sett parameteren eksponering til ca 2000 til 3000 teller å oppnå maksimal pixel intensitet. For å minimere fluorescens photobleaching, redusere prosentandelen av eksitasjon lystransmisjon så mye som mulig mens holde eksponering tiden mindre enn 1 s. Gjenta denne fremgangsmåten for hver ekstra fluorescens kanalen eller og hvert enkelt område av interesse.
- Angi øvre og nedre grensen av Z-stabelen på hver målcellen. Dette kan oppnås ved å flytte mikroskop scenen til toppen og bunnen av cellen er litt ute av fokus. Brukerne kan justere oppløsningen på z-aksen ved å angi antall bilder mellom den øvre og nedre grensen (som kan gjøres ved å angi avstanden mellom hvert bilde).
- Stabler av bildene var deconvolved og senere analysert ved hjelp av de respektive programvaren-hastighet fra PerkinElmer i dette tilfellet.
Representative Results
Hypothalamus nevroner kultivert fra mus ble ytterligere identifisert ved immunostaining med hypothalamus bestemt protein - pro-opiomelanocortin (POMC) antistoffer og neuronal markør - microtubule-assosiert protein 2 (MAP2) (figur 2A). Vi bekreftet de primære kulturperler hypothalamus nevroner uttrykt hypothalamus protein POMC. Uttrykket CCR5 reseptor og CCL5 i hypothalamus nevroner ble identifisert med spesifikke antistoffer og co merket med POMC antistoff (figur 2A, 2B).
Etter 3 dager for dyrking, nerveceller var transfekterte med GFP DNA (Figur 3) eller GFP konjugert GLUT4 (Figur 4). GFP uttrykk kan vanligvis finnes over cellen uten et bestemt mønster (Figur 3), men GLUT4-GFP vil uttrykke som en vises punctate-lignende struktur i stoffer (Figur 4). Hva kit brukt i denne studien er ikke den mest effektive metoden for Nevron transfection; Det er imidlertid en mindre strenge metode for bedre celle overlevelse etter hva, som bidrar til bedre live-celle bildebehandling/opptak senere. Bilder av GFP-GLUT4 uttrykke neurons ble tatt før time-lapse filmer (figur 4A-B, utfyllende video 1, 2) på insulin stimulering eller CCL5 stimulering (figur 4C, utfyllende video 3). Signalene fra GFP og GFP-GLUT4 er klare og sterke i neurons.
Hypothalamus nevroner med GLUT4-GFP hva ble ytterligere behandlet med insulin (40 U) å karakterisere GFP-GLUT4 handel. Reprehensive videoer av GLUT4-GFP bevegelse på insulin stimulering i både WT og CCR5- / - hypothalamus nevroner vises som Video 1 og Video 2, henholdsvis.
Figur 1: isolering av vev fra ulike regioner av hjernen musen på embryonale scenen (dag 16,5). (A-D) Trinnene involvert i separasjon av pups fra morkaken. (E, F) Disseksjon av en pup hode fra kroppen. (G-jeg) Trinnene involvert i isolasjon av hele hjernen fra skallen. Svarte pilen peker i retning for å bli trukket under fjerning skallen ved hjelp av pinsett. (J) isolering av hypothalamus. Den svarte pilen peker på hypothalamus regionen mellom tang. (K-L) Isolering av cortex av hjernen musen. Svart stjernen angir kortikale regionen musen hjernen og hvite pilen peker separasjon av cortex fra hele hjernen. (M-O) Separasjon av delen hippocampus fra cortex. Øvre hvite pilen markerer hippocampus vevet og lavere hvite pilen markerer kortikale vevet. Skalere barer = 1 cm (A-F), 200 µm (G-O). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: karakterisering av hypothalamus neuronal merke - POMC og co uttrykk for CCL5 og CCR5. (A) primære kulturperler hypothalamus nevroner ble merket med hypothalamus neuronal merket - (rød) POMC, co uttrykk for CCR5 (grønn) og Nevron markør MAP2 (grå). (B) CCL5 (grønn) uttrykk i (rød) POMC positiv hypothalamus nevroner (tilpasset fra utfyllende data referanse17). Her merket DAPI kjernen i blått. Skalere barer = 50 µm i (A) og (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: GFP protein uttrykk i mus primære neurons. GFP plasmider DNA transfekterte i primære kulturperler neurons etter 4 dager kultur (DIV4) med liposome og uttrykt for 3 dager (DIV7). (A-B) GFP uttrykkes i både nevritt og soma. (C-D) Neurons med uekte transfection; DAPI merket kjernen i (B, D). Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: bilder av GFP-GLUT4 i hypothalamus nevroner. (A, C) GFP-GLUT4 protein uttrykk i Wildtype (WT) hypothalamus nevroner og (B) CCR5- / - hypothalamus nevroner. Neurons ble stimulert med insulin (A, B) eller CCL5 (C). Pilene peker på GFP-GLUT4 vises punctate i nevritt før (-) og etter (+) insulin eller CCL5 stimulering og stjerner pek på overflaten GLUT4-GFP før (-) og etter (+) CCL5 stimuleringC. (Figur tilpasset referanse17). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 5 x Borade Buffer | Selskapet | Katalognummer | Volum |
| Borsyre | Sigma Aldrich | B6768 | 1.55 g |
| Boraks | Sigma Aldrich | 71997 | 2.375 g |
| ddH2O | 100 mL | ||
| Filtrert, holde på 4 ° C | |||
| 20 x Poly-D-Lysine lager | Selskapet | Katalognummer | Volum |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | 100 mg |
| ddH2O | 100 mL | ||
| Filtrert, holde på 20 ° C | |||
| 1 x Poly-D-Lysine | Volum | ||
| 20 x Poly-D-Lysine | 5 mL | ||
| 5 x Borade Buffer | 20 mL | ||
| ddH2O | 75 mL | ||
| Totalt | 100 mL | ||
| Holde på 4 ° C | |||
| Vask Medium | Selskapet | Katalognummer | Volum |
| DMEM-høy glukose | Gibco | 12800-017 | 495 mL |
| Antibiotika-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 5 mL |
| Totalt | 500 mL | ||
| Holde på 4° C | |||
| Papain-Trypsin fordøyelsen buffer: | Selskapet | Katalognummer | Volum/Final konsentrasjon |
| Papain (10 mg/mL) | Sigma Aldrich | P4762 | 200 µL (2 mg/mL) |
| Trypsin-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200-072 | 200 ΜL (0,05%) |
| Vask Medium | 600 ΜL | ||
| Totalt | 1000 ΜL | ||
| Holde på 20 ° C | |||
| Plating middels: | Selskapet | Katalognummer | Volum |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | 176 mL |
| Fosterets bovin Serum | Gibco | 10437-028 | 20 mL |
| L-glutamat (200 mM) | Gibco | 25030 | 2 mL |
| Antibiotika-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 2 mL |
| Totalt | 200 mL | ||
| Holde på 4 ° C | |||
| Komplett kultur medium | Selskapet | Katalognummer | Volum |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | 95 mL |
| N2 supplement (100 x) | Gibco | 17502-048 | 1 mL |
| B27 supplement (50 x) | Gibco | 17504-04 | 2 mL |
| L-glutamat (200 mM) | Gibco | 25030 | 1 mL |
| Antibiotika-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 1 mL |
| Totalt | 100 mL | ||
| Nylagde |
Tabell 1: Fordøyelse buffer og media komposisjon brukt i denne studien.
Supplerende Video 1: Insulin stimulert GFP-GLUT4 bevegelse i WT hypothalamus nevroner. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende Video 2: Insulin stimulert GFP-GLUT4 bevegelse i CCR5- / - hypothalamus nevroner. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende Video 3: CCL5 stimulert GFP-GLUT4 bevegelse i WT hypothalamus nevroner (Video tilpasset referanse17). Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Evnen å dataskjerm lever celler, på CCL5 eller insulinresistens stimulering, er kritisk viktig for å studere rask effekten av CCL5 eller insulin på GLUT4 bevegelse. Faktisk tillater det oss å visualisere betydelig forskjellen mellom WT og CCR5- / - hypothalamus nevroner på insulin stimulering. Vi har utført overflaten merkingen av endogene GLUT4 protein i WT og CCR5- / - hypothalamus nevroner på ulike tidspunkt etter insulin stimulering17. Merking av celle overflaten proteiner krever høy spesifisitet antistoff med lav bakgrunn. I tillegg kan overflate fluorescens kvantifisering også være utfordrende og tidkrevende. Dermed tid-lapse innspillingen tillater oss å være sikker på at effekten av CCL5 eller insulin er en sann fysiologisk forandring basert på eksperimentelle forhold, i stedet for en statistiske variasjonen. Sammen med overflaten merking av endogene GLUT4, gir vi sterke bevis og eksperimenter for å demonstrere hvordan CCL5 og CCR5 delta i GLUT4 translokasjon og insulin signalering.
I moderne cellebiologi og molekylærbiologi studier krever mange eksperimenter bruken av fluorescens mikroskopi. Denne teknologien tillater forskere å visualisere romlige forholdet mellom proteiner og/eller cellular organeller, i tillegg til bevegelsesretning og hastighet, stimulerende effekter, morfologiske endringer og protein menneskehandel. Denne teknologien har imidlertid fortsatt sin begrensning: Når fluorophores er opphisset, signaler slippes ut fra målet protein (eller området) kan bli overveldet av bakgrunnen fluorescens. Resultatet kan fluorescens bilder vises uklart med forventet signaler begravd dypt inn i bakgrunnen signaler. Dette fenomenet er spesielt tydelig for observasjon av membran-bundet proteiner.
Total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM) ble utviklet for å overkomme dette problemet. Det tillater forskere å visualisere magnetisering av valgte overflaten-bundet fluorophores uten å påvirke bakgrunnen fluorophores. Det tillater forskere å selektivt karakterisere funksjonene og hendelser på en svært tynn overflaten regionen som en plasma membran. Deconvolution mikroskopi er en beregningsmessig intensiv bildebehandling teknikk som er gjort mulig ved hjelp av teknologiske fremskritt de siste årene. Det har vært ofte benyttet for å forbedre digitale fluorescens bildeoppløsning. Som nevnt tidligere, når fluorophores er å bli begeistret av alle typer belysning (som laser eller LED), vil alle fluorophores avgir signaler uansett om de er i fokus eller ikke, så bildet vil alltid vises uklare. Dette sløret skyldes et fenomen som kalles "Punkt spredning funksjon" (PSF), som lys kommer fra en liten fluorescerende kilde (lyspunkt) vil spredt videre og bli uskarpt (blur). Denne hendelsen vil produsere et timeglass-lignende formet fluorescerende signal i prinsippet, og et fluorescens bilde kan være laget av mange slike signaler. Deconvolution prosessen kan tilordne alle fluorescens signaler til sin opprinnelige lyse spot form, og eliminere de fleste av ut-av-fokus lyset å forbedre kontrasten i bildet.
De siste årene, har deconvolution algoritmer generert bilder med tilsvarende oppløsning for AC confocal mikroskop. Dessuten, med TIRFM, som hindrer ut-av-fokus uskarphet blir oppdaget av en begrenset eksitasjon region, wide-field mikroskopi lar alt lys signaler kan oppdages, og fordeler dem tilbake til kilden gjennom deconvolution prosessen. Derfor, i praksis deconvolution mikroskopi har blitt ikke bare en mer effektiv image oppkjøpet metode, men også en mer kostnadseffektiv metode sammenlignet med TIRF mikroskopi.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for tilskudd gitt av departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan - MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) og helse og velferd tillegg av tobakksvarer - MOHW106-TDU-B-212-144001 til S-Y C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
| SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
| VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
| Insulin | Actrapid, Denmark | ||
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
| GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
| Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
| CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
| 12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
| micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
| curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
| 5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |
References
- Levin, B. E., Sherwin, R. S. Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter? J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).
- Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., Kahn, C. R. Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function. Diabetes. 63 (7), 2232-2243 (2014).
- Duarte, A. I., Moreira, P. I., Oliveira, C. R. Insulin in central nervous system: more than just a peripheral hormone. J Aging Res. 2012, 384017 (2012).
- Vogt, M. C., Bruning, J. C. CNS insulin signaling in the control of energy homeostasis and glucose metabolism - from embryo to old age. Trends Endocrinol Metab. 24 (2), 76-84 (2013).
- Plum, L., Schubert, M., Bruning, J. C. The role of insulin receptor signaling in the brain. Trends Endocrinol Metab. 16 (2), 59-65 (2005).
- Lin, X., et al. Dysregulation of insulin receptor substrate 2 in beta cells and brain causes obesity and diabetes. J Clin Invest. 114 (7), 908-916 (2004).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. J Biol Chem. 279 (34), 35298-35305 (2004).
- Thaler, J. P., Guyenet, S. J., Dorfman, M. D., Wisse, B. E., Schwartz, M. W. Hypothalamic inflammation: marker or mechanism of obesity pathogenesis? Diabetes. 62 (8), 2629-2634 (2013).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61 (6), 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Exp Diabetes Res. 2012, 847246 (2012).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61 (7), 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (7), E897-E906 (2013).
- Chan, O., Burke, J. D., Gao, D. F., Fish, E. N. The chemokine CCL5 regulates glucose uptake and AMP kinase signaling in activated T cells to facilitate chemotaxis. J Biol Chem. 287 (35), 29406-29416 (2012).
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266 (5 Pt 2), R1711-R1715 (1994).
- Mayer, C. M., Fick, L. J., Gingerich, S., Belsham, D. D. Hypothalamic cell lines to investigate neuroendocrine control mechanisms. Front Neuroendocrinol. 30 (3), 405-423 (2009).
- Lizunov, V. A., et al. Insulin stimulates fusion, but not tethering, of GLUT4 vesicles in skeletal muscle of HA-GLUT4-GFP transgenic mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (8), E950-E960 (2012).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
