Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik für die Beobachtung von Echtzeit-grüne Fluoreszenz Protein (GFP) Glucose Transporter 4 (GLUT4) Protein Menschenhandel auf Insulin-Stimulation und Charakterisierung der biologischen Rolle der CCR5 in Insulin-GLUT4 markiert Signalweg mit Dekonvolution Mikroskopie.
Abstract
Diabetes Mellitus Typ 2 (T2DM) ist ein globaler Gesundheitskrise charakterisiert durch Insulin Signalisierung Beeinträchtigung und chronische Entzündungen in peripheren Geweben. Der Hypothalamus in das zentrale Nervensystem (ZNS) ist die Schaltzentrale für Energie und Insulin-Signal-Antwort-Verordnung. Chronischer Entzündung in peripheren Geweben und Ungleichgewichte von bestimmten Chemokinen (z. B. CCL5, TNF und IL-6) dazu beitragen, Diabetes und Fettleibigkeit. Allerdings sind die funktionale Mechanismen, die Verbindung von Chemokinen und Hypothalamus Insulin Signal Verordnung noch unklar.
In-vitro- primäre Neuron Kultur Modelle sind bequem und einfach einsetzbare Insulin-Signal-Verordnung im Hypothalamus Neuronen zu untersuchen. In dieser Studie haben wir exogene GLUT4 Protein konjugiert mit GFP (GFP-GLUT4) in primäre hypothalamische Neurone, GLUT4 Membran Translokation nach Insulin-Stimulation zu verfolgen. Zeitraffer-Bilder der GLP-GLUT4 Protein Menschenhandel verzeichneten Dekonvolution Mikroskopie, die Benutzern erlaubte, High-Speed, hochauflösende Bilder zu erzeugen, ohne Beschädigung der Neuronen deutlich während der Durchführung des Experiments. Der Beitrag des CCR5 in Insulin reguliert GLUT4-Translokation verzeichneten CCR5 mangelhaft Hypothalamus Neuronen, die isoliert und von CCR5-Knockout-Mäusen gezüchtet wurden. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die GLUT4 Membran Translokation Effizienz nach Insulin-Stimulation in CCR5 mangelhaft Hypothalamus Neuronen reduziert wurde.
Introduction
Diabetes Mellitus Typ 2 (T2DM) ist ein globaler Gesundheitskrise. T2DM zeichnet sich durch Insulin Signalisierung Beeinträchtigung und chronische Entzündungen in peripheren Geweben. Der Hypothalamus ist das Control Center, das Energiehomöostase, Appetit und Biorhythmus des Körpers reguliert. Am wichtigsten ist, vermittelt der Hypothalamus auch Insulin Signal Reaktionsfähigkeit um systemische Stoffwechsel1,2,3,4,5zu regulieren. Störung der Hypothalamus Insulins Signalisierung, dass Weg Insulin Resistenz6,7führen könnte. Der Hypothalamus koordiniert zelluläre Energiezustand und Sekretion von Hormonen wie Insulin und Adipokine (z.B. Leptin) aus den peripheren Geweben, systemische Glukosestoffwechsel, Insulin Reaktionsfähigkeit und Nahrungsaufnahme regulieren. Bindung von Insulin an den Insulinrezeptor aktiviert Insulin Rezeptor Substrat (IRS) Proteine, die dann Insulin nachgelagerten Signalmoleküle, wie z. B. PI3K aktivieren (Phosphatidylinositol-3-Kinase) und AKT (Proteinkinase B (PKB/AKT)), induzieren GLUT4 Membran-Translokation. Neuronen sind nicht das große Ziel für die Glukoseaufnahme in Reaktion auf Insulin; jedoch wurden bedeutende Niveaus der GLUT4 Ausdruck im Bereich Hypothalamus Arcuate Kern (ARC) identifiziert. Daher kann die Regulierung der GLUT4 im Hypothalamus Neuronen in Insulin Signalisierung in der Gehirn-Peripheriegerät Achse eine wichtige Rolle spielen.
Viele Studien haben vorgeschlagen, dass chronische Entzündungen und entzündlichen Chemokine im Hypothalamus auch eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Diabetes und Fettleibigkeit spielen, und Hemmung der Hypothalamus Entzündung Diät-induzierten Insulinresistenz umkehren können 8 , 9 , 10. Außerdem, Chemokin-CCL5 (C-C Motif Ligand 5, auch bekannt als RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) und seinen Rezeptor CCR5-Ebenen auch mit der Entwicklung des T2DM11,12korrelieren. Die Rollen von CCL5 und CCR5 in Insulin-Funktion und Glukose-Stoffwechsel sind noch unklar. Eine Studie berichtet, dass CCR5-Mangel von Fettleibigkeit bedingte Entzündung, Makrophagen Rekrutierung und Insulin-Resistenz-11Mäusen geschützt; eine weitere Studie zufolge dagegen CCR5-Mangel systemische Glukosetoleranz sowie Adipocyte und Muskel Insulin Signalisierung12beeinträchtigt. CCL5 findet Glukoseaufnahme in T-Zellen zu erhöhen und Nahrungsaufnahme durch seine Wirkung auf den Hypothalamus13,14, jedoch sowohl der Wirkmechanismus zu reduzieren und die Rezeptoren beteiligt sind noch nicht identifiziert werden.
Es ist schwierig, die zellulären Mechanismen, die die Wirkung der peripheren Gewebe Entzündungen auf Insulin im Hypothalamus Neuronen funktionieren zu studieren. Dies ist aufgrund der zellulären Heterogenität und Neuron Schaltung Feedback Vorschriften. Aus diesem Grund bietet eine in-vitro- Kultur Zellmodell ein sauberes Modell um die Auswirkungen der Chemokin auf Hypothalamus Insulin Signal Verordnung zu untersuchen. Zwar es viele verewigt Hypothalamus neuronalen Zelllinien für Forschungszwecke hergestellt gibt, diese Zelllinien ausgedrückt verschiedene Markierungen und stellen daher verschiedene Arten von Hypothalamus Neuronen15. Obwohl Hypothalamus Primärkulturen schwer zu pflegen sein können, sie bieten die realistischste Reaktion des Hypothalamus Neuronen nach Insulin-Stimulation, und können auch das Potenzial, die unbekannte Effekte die kommen zu spielen, bei der Pflege der Zellen vermeiden langfristig in Kulturmedium mit künstlichen Wachstumsfaktoren.
Hierin, wir nutzen primäre hypothalamische Neurone von C57BL/6 Wildtyp (WT) Maus und CCR5 Ko (CCR5- / -) Maus, und beide Arten von Zellen mit GFP-GLUT4 Konstrukt transfizieren. Um den Beitrag der CCR5 Insulin vermittelte GLUT4 Membran Opfer des Menschenhandels zu untersuchen, wurden die GFP-GLUT4 transfiziert Neuronen mit Insulin oder rekombinante CCL5 behandelt. Dann zeichnen wir die Bewegung der GFP-GLUT4 an die Plasmamembran in primäre hypothalamische Neurone mit Dekonvolution Mikroskopie.
Protocol
Alle Protokolle und Methoden der tierische Themen von institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschüsse (IACUC) von Taipei Medical University genehmigt worden (Protokoll Zahlen: LAC-2013-0278; LAC-2015-0397)
1. primäre Neuron Kultur
- Vorbereitung vor der Kultur
- Bestreichen Sie die Kultur-Gerichte mit Poly-D-Lysin (Tabelle 1) Kultur am Vortag. Fügen Sie für ein 6-Well-Gericht 1,5 mL Poly-D-Lysin (0,05 mg/mL hinzu) in jede Vertiefung. Für live-Imaging, Zellkulturen auf einem 12 x 12 mm Deckgläschen in einem standard beschichteten 6-Well-Platte.
- Entfernen/Recycling Poly-D-Lysin und den Abwasch zweimal mit 2 mL DdH2O.
- Die chirurgischen Werkzeuge: ein paar Mikro sezieren Scheren, gebogene Spitze Pinzette und standard geraden spitzen Pinzette. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente und halten sie in 75 % Ethanol während der Operation.
- Füllen Sie 10 cm Petrischalen mit 20 mL waschen Medium (Tabelle 1) und halten Sie auf dem Eis.
- Füllen Sie eine 15 mL Teströhrchen mit 15 mL waschen Medium und halten Sie das Rohr auf dem Eis.
- Gehirn Gewebe isoliert von anderen Hirnregionen
- 16-19 Tage alten schwangeren weiblichen Mäusen mit standard Euthanization Protokolle zu opfern, indem man Mäuse in einem unbelüfteten Käfig und dann mit CO2berauschend. E15.5 ~ E16.5 Embryonen sind empfohlen für Hypothalamus neuronalen Kultur und E16.5 ~ E17.5 eignen sich eher für hippocampal und kortikale neuronale Kultur.
- Sterilisieren Sie die Plattform, sezierenden Mikroskop und Chirurgie-Instrumente mit 75 % Ethanol um Verunreinigungen zu vermeiden.
- Rund um den Bereich der Nabelschnur (dunkle rote Fläche, Figur 1A, 1 b gestrichelte Linie), um die Welpen zu isolieren geschnitten Sie bequem ohne Beschädigung (Abbildung 1, 1D).
- Entfernen Sie das Kopfteil jeder Welpe mit der Schere (Abb. 1E, F), dann sichern Sie das Kopfteil mit der feinen Spitze gerade Zange für die Augenpartie (Abbildung 1). Verwenden Sie einen anderen schönen gekippt gebogenen Pinzette zum Entfernen der äußeren Haut und Schädel von zwei Seiten und schälen sich aus der vorderen dorsalen Richtung (Abbildung 1 H, schwarzer Pfeil zeigt in die Richtung). Das Gehirn muss ohne Schaden (Abbildung 1I) isoliert werden.
Hinweis: Es ist wichtig, die Integrität des Gehirns, um Genauigkeit zu gewährleisten, wenn Sie verschiedene Regionen des Gehirns zu isolieren. - Halten Sie isolierte Gehirn in einer sauberen Petrischale mit eiskalten waschen Medium für die folgenden Schritte.
- Drehen Sie das Gehirn und halten Sie der Bauchseite mit. Der Hypothalamus ist eine Runde Struktur in der Mitte des Gehirns (Abbildung 1J, Pfeil zeigt auf den Hypothalamus Region). Der Hypothalamus Gewebe mit feinen Spitzen gebogenen Pinzette zu isolieren. Entfernen Sie die Hirnhaut (die eine gelblich-rote Farbe) sorgfältig.
Achtung: Vollständige Entfernung der Hirnhaut ist ein entscheidender Schritt zur Vermeidung von Kontaminationen Fibroblasten. - Der olfaktorischen Lappen mit der scharfen Zange halten und die dünne Hirnhaut rund um das ganze Gehirn mit den gebogenen Pinzette (Abbildung 1 K, L) abziehen.
- Der Hippocampus ist eine Banane-ähnliche Form, die im unteren Teil des Kortex eingebettet ist. Drehen Sie an der Unterseite des Kortex und trennen Sie Hippocampus aus der Rinde zu, ziehen sie auf die Seite mit den gebogenen Pinzette (Abbildung 1 MN und O). Achten Sie darauf, alle übrigen Hirnhaut rund um das Hirngewebe zu entfernen.
- Wenn alle Regionen des Gehirns isoliert wurden, hacken Sie diese Gewebe in der 15 mL Röhrchen mit eiskalten waschen Medium mit Hilfe der Zange (Schritt 1.1.5).
Hinweis: Hirngewebe können im eiskalten waschen Medium für 2-3 h gehalten werden.
- Gewebe-Verdauung, Beschichtung und Kultur
- Spülen Sie das Gewebe durch Umkehrung der Gewebe-haltigen 15 mL Tube 2 - 3 Mal, und dann halten Sie das Rohr gerade um das Gewebe zu beruhigen (1-3 min.) zu ermöglichen.
- Entfernen der oberen Medium mit dem Glas Pasteurpipette an einem Vakuumsystem. Um das Gewebe zu waschen, 15 mL Eis Kaltwäsche Medium hinzufügen und das Rohr 2-3 Mal zu invertieren. Wiederholen Sie die Schritte der Wäsche 3 Mal vor dem nächsten Schritt fort.
Achtung: Vorsicht vor der Gewebe an der Unterseite beim Entfernen der oberen Medium mit Hilfe eines Vakuum-Systems. - Entfernen Sie nach der letzten Wäsche waschen Medium mit Hilfe von einer 1-mL-Pipette.
- Inkubieren Sie Gewebe mit Papain-Trypsin-Verdauung-Puffer (Tabelle 1) in einem 37 ° C Wasserbad für 7-14 min. schütteln die Röhren alle zwei Minuten zu allen Geweben zu gewährleisten sind auf den Puffer, Verdauung richtig belichtet.
Hinweis: Inkubationszeit und das Volumen der Verdauung Puffer können basierend auf der Gewebe-Größe angepasst werden. Für Hypothalamus Gewebe 6-8 Welpen abgeholt empfiehlt 300 µL Papain-Trypsin Puffer und 7 min Inkubation Aufschlusszeit. Mehr Gewebe erfordert mehr Verdauung Puffer. - Neutralisieren Sie die Enzymaktivität durch Zugabe von 1 Volumen des fötalen Rinderserum. Schütteln Sie das Reagenzglas 3-5mal bei Raumtemperatur.
- Halten Sie das Rohr auf Gestellen und warten Sie 1-2 min um das Gewebe zu beruhigen zu ermöglichen; den Überstand vorsichtig mit einer 1-mL-Pipette zu entfernen.
- Fügen Sie 6 mL Beschichtung Medium (Tabelle 1) in das Reagenzglas und Pipettieren wechselvollen Gewebe 50 Mal mit einer 5-mL-Pipette vorsichtig (für eine 6-Well-Platte, 1,5 mL Beschichtung Medium pro Bohrloch wird empfohlen). Die meisten Zellen werden in Einzelzellen nach wiederholten Pipettieren distanzieren.
Hinweis: Versuchen Sie, die Bildung von Luftblasen während der Durchführung dieser Schritt zu vermeiden. Die meisten Labors verwenden flambierte Glas Weide Mehrkanalpipette um das Gewebe zu distanzieren. Eine 5-mL-Pipette mit einer schmalen Spitze kann eine gute Alternative für diesen Schritt. - Halten Sie ein Rohr auf der Folterbank und warten Sie 1-2 min erlauben die klobigen, Un-dissoziierten Gewebe zu beruhigen. Nehmen Sie die obere Phase mit Zellen zu einem neuen Schlauch getrennt und verdünnen mit Beschichtung Mittel (5 x Volumen Beschichtung Medium pro 1 X Volumen der dissoziierten Zellen. Beispielsweise fügen Sie 5 mL Medium für 1 mL dissoziiert Zellen Beschichtung).
- Berechnen Sie die Zelldichte mit einem Hemocytometer und Samen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen in der Kultur-Platte mit Poly-D-Lysin wie in Schritt 1.1.1 beschichtet. Wir empfehlen 2-4 x 105 Zellen pro Bohrloch für eine 6 gut Gericht/35-Millimeter-Teller für Neuron Bildgebungsstudien empfohlen wurden. Eine höhere Dichte würde für Protein-Sammlung und Analyse benötigt werden.
Hinweis: Fügen Sie zuviel Beschichtung Medium, 1-1,5 mL Beschichtung Medium in einem 6-Well Schale ist ausreichend für die Befestigung. Eine übermäßige Menge des Mediums wird den Zeitaufwand für die richtige Zelle Befestigung verlängern. - 2-3 h warten Sie und überprüfen Sie die gesäten Neuronen unter die Lupe genommen. Neuronen startet, Neuritis zu wachsen, wenn sie richtig zuordnen.
- Entfernen Sie der Beschichtung Mittel und fügen Sie 2 mL warm waschen Medium (37 ° C) in die Schüssel der Beschichtung Medium abwaschen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
- Fügen Sie komplette 2 mL Kulturmedium (Tabelle 1) in jedem Brunnen in der 6-Well-Schale.
- Ändern Sie die Hälfte des Mediums alle 3-4 Tage. Bereiten Sie das komplette Medium frisch jedes Mal. Neuronen aus verschiedenen Maus Hirnregionen kultiviert haben unterschiedliche Morphologie und Merkmale (Abbildung 2).
2. die Transfektion von Plasmid DNA in primäre Neuron mit Liposomen-System
Achtung: Zur Neuron Transfektion empfiehlt sich eine Endotoxin-freie Plasmid DNA-Reinigung-Kit (Materialtabelle) für DNA-Vorbereitung. Zusätzliche Ethanol Niederschlag kann überschüssiges Lösungsmittel entfernen und DNA-Konzentration erhöht.
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Liposomen-basierte DNA Transfektion in primären Neuronen.
Hinweis: Die Transfektion Zeit richtet sich nach der Reifung Status in Experimente erforderlich. Der Hypothalamus Neuronen wurden bei DIV 7-10 (DIV, Tage in Vitro) transfiziert.- DNA: Liposomen Gemischaufbereitung: verdünnen GFP-GLUT4 Plasmid DNA-16 (2 µg) in einem Microcentrifuge Schlauch mit 300 µL niedrigen Serum Kulturmedium. Bereiten Sie eine weitere Microcentrifuge Schlauch mit 2 µL Liposomen in 300 µL niedrigen Serum Kulturmedium, und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Kombinieren Sie den Inhalt beider Röhren und 20-30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen Sie das Neuron Kulturmedium aus der Kulturschale. Fügen Sie 600 µL DNA-Liposomen Mischung in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für 4-6 h.
- Nach ca. 4-6 h DNA-Liposomen Mischung und fügen Sie 2 mL Kulturmedium.
- Fluoreszierende Signale wie GFP allein und GLUT4 Protein konjugiert mit GFP-Tag (Abbildung 3 und Abbildung 4), können nach 18-72 h beobachtet werden.
3. live-Bild-Aufnahme
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Leben vorbereitende Zellen für bildgebende
- Kulturzellen WT und CCR5- / - Hypothalamus Neuron mit dem Ausdruck grüne Fluoreszenz-Protein mit der Bezeichnung Glukosetransporters 4 (GFP-GLUT4) auf der #1.5 (oder 0,17 mm Dicke) Glas Deckglas vorbeschichtete mit Poly-D-Lysin im Schritt 1.1.1 im 6-Brunnen wurde Platte.
- Vorsichtig entfernen Sie die Deckgläsern mit Neuronen mit Pinzette und legen Sie es auf den Objektträger mit Vorsicht.
- Entfernen Sie überschüssiges Medium/Flüssigkeit mit heiklen Aufgabe Tücher. Falten Sie die Tücher zweimal, und platzieren Sie sie sorgfältig auf das Deckglas. Drücken Sie sanft die Tücher bewegungslos das Deckglas.
Achtung: Drücken Sie das Deckglas gegen den Objektträger nicht kräftig. Dieser Schritt soll sicherstellen, dass das Deckglas nicht verschieben/während der Bildaufnahme durch Auftrieb verursacht Drift. - Legen Sie Deckgläsern und Folien auf der Dekonvolution Mikroskoptisch mit dem Deckglas nach unten und gesicherten richtig. Dieser Schritt soll sicherstellen, dass die Folie Position konstant bleibt, so dass Benutzer den gleichen Satz von Zielzellen später verfolgen können.
- WT und CCR5- / - Hypothalamus Neuron Zellen mit einem 60 X beobachten / 1,42 NA Öl eintauchen Objektivlinse.
- Die ausgewählte Zellenproben mit CCL5 zu behandeln (10 ng/mL) oder Insulin (10 U/mL) für mind. ein Add 1,5 µL verdünnter Insulin am Rand des Deckglases.
- Visualisieren und die ausgewählte Zellenproben sofort aufnehmen. Programm der video-Recording-Software für 30 min aufnehmen.
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Dekonvolution Mikroskopie und Analyse
Hinweis: Dieser Teil des Protokolls erfordert den Einsatz einer Dekonvolution Mikroskop und spezielle Software für die Analyse.- Schalten Sie die imaging-System, ermöglichen Sie Mikroskoptisch, ordnungsgemäß zu initialisieren, und schalten Sie die LED-Lichtquelle zu.
- Immersionsöl (Brechungsindex 1.520 für live Proben bei 37 ° C) auf einer 60 x 1,42 NA Objektiv hinzufügen. Legen Sie die Probe-Folie auf dem Mikroskop mit dem Deckglas mit Blick auf das Objektiv, und sichern Sie die Folie ordnungsgemäß zu.
- Hellfeld oder Fluoreszenz-Beleuchtung mit Zielzellen bestimmt werden. Stellen Sie die Bildschärfe bis Zielzellen deutlich beobachtet werden können. Bewegen Sie das Objektiv nicht außerhalb des Deckglases, unnötige Kratzspuren zu vermeiden.
- Identifizieren, grüne Fluoreszenz Protein konjugiert Glucose Transporter 4 (GFP-GLUT4) durch das GFP-Signal. Gewünschte Ziel-Zellen für die Bildaufnahme zu identifizieren. Ausgewählten Zelle Zielposition kann für die Zukunft (Abbildung 4) gespeichert werden.
- Richten Sie richtige Versuchsparameter (einschließlich Pixel-Anzahl, Erregung Wellenlänge Übertragung Prozentsatz, Belichtungszeit, Dicke Stapel, Zeitintervall und bildgebenden Gesamtzeit) auf jede Zielzelle. Für dieses Experiment wurde die Bild-Pixel-Anzahl auf 512 x 512 (es 1.024 x 1.024 für höhere Auflösung einstellbar) für GFP Signale festgelegt. Die Belichtungszeit entstand zwischen 0,025 bis 0,05 s für jede 5 min. kleinere seitliche x-, y- und Z-Anpassungen durch die empfohlene Software (Materialien Tabelle) gesteuert werden kann.
- Legen Sie die Exposition Parameter auf ca. 2.000 bis 3.000 zählt maximale Pixel Intensität zu erreichen. Zur Minimierung von Fluoreszenz Immunofluoreszenz reduzieren Sie den Anteil der Erregung Lichtdurchlässigkeit so weit wie möglich während halten Belichtungszeit weniger als 1 S. Wiederholen Sie diese Schritte für jede zusätzliche Fluoreszenz-Kanäle und jeder einzelne Bereich von Interesse.
- Legen Sie die obere und untere Grenze des Z-Stack auf jede Zielzelle. Dies kann erreicht werden durch den Mikroskoptisch verschieben, bis die oberen und unteren Rand der Zielzelle, die beide leicht unscharf sind. Die Benutzer können die Auflösung der z-Achse anpassen, indem die Anzahl der Bilder zwischen der oberen und unteren Grenzwert (was getan werden kann, durch festlegen den Abstand zwischen jedem Bild).
- Stapel von Bildern wurden deconvolved und später analysiert mit Hilfe der jeweiligen Software – Geschwindigkeit von PerkinElmer in diesem Fall.
Representative Results
Der Hypothalamus Neuronen von Mäusen gezüchtet wurden weiter durch Immunostaining mit Hypothalamus spezifisches Protein - Pro-Opiomelanocortin (POMC) Antikörper und neuronale Marker - Mikrotubuli-assoziierten Protein 2 (MAP2) identifiziert (Abb. 2A). Wir bestätigt, dass die primären kultivierten Hypothalamus Neuronen Hypothalamus Protein POMC ausgedrückt. Die Expression von CCR5-Rezeptor und CCL5 in Hypothalamus Neuronen wurden durch spezifische Antikörper identifiziert und Co mit POMC Antikörper (Abb. 2A, 2 b) gekennzeichnet.
Nach 3 Tagen der Kultivierung, Neuronen mit GFP DNA (Abbildung 3) transfiziert wurden oder GFP konjugiert GLUT4 (Abbildung 4). GFP-Ausdruck in der Regel überall finden, dass die Zelle ohne ein bestimmtes Muster (Abbildung 3) aber die GLUT4-GFP als punktförmige-ähnlichen Struktur in das Zytosol (Abbildung 4) zum Ausdruck bringen wird. In dieser Studie verwendeten Transfektion Kit ist nicht die effizienteste Methode zur Neuron Transfektion; Es ist jedoch eine weniger strenge Methode für bessere Zelle Überleben nach Transfektion, trägt zur besseren Leben-Cell Imaging/Aufzeichnung später. Die Bilder von GFP-GLUT4 mit dem Ausdruck ihrer Neuronen wurden vor Zeitraffer-Filme (Abbildung 4A-B, ergänzende video 1, 2) auf Insulin-Stimulation oder CCL5 Stimulation (Abbildung 4, ergänzende video 3). Die Signale der GFP und GFP-GLUT4 sind klar und stark in Neuronen.
Hypothalamische Neurone mit GLUT4-GFP Transfektion wurden weiter mit Insulin (40 U) GLP-GLUT4 Menschenhandel charakterisieren behandelt. Tadelnswerter Videos von GLUT4-GFP Bewegung nach Insulin-Stimulation in WT und CCR5- / - Hypothalamus Neuronen sind bzw. als Video 1 und Video 2, gezeigt.
Abbildung 1: Isolierung von Gewebe aus verschiedenen Regionen des Mausgehirns im embryonalen Stadium (Tag 16,5). (A-D) Die Arbeitsschritte bei der Trennung der Welpen von der Plazenta. (E, F) Das Sezieren von einem Pup Kopf vom Körper. (G-ich) Die Schritte in der Isolation des gesamten Gehirns aus dem Schädel. Der schwarze Pfeil zeigt in die Richtung gezogen werden, während den Schädel mit Pinzette entfernen. (J) die Isolierung des Hypothalamus. Der schwarze Pfeil zeigt auf den Hypothalamus Region zwischen Zange. (K-L) Isolierung des Kortex des Mausgehirns. Der schwarze Stern zeigt die kortikale Region das Gehirn der Maus und der weiße Pfeil zeigt die Trennung des Kortex aus das ganze Gehirn. (M-O) Die Trennung von der hippocampalen Teil aus dem Kortex. Der oberen weißen Pfeil markiert das hippocampale Gewebe und der unteren weißen Pfeil markiert die kortikale Gewebe. Skalieren von Balken = 1 cm (A-F), 200 µm (G-O). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Charakterisierung der Hypothalamus neuronalen Marker - POMC und Co Ausdruck von CCL5 und CCR5. (A) primäre kultivierte Hypothalamus Neuronen wurden beschriftet mit Hypothalamus neuronalen Marker - POMC (rot), die Co Expression von CCR5 (grün) und Neuron Marker MAP2 (grau). (B) die CCL5 (grün) Ausdruck in POMC (rot) positive Hypothalamus Neuronen (Adapted aus den ergänzenden Angaben von Referenz-17). Hier, beschriftet DAPI den Zellkern mit blauer Farbe. Skalieren von Balken = 50 µm in (A) und (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: GFP-Protein-Expression in Maus primären Neuronen. GFP-Plasmid-DNA in primären kultivierten Neuronen nach 4 Tage Kultur (DIV4) mit Liposomen transfiziert und für weitere 3 Tage (DIV7) ausgedrückt. (A-B) GFP ist in Neuritis und Soma zum Ausdruck gebracht. (C-D) Neuronen mit gespielter Transfektion; DAPI beschriftet Kern in (B, D). Skalieren von Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: die Momentaufnahmen der GFP-GLUT4 im Hypothalamus Neuronen. (A, C) GFP-GLUT4 Protein exprimiert in Hypothalamus Neuronen Wildtyp (WT) und (B) CCR5- / - Hypothalamus Neuronen. Neuronen wurden angeregt, mit Insulin (A, B) oder CCL5 (C). Der Pfeil zeigt auf die GFP-GLUT4 punctata in der Neuritis vor (-) und nach (+) Insulin oder CCL5 Stimulation und Sternchen verweisen auf die Oberfläche GLUT4-GFP vor (-) und nach (+) CCL5 Stimulation (C). (Abbildung aus Referenz17angepasst). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| 5 x Borade Puffer | Unternehmen | Katalog-Nummer | Volumen |
| Borsäure | Sigma-Aldrich | B6768 | 1,55 g |
| Borax | Sigma-Aldrich | 71997 | 2,375 g |
| ddH2O | 100 mL | ||
| Gefiltert, bei 4 ° C halten | |||
| 20 x Poly-D-Lysin-Lager | Unternehmen | Katalog-Nummer | Volumen |
| Poly-D-Lysin | Sigma-Aldrich | P6407 | 100 mg |
| ddH2O | 100 mL | ||
| Gefiltert, bei-20 ° C halten | |||
| 1 X Poly-D-Lysin | Volumen | ||
| 20 X Poly-D-Lysin | 5 mL | ||
| 5 x Borade Puffer | 20 mL | ||
| DdH2O | 75 mL | ||
| Insgesamt | 100 mL | ||
| Bei 4 ° C halten | |||
| Medium zu waschen | Unternehmen | Katalog-Nummer | Volumen |
| DMEM-hoher Blutzucker | GIBCO | 12800-017 | 495 mL |
| Antibiotika-Antimyotic | GIBCO | 15240-062 | 5 mL |
| Insgesamt | 500 mL | ||
| Bei 4° C halten | |||
| Papain-Trypsin-Verdauung-Puffer: | Unternehmen | Katalog-Nummer | Volumen/Finale Konzentration |
| Papain (10 mg/mL) | Sigma-Aldrich | P4762 | 200 µL (2 mg/mL) |
| Trypsin-EDTA (0,25 %) | GIBCO | 25200-072 | 200 ΜL (0,05 %) |
| Medium zu waschen | 600 ΜL | ||
| Insgesamt | 1.000 ΜL | ||
| Halten Sie bei-20 ° C | |||
| Beschichtung-Medium: | Unternehmen | Katalog-Nummer | Volumen |
| Neurobasal medium | GIBCO | 21103-049 | 176 mL |
| Fetale Rinderserum | GIBCO | 10437-028 | 20 mL |
| L-Glutamat (200 mM) | GIBCO | 25030 | 2 mL |
| Antibiotika-Antimyotic | GIBCO | 15240-062 | 2 mL |
| Insgesamt | 200 mL | ||
| Bei 4 ° C halten | |||
| Komplette Kulturmedium | Unternehmen | Katalog-Nummer | Volumen |
| Neurobasal medium | GIBCO | 21103-049 | 95 mL |
| N2-Ergänzung (100 X) | GIBCO | 17502-048 | 1 mL |
| B27-Ergänzung (50 X) | GIBCO | 17504-04 | 2 mL |
| L-Glutamat (200 mM) | GIBCO | 25030 | 1 mL |
| Antibiotika-Antimyotic | GIBCO | 15240-062 | 1 mL |
| Insgesamt | 100 mL | ||
| Frisch zubereitet |
Tabelle 1: Verdauung Puffer-Medien Komposition in dieser Studie verwendet.
Ergänzende Video 1: Insulin stimuliert GFP-GLUT4 Bewegung im Hypothalamus Neuronen WT. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzende Video 2: Insulin stimuliert GFP-GLUT4-Bewegung in den CCR5- / - Hypothalamus Neuronen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzende Video 3: CCL5 stimuliert GFP-GLUT4 Bewegung im Hypothalamus Neuronen WT (Video von Referenz17angepasst). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Discussion
Die Möglichkeit, lebende Zellen, nach CCL5 oder Insulin Stimulation zu überwachen ist entscheidend für die schnelle Wirkung von CCL5 oder Insulin auf GLUT4 Bewegung zu studieren. In der Tat ermöglicht es uns, den signifikanten Unterschied zwischen WT und CCR5- / - Hypothalamus Neuronen nach Insulin-Stimulation zu visualisieren. Wir haben die Oberfläche Kennzeichnung der endogenen GLUT4 Protein in WT und CCR5- / - Hypothalamus Neuronen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Insulin Stimulation17durchgeführt. Die Kennzeichnung der Zelle Oberflächenproteine erfordert hohe Spezifität Antikörper mit niedrigen Hintergrund. Darüber hinaus kann die Oberfläche Fluoreszenz Quantifizierung auch schwierig und zeitraubend sein. So Zeitrafferaufnahme ermöglicht es uns, sicher sein, dass die Wirkung von CCL5 oder Insulin ist eine wahre physiologische Veränderung basierend auf experimentellen Bedingungen, anstatt eine statistische Variation. Gemeinsam mit Oberfläche Kennzeichnung von endogenen GLUT4, bieten wir starke Beweise und Experimenten zu zeigen, wie CCL5 und CCR5 GLUT4-Translokation und Insulin-Signal teilnehmen.
In modernen Zellbiologie und Molekularbiologie Studien erfordern viele Experimente die Auslastung der Fluoreszenz-Mikroskopie. Diese Technologie ermöglicht es Wissenschaftlern, die räumliche Beziehung zwischen Proteinen und/oder zellulare Organellen, neben Bewegungsrichtung und Geschwindigkeit, stimulierende Wirkung, morphologische Veränderungen und Protein Menschenhandel zu visualisieren. Diese Technologie hat jedoch immer noch die Einschränkung: Wenn Fluorophore angeregt werden, können Signale aus dem Zielprotein (oder Fläche) von Hintergrundfluoreszenz überwältigt werden. Infolgedessen können Fluoreszenzbilder mit erwarteten Signale begraben tief in Hintergrund Signale verschwommen angezeigt. Dieses Phänomen zeigt sich vor allem für die Beobachtung der Membrane-springen Proteine.
Insgesamt interne Reflexion Fluoreszenz Mikroskopie (TIRFM) wurde entwickelt, um diese Schwierigkeit zu überwinden. Es ermöglicht es Wissenschaftlern, die Anregung von ausgewählten Oberfläche gebundene Fluorophore zu visualisieren, ohne den Hintergrund Fluorophore. Es ermöglicht es Wissenschaftlern, Eigenschaften und Ereignisse auf einen sehr dünnen Flächenbereich wie eine Plasmamembran selektiv zu charakterisieren. Dekonvolution Mikroskopie ist eine rechenintensive Bildverarbeitung-Technik, die mit Hilfe von technologischen Fortschritten in den letzten Jahren ermöglicht wird. Es ist häufig verwendet worden, um digitale Fluoreszenz Bildauflösung zu verbessern. Wie bereits erwähnt, wenn Fluorophore sind mit jeder Art von Beleuchtung (z. B. Laser oder LED) angeregt wird, werden alle Fluorophore Lichtsignale unabhängig davon emittieren wenn sie im Mittelpunkt oder nicht stehen, so dass das Bild immer verschwommen angezeigt werden. Diese Unschärfe entsteht durch ein Phänomen namens "Point Spread Function" (PSF), wie Licht, das aus einer kleinen fluoreszierenden Quelle (heller Punkt) wird weiter ausgebreitet und unscharf (verschwommen). Im Prinzip dieser Veranstaltung wird eine Sanduhr-ähnliche geformte Fluoreszenzsignal produzieren, und zahlreiche solche Lichtsignale eine Fluoreszenzbild wettgemacht werden kann. Dekonvolution Prozess kann die Fluoreszenz-Signale an seiner ursprünglichen hellen spot Form zuweisen und beseitigen die Out-of-Focus Licht Bildkontrast zu verbessern.
In den letzten Jahren haben Dekonvolution Algorithmen Bilder mit vergleichbarer Auflösung der confocal Mikroskop generiert. Darüber hinaus verhindert, dass im Vergleich zu TIRFM, die Out-of-Focus Unschärfe durch eine begrenzte Erregung Region erkannt Weitfeld-Mikroskopie ermöglicht alle Licht-Signale erkannt werden und ordnet sie zurück zu ihrer Quelle durch den Prozess der Entfaltung. Daher ist die Dekonvolution Mikroskopie in der Praxis nicht nur eine effizientere Bild Erwerbsmethode, sondern auch eine kostengünstigere Methode im Vergleich zu TIRF-Mikroskopie geworden.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir sind dankbar für die Zuschüsse durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan - MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) und Gesundheit und das Wohlergehen Zuschlag von Tabakwaren - MOHW106-TDU-B-212-144001 bis S-Y C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
| SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
| VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
| Insulin | Actrapid, Denmark | ||
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
| GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
| Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
| CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
| 12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
| micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
| curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
| 5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |
References
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