Summary
Ce rapport présente une approche simple pour provoquer avec succès l’expérimental névrite auto-immune (EAN) à l’aide de la protéine de la myéline zéro (P0)180-199 peptide en combinaison avec adjuvant complet de Freund et la toxine coquelucheuse. Nous présentons un modèle sophistiqué capable d’évaluer avec précision l’ampleur des déficits fonctionnels et neuropathologie qui se produisent dans cette EAN.
Abstract
Névrite auto-immune expérimentale (EAN) est un modèle expérimental fort apprécié des maladies démyélinisantes périphériques auto-immunes. Maladie de l’EAN est induite par l’immunisation de souris avec des peptides neurogènes pour diriger une attaque inflammatoire vers les composants du système nerveux périphérique (PNS). Les progrès récents ont permis à l’induction de l’EAN dans la lignée de souris C57BL/6 relativement résistante à l’aide de la protéine zéro (P0)106-125 ou P0180-199 peptides livrés en adjuvant combinée à l’injection de la toxine de la coqueluche. La capacité d’induire l’EAN dans la souche C57BL/6 permet l’utilisation des nombreux outils génétiques qui existent sur cette toile de fond la souris et permet ainsi l’étude sophistiquée de la pathogenèse de la maladie et à l’interrogatoire de l’action mécanique de thérapeutiques novatrices dans combinaison d’approches transgéniques. Dans cette étude, nous démontrons une approche simple pour provoquer avec succès l’EAN en utilisant le peptide de180-199 P0 chez les souris C57BL/6. Aussi, nous exposons un protocole pour l’évaluation des déficits fonctionnels qui se produisent dans ce modèle, accompagné d’un tableau de caractéristiques neuropathologiques. Ainsi, ce modèle est un puissant modèle expérimental pour l’étude de la pathogenèse de neuropathies démyélinisantes périphériques humains et pour déterminer l’efficacité des thérapies potentielles qui visent à favoriser la réparation de la myéline et protéger contre les dommages de nerf dans auto-immunes névrite.
Introduction
Les neuropathies périphériques peuvent être origine génétique ou acquise, avec neuropathies acquises ayant soit métabolique, ischémique, précipitants inflammatoires ou toxiques. Ces maladies sont également utilement classées comme axonale ou demyelinative à l’origine. Le plus souvent acquis démyélinisantes les neuropathies périphériques sont la polyneuropathie démyélinisante inflammatoire aiguë (paid, aussi connu comme le syndrome de Guillain-Barré, GBS) et Polyneuropathie inflammatoire chronique démyélinisante (CIDP)1, 2 , 3 , 4; les deux sont pathogenetically caractérisées par une réaction auto-immune dirigée contre la gaine de myéline, causant la démyélinisation des nerfs périphériques. Dans ces maladies, les lymphocytes T activés traversent la barrière de nerf de sang et de génèrent une réaction immunitaire dans le PNS. Activation des macrophages dans le nerf puis provoque la démyélinisation soit directement via attaque phagocytaire, soit indirectement par l’intermédiaire de médiateurs de l’inflammation sécrétées, entraînant des troubles cliniques tels que paralysie et dysfonctionnement sensoriel5. Tandis que les axones démyélinisés conservent la capacité d’être remyelinated après la démyélinisation, remyélinisation est souvent retardée ou incomplète, entraînant la susceptibilité des axones nus à des dommages irréversibles, qui est la cause principale de la clinique permanent personnes handicapées. Actuellement, les traitements les plus efficaces sont des immunomodulateurs, mais malgré leur efficacité, dans de nombreux cas la récupération est souvent lente et environ 25 % des patients éprouveront des déficits fonctionnels résiduels qui réduisent considérablement leur qualité de vie de6, 7.
EAN est un modèle animal couramment des maladies démyélinisantes neuropathie périphérique qui a fourni des renseignements précieux sur pathogenèse et un moyen d’évaluer de nouveaux agents thérapeutiques4. Ce modèle peut être induit chez les différentes espèces comme les lapins, rats, souris et les cochons d’Inde et est induite par l’immunisation avec des antigènes neurogènes. Toutefois, en fin de compte l’induction EAN réussie repose sur une réponse immunitaire appropriée pour la maladie de se produire. Compte tenu des variations de l’espèce (et inter-espèce/souche) la fonction immunitaire, plusieurs combinaisons d’antigènes et adjuvants ont été développés pour provoquer avec succès l’EAN. En ce qui concerne les outils de génétiques murines, le C57BL/6 est la plus largement utilisée ; Toutefois, le peptide de protéine P2 traditionnel 57-81 (P257-81) qui se traduit par la maladie dans la souche de souris sensibles SJL8 est incapable de pathogenèse illicite conduisant à des déficits fonctionnels chez la souche C57BL/6. Heureusement, les paradigmes de sensibilisation utilisant le P0106-125 ou P0180-199 peptides, livré en adjuvant combiné avec l’injection de la coqueluche, la toxine peut surmonter cet obstacle, permettant aux outils sophistiqués de génétiques être utilisés dans le modèle murin de EAN.
Ici, on présente une méthode simple pour l’induction de l’EAN chez les souris C57BL/6. En outre, une approche globale et détaillée permettant d’évaluer les déficits fonctionnels et neuropathologiques associés à la maladie est fournie. Le P0180–199 peptide9 a été choisie plutôt que le remplacement de P057-81 10. Le modèle de199 P0180–a été décrit pour produire des signes cliniques moins sévères par rapport à l' alternative de P057-81 10et est donc susceptible de résister à l’introduction de potentiellement des perturbations génétiques délétères, récupérer des interventions chirurgicales (par exemple, implantation de pompe osmotique) et se prête à la fonction de marche tapis roulant stable4. Cependant, le tapis roulant démarche tests de la fonction et histologiques protocoles décrits ici pourraient facilement être appliquées lors de l’étude de la maladie dans une variante de57-81 induite par P0.
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Protocol
toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par l’Institut Florey pour les neurosciences et le Comité d’éthique de la santé mentale (Centre de cerveau de Melbourne) Animal et suivre le Code de pratique australienne pour l’utilisation des animaux pour scientifique Application.
1. Induction EAN
Remarque : EAN peut être induite avec succès chez les souris C57BL/6 mâles âgés de 6 à 8 semaines. Le protocole d’induction dure 9 jours au total. Jour 0 désigne le jour de la première vaccination. Pour ce protocole, les injections ont été réalisées sous anesthésie (voir étape ci-dessous 1.1.2).
- Lors de la journée -1 :
- préparer la toxine de la coqueluche (voir Table des matières) solution de 1,6 µg/mL à l’aide de phosphate 0,1 M souris-isotonique stérile solution saline tamponnée (MT-PBS).
- Anesthetization à l’isoflurane :
- ,
- Placez votre souris (C57BL/6, mâle, 6 à 8 semaines) dans la chambre d’anesthetization et de régler le débit d’oxygène à 1 L/min.
- Allumez le vaporisateur isoflurane, réglez-le à 2,5 % pour anesthetization et le moniteur de respiration et attendez pendant 2 min, ou jusqu'à ce que les réflexes primaires (limbe cornéen et postérieur) sont sensibles n’est plus
- Retirer la souris de la chambre d’anesthetization et d’administrer les 250 µL de la solution ci-dessus de la toxine pertussique via une injection intrapéritonéale (i.p.) à l’aide d’une seringue 0,5 mL avec une aiguille de 30 1/2 G.
- Préparation de l’inoculum injectable pour la vaccination :
- Prepare Solution A à l’aide de 2 mg/mL de solution de peptide de 180-199 P0 (avec > 98 % de pureté, séquence S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) dans la solution saline à 0,9 %.
- Préparation de Solution B à l’aide de 20 mg/mL de solution de Mycobacterium tuberculosis (voir Table des matières) dans Freund ' adjuvant complet de s (FCA, comprenant : 15 % mannide monoolate + 85 % d’huile de paraffine et 0,5 mg/mL des morts et secs desséchés M Mycobacterium butyricum).
- Faire l’inoculum final d’injection, combiner des parties de volume égal de Solutions A et B dans un batteur de perle et mélangez-les à une vitesse maximale de 1 min à température ambiante.
Remarque : Des Solutions A et B peuvent être gardées en stock et stockées à 4 ° C pendant un maximum d’un mois mais l’inoculum final combiné doit être fraîchement préparée le jour de l’injection de la souris.
- Lors de la journée 0, administrer 50 µL de l’inoculum (préparation décrite à l’étape 1.1.4) dans une souris via une injection sous-cutanée à l’aide d’une aiguille de 23 G.
Remarque : L’injection peut être placée entre les omoplates, ou entre les membres postérieurs et la queue sur le dos de caudal. - Le jour 1, font de la solution de la toxine pertussique de 1,2 µg/mL (en MT-PBS) et administrer 250 µL dans une souris par injection intrapéritonéale à l’aide d’une seringue 0,5 mL avec une aiguille de 30 1/2 G.
- Le jour 3, répéter l’étape 1.3 ci-dessus.
NOTE : Solutions mères A et B peuvent être constituées et stockées à 4 ° c pendant un maximum d’un mois. Toutefois, l’inoculum injectable final, produit par la combinaison des solutions mères A et B, doit être fait le jour de l’injection de. - Le jour 8, administrer 50 µL de l’inoculum (préparation décrite à l’étape 1.1.4) dans une souris par une injection sous-cutanée (Voir l’étape 1.2 ci-dessus), sur le même site d’injection comme à l’étape 1.2 (pour chaque animal)
2. score clinique
- effectuer des cliniques marquant à partir de tous les jours le jour 0.
- Donnez chaque souris un score de 0, 1, 2, 3 ou 4 selon les critères publiés 4. Voir le tableau 1 pour la notation clinique EAN.
Remarque : Par souci de cohérence, un effort doit être fait pour marquer la souris en même temps quotidiennement par le même chercheur.
3. Évaluation de la fonction de moteur
Remarque : le rendement moteur est évalué en parallèle avec un score clinique de la même cohorte d’animaux. L’appareil d’évaluation de la fonction motrice doit être connecté à un ordinateur qu’a un système d’imagerie de fonction de démarche (voir Table des matières) installé. Il est également recommandé que toutes les souris à évaluer doivent être habitués à la tâche en cours d’exécution avant l’induction de l’EAN. Pour ce faire, les pistes de pratique (2 séries de tests par souris) sont exécutées trois jours avant l’induction de la maladie (journée -3).
- Ouvrir l’appareil d’évaluation de la fonction motrice et allumez le bouton lumière.
- Scruff la souris fermement et encrer ses pieds en l’abaissant dans un récipient rempli d’encre rouge tout en tenant sa queue.
Remarque : Cette étape est requise pour la souche C57BL/6, mais peut être ignorée si une souche de souris avec une couleur de la robe blanche est utilisée. - Placez votre souris dans le compartiment en marche et régler la vitesse du tapis roulant à 15 cm/s.
- Tourner sur le tapis roulant et cliquez sur le " dossier " bouton pour capturer la requête en cours d’exécution de la souris à l’aide de la fonction de marche système d’imagerie (voir Table des matières).
- Utiliser un timer et mesurer chaque course pour 36 s. Après 36 s, arrêter l’enregistrement et arrêt du tapis roulant.
Remarque : Les souris qui ne peut pas terminer avec succès la tâche en cours d’exécution pour cet intervalle s 36 sont considérés comme ayant échoué. - Enregistrer le fichier vidéo dans le dossier.
- Répéter les étapes ci-dessus pour chaque souris pour être évalué. Les souris avec la même tâche en cours d’exécution de test tous les 3 jours.
- Analyser les fichiers vidéo édités à l’aide de logiciels pour les paramètres de fonction de démarche (voir Table des matières).
Remarque : Les détails de la façon d’analyser les différents paramètres du moteur varient entre logiciels donc veuillez consulter le fabricant ' instruction s avant l’analyse. Pour obtenir une preuve histologique d’axonal et myéline par immunohistochimie ou microscopie électronique, animal tissus peuvent être pris à la toute étape post motricité évaluation selon les objectifs spécifiques de la recherche.
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Representative Results
Peptide de180-199 P0 induite par EAN dans des chenaux de souris C57BL/6 pour une maladie monophasique avec score clinique début de post 6 jours premier gravité score de vaccination (dpi) et maximale est observée du dpi 25 suivi par certains score clinique amélioration de 40 dpi durée (Figure 1)4,9. En termes de fonction de la démarche, les souris commencent à échouer à une tâche en cours d’exécution simple dès 6 dpi et par 35 dpi souris ont peu de capacité pour compléter un tapis de course simple exécution de la tâche et ne s’améliorent pas en capacité de marche même à 55 dpi4 (Figure 1). Souris induite par EAN a diminué progressivement dans leur capacité d’accomplir la tâche en cours d’exécution au fil du temps. Échec de la tâche en cours d’exécution est observée dans 80 % des souris, mais en plus ce, démarche de patte l’élargissement en tapis roulant est un déficit fonctionnel clé qui ne se résout pas sur la durée de la maladie4.
Il y a plusieurs caractéristiques neuropathologiques P0180-199 induite par EAN : dommages à la gaine de myéline ; stress de l’axone ; et la largeur accrue de nœud et dommages aux structures de paranodale. L’examen de coupes semi-minces de nerfs sciatiques révèle des zones de démyélinisation (Figure 2 b, flèches) par rapport aux nerfs sciatiques de témoins du même âge en bonne santé (Figure 2 a). Ce qui est important, il est possible d’obtenir G-ratios d’images capturées à partir de sections semi mince du nerf sciatique imagées à haute puissance avec la microscopie photonique,4. Cependant, images de microscopie électronique (met) transmission haute puissance sont tenus d’identifier les caractéristiques neuropathologiques spécifiques comme dysmyelinaton, dommages à la lamelle de la myéline, et signes d’axone stress comme gonflement mitochondrial (désagrégation et distorsion de crêtes et de cristolysis partielle ou totale) (Figure 2–2D). Conforme à la preuve ultrastructurale du stress de l’axone (Figure 2-2D), le modèle EAN de180-199 induite par P0 affiche également lésion axonale aiguë, démontrée par dramatiquement élevé β-amyloïde précurseur expression de la protéine (APP) dans les nerfs sciatiques (Figure 3 a). Ce n’est pas observé dans les tissus sains témoins du même âge (Figure 3 a). Des modifications neuropathologiques sur les nœuds et les paranodes ont été bien documentées dans GBS ; en particulier, l’AMAN variante11,12. Dans notre modèle murin d’EAN, nous identifions que l’élargissement des nœuds et des perturbations dans le paranode est les caractéristiques neuropathologiques supplémentaires de P0,180-199 induite par EAN (Figure 3 b).
Figure 1 : représentation schématique du paradigme induction EAN, clinique score évaluation et capacité en cours d’exécution au cours de l’EAN. (A) vue d’ensemble de l’induction de l’EAN protocole chez les souris C57BL/6, à compter de 6 à 8 semaines d’âge, avec schémas de (B) des scores cliniques attendus et (C) une fois en cours d’exécution au cours de la maladie du cours (voir référence4). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : souris avec EAN affichent la perte de la myéline, lésions de la myéline et signes de stress axones. (A) A image de champ lumineux (moins de 100 grossissement X) tirée du semi minces des sections de nerfs sciatiques de témoins du même âge en bonne santé. (B), un lumineux champ image (grossissement de X 100) tiré de semi minces des sections de nerfs sciatiques des souris induites avec EAN à 55 jours après la première vaccination (dpi). Les zones dépourvus de myéline entourée d’axones myélinisés finement (pointes de flèches) indiquent la remyélinisation ; Cela n’a pas été observée dans les tissus obtenus à partir des témoins du même âge en bonne santé (voir A). (C), un représentant de microscopie électronique image (grossissement de X moins 5 000) prise fromsciatic nerfs de pathologie de la myéline mettant en évidence le groupe B (flèche open) et le stress de l’axone (place de la liaison indiquant des mitochondries gonflées à 55 dpi). (D) une image TEM de haute puissance (englobant dans C) mettant en évidence les mitochondries gonflées qui témoignent de l’axone stress (têtes de flèche), mais il est absent des témoins du même âge en bonne santé (données non présentées). Barreaux de l’échelle = 10 µm (A, B) et 500 nm (C, D). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Stress de l’axone et pathologie nodal est un trait de P0180-199 induite par EAN. (A) seul plan images confocales (moins de 40 grossissement X) prises par les nerfs sciatiques à 55 dpi. Tissus de souris EAN montrent dramatiquement élevé APP expression, co localisée avec β-III tubuline (un marqueur de neurones) indiquant des signes de stress axonale. (B) haute puissance Z-projections (grossissement de X 100) de paranodes colorées avec un anticorps contre Caspr dans les sections du nerf sciatique. Dans les lymphatiques des souris EAN, il y a une distance accrue entre adjacent paranodes indiquant le nœud élargissement. En outre, nodal pathologie comme la perturbation de la structure de paranode peut être observée chez les souris EAN mais est absent des témoins du même âge en bonne santé. Barreaux de l’échelle = 10 µm (A) et 5 µm (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Score | Critères de | Notes et commentaires des critères d’évaluation |
| 0 | Souris normale | |
| 1 | Moins vivante ou lathery | Elle est évaluée en réponse à une manipulation normale, souris présentent généralement des premiers signes d’une activité réduite à partir de 5 jours après la vaccination |
| 2 | Queue de parésie ou | Parésie de la queue est évaluée par le test de course de queue (effleurant la queue). |
| Parésie du membre doux | Parésie du membre doux se réfère à souris glisser leur ventre sur le sol lorsque vous marchez sur une surface plane | |
| 3 | Queue de parésie + parésie limb doux ou | Ataxie légère est jugée toute difficulté dans la marche normale |
| Queue de parésie + ataxie légère ou | ||
| Parésie du membre doux + ataxie légère | ||
| 4 | Ataxie sévère | Ataxie sévère est identifiée par atypique en arrière marche, combiné avec parésie du membre, parésie du membre doux ou parésie de la queue |
Tableau 1 : EAN clinique score de paradigme.
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Discussion
Le présent rapport décrit une méthode simple pour provoquer l’EAN utilisant le peptide de180-199 P0 chez les souris C57BL/6, qui permet la quantification des principaux déficits neuropathologiques et fonctionnelles chez la souris induits avec EAN. Distincte pour le protocole d’induction EAN décrit ici est l’utilisation de l’anesthésie, tout en effectuant les injections de vaccination. L’utilisation de l’anesthésie isoflurane améliore grandement la capacité de faire en sorte que le volume total de l’inoculum est injecté par voie sous-cutanée à l’endroit désiré avec une erreur minime et le stress aux animaux.
Souris commencera à afficher des signes cliniques de dpi 64 à l’aide de cette méthode d’induction de l’EAN. Cependant, apparition de la maladie telle que mesurée par le score clinique a précédemment signalée se produise de dpi ~ 109,10. Alors que cette différence dans l’apparition de la maladie tel que déterminé par le score clinique pourrait être partiellement en raison de différents critères de notation cliniques, il est plus probable, a expliqué par l’utilisation des adjuvants différents dans l’inoculum pour l’induction de l’EAN. Ce protocole utilise adjuvant complet de Freund, un contenant M. butyricum, qui est complétée par M. tuberculosis. Autres études utilisent de Freund complété seulement par M. tuberculosis dans l’inoculum injecté contenant le P0180-199 peptide9,10 pour la vaccination.
Dans ce protocole, livrant la toxine pertussique par injection intrapéritonéale est recommandé plutôt que par voie intraveineuse (i.v.) injection dans la veine de queue. Il a été démontré que le mode de livraison de la coqueluche ne modifie pas significativement la maladie l’apparition ou la progression4, mais le choix de livrer par voie intrapéritonéale, par opposition à la veine caudale i.v., est motivé par l’atténuation des risques et tenter de réduire la probabilité d’erreur de fonctionnement. Fréquemment, les injections i.v. de queue veineuse sont techniquement plus difficile par rapport aux injections d’un volume égal. Il a été précédemment démontré que l’utilisation de la toxine pertussique comme adjuvant est nécessaire pour induire l’EAN lorsque vous utilisez le P0180-199 peptide9. Fait intéressant, les travaux antérieurs ont montré que réduire de moitié la dose de la coqueluche décrite dans cette méthode, est suffisante pour illicite EAN mesurée par le score clinique, neuropathologie et démarche élargissant au cours sur tapis roulant4. Toutefois, diminuer la dose de toxine de la coqueluche utilisée dans au cours de l’EAN induction influence considérablement capacité en cours d’exécution et souris effectuent beaucoup mieux sur le tapis roulant de tâche lorsque EAN est induite avec la moitié de la dose la coqueluche décrite dans cette méthode 4.
Les déficits moteurs observés dans ce modèle d’EAN P0180-199 peptide induite est accompagné et soutenu par des preuves neuropathologiques. Auparavant, il a été démontré qu’il est assez sensible pour détecter des modifications dans la sévérité de la maladie qui a permis de réduire de moitié la dose de toxine coquelucheuse durant l’induction EAN de quantifier l’ampleur des dégâts de la myéline. Ici, autres signes distinctifs d’EAN comme stress axonale et perturbation aux structures de nœud/paranodale sont identifiés, résultant en une suite de quantitatives neuropathologiques marqueurs pour P0180-199 induite par EAN. Cela permet pour des examens plus prudents de la neuropathologie lors de l’évaluation des processus morbides, ou l’efficacité de nouveaux agents thérapeutiques. Excitante, ces évaluations neuropathologiques de la maladie peuvent être corrélées à des affichages fonctionnels dans le but de fournir des idées plus profondes et une meilleure compréhension de la relation entre neuropathologie et les déficits de fonction qui sont une caractéristique de ce modèle d’EAN. En plus des analyses neuropathologiques et test de fonctionnement de démarche employée dans cette étude, les autres évaluations fonctionnelles comme la mesure de vitesse de conduction nerveuse sont proposées afin de saisir pleinement les résultats de la fonction des interventions thérapeutiques à l’aide ce modèle.
EAN est un modèle expérimental puissant et couramment utilisé pour examiner les périphérique démyélinisation et remyélinisation, avec les nerfs sciatiques et cauda equina étant les plus fréquemment étudiés les nerfs périphériques. L’avantage majeur de l’EAN est qu’elle se traduit par un déficit moteur quantifiable et reproductible, ce qui permet des analyses de la neuroprotection et la myéline réparation d’un point de vue clinique. En outre, la myéline est aiguë et reproductible permettant ainsi des analyses détaillées de la myéline et des lésions axonales d’un point de vue histopathologique.
Alors que l’EAN modèle représente une moyenne expérimentale passionnante pour enquêter sur les maladies démyélinisantes neuropathie périphérique, il y a limites potentielles, mais aussi des défis techniques. Il est important de comprendre la nature de l’hétérogénéité des maladies démyélinisantes de neuropathie périphérique chez les humains, impliquant une interaction complexe entre le système immunitaire et PNS. Le défi actuel, c’est qu’aucun un modèle animal de l’EAN ne peut imiter fidèlement tous ses aspects. En outre, il y a des variations importantes entre les espèces et variétés inter concernant la gravité de la maladie et la progression du modèle EAN. Par exemple, nous avons constaté qu’en général l’EAN induit chez les souris C67/B6 est moins grave que l’EAN induite chez les rats Lewis (données non publiées). Au sein de la même souche, il y a aussi des différence entre les sexes. Nos données non publiées montrent que le modèle EAN induit chez les souris C57/B6 mâles est plus reproductible que celle induite chez les souris femelles, toutefois, la raison exacte qui sous-tendent cette différence entre les sexes n’est pas claire.
En conclusion, nous avons rapporté un protocole qui permet une induction robuste et rapide du modèle EAN chez les souris C57/B6 mâles. Combinaison de score clinique et l’évaluation de la fonction motrice avec études neuropathologiques fournit un outil stratégique pour l’étude des maladies démyélinisantes neuropathie périphérique point de vue clinique et pathologique. Surtout, il favorise les études futures sur les mécanismes des thérapies qui ciblent la réparation de la myéline des nerfs périphériques à l’aide de souris transgéniques approches.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt au sujet de ce travail.
Acknowledgments
DGG est NHMRC Peter Doherty et Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA) début carrière Fellow. JLF est soutenu par une bourse de recherche postdoctorale MSRA. Ce travail a été soutenu par l’Australian National Health et projet Medical Research Council (NHMRC) accorder #APP1058647 à JX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
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