نهج بسيط للحث على العصب الذاتية التجريبية في الفئران C57BL/6 للتقييمات الفنية ولاثيل
Summary
يوجز هذا التقرير نهج بسيط للحث على نجاح العصب الذاتية التجريبية (EAN) استخدام البروتين المايلين صفر الببتيد180-199 (P0) في تركيبة مع adjuvant فروند بالكامل والسمية السعال الديكي. نحن نقدم نموذجا متطورة قادرة على دقة تقدير مدى عجز وظيفي وأمراض الأعصاب التي تحدث في هذا EAN.
Abstract
العصب الذاتية التجريبية (EAN) نموذج تجريبي يحظى بتقدير جيد لأمراض المناعة الذاتية دملينتينغ الطرفية. فعل المرض EAN تحصين الفئران مع الببتيدات العصبية لتوجيه هجوم تحريضية تجاه مكونات الجهاز العصبي المحيطي (PNS). ومكنت التطورات الأخيرة استحثاث EAN في السطر الماوس C57BL/6 مقاومة نسبيا استخدام البروتين المايلين صفر (P0)106-125 أو الببتيدات180-199 P0 تسليمها في adjuvant جنبا إلى جنب مع حقن السم السعال الديكي. القدرة على حفز EAN في سلالة C57BL/6 يسمح باستخدام العديد من الأدوات الوراثية الموجودة على هذه الخلفية الماوس، ويسمح بالتالي دراسة إمراضية المرض متطورة والاستجواب للعمل آليا للمداواة الرواية في تركيبة مع نهج محوره وراثيا. في هذه الدراسة، ندلل على نهج بسيط لحمل EAN استخدام الببتيد180-199 P0 في الفئران C57BL/6 بنجاح. أننا أيضا مخطط بروتوكول لتقييم العجز الوظيفية التي تحدث في هذا النموذج، مصحوبا بمجموعة من الميزات لاثيل. وهكذا، هذا النموذج هو نموذج تجريبي قوية لدراسة الآلية المرضية لاعتلالات الأعصاب دملينتينغ الطرفية البشرية، وتحديد مدى فعالية العلاجات المحتملة التي تهدف إلى تشجيع إصلاح المايلين وحماية ضد تلف الأعصاب في المناعة الذاتية العصب.
Introduction
اعتلالات الأعصاب الطرفية يمكن أن تكون وراثية في الأصل أو المكتسبة، أما مع اعتلالات الأعصاب المكتسبة بعد أما الإقفارية الأيضية،، بريسيبيتانتس الملتهبة أو السامة. يكون من المفيد أيضا تصنف هذه الأمراض أما محواري أو ديميليناتيفي في الأصل. الأكثر شيوعاً اكتسب دملينتينغ اعتلالات الأعصاب المحيطية هي “اعتلال دملينتينغ الالتهابات الحادة” (الرابطة، المعروف أيضا بمتلازمة غيان-باريه GBS) واعتلال دملينتينغ التهاب مزمن (سبب)1، 2 , 3 , 4؛ باثوجينيتيكالي على حد سواء تتسم بفعل المناعة الذاتية ضد غمد المايلين، مما تسبب في ديمييلينيشن الأعصاب المحيطية. في هذه الأمراض، وتنشيط خلايا تي عبور حاجز الدم في الأعصاب وتولد رد فعل المناعة في السندات الإذنية. يؤدي تنشيط الضامة داخل العصب ثم demyelination أما مباشرة عن طريق هجوم متجولة أو غير مباشر عن طريق وسطاء التهابات يفرزها، نتج عنه عجز السريرية مثل الشلل والخلل الحسي5. بينما محاور عصبية ديميليناتيد الاحتفاظ بالقدرة على أن تكون ريميليناتيد بعد ديميليناتيون، ريميليناتيون غالباً ما يتأخر أو غير مكتملة، أسفر عن قابلية محاور عصبية عارية لضرر لا يمكن إصلاحه، وهو السبب الرئيسي للدائم السريرية العجز. حاليا العلاجات الأكثر فعالية إيمونومودولاتوري، ولكن على الرغم من فعاليتها، في كثير من الحالات الانتعاش بطيء غالباً، والمرضى ~ 25% سوف تواجه العجز الوظيفية المتبقية التي تقلل إلى حد كبير على نوعية حياة6، 7.
EAN هو نموذج حيوانية مستخدمة على نطاق واسع من دملينتينغ الأعصاب الطرفية التي قدمت أفكاراً قيمة في المرضية ووسيلة لتقييم العوامل العلاجية رواية4. يمكن أن يتسبب هذا الطراز في الأنواع المختلفة مثل الأرانب، الجرذان، الفئران وخنازير غينيا، وهو فعل التحصين مع المستضدات العصبية. ومع ذلك، في نهاية المطاف التعريفي EAN ناجحة يعتمد على استجابة مناعية مناسبة للمرض إلى حدوث. ونظرا للاختلافات الأنواع (وبينها species/سلالة) في وظيفة المناعة، قد وضعت مجموعات متعددة من المستضدات، ومأمونية بنجاح حمل EAN. من حيث الأدوات الوراثية مورين، C57BL/6 هو الأكثر استخداماً؛ ومع ذلك، الببتيد بروتين P2 التقليدية 57-81 (P257-81) التي ينتج عنها مرض في سلالة من الماوس سخل عرضه8 غير قادر على المرضية غير المشروعة مما أدى إلى عجز وظيفي في سلالة C57BL/6. لحسن الحظ، تسليم نماذج التوعية باستخدام P0106-125 أو الببتيدات P0180-199 ، في adjuvant جنبا إلى جنب مع حقن السعال الديكي السمية يمكن التغلب على هذا الحاجز، تمكين أدوات الجينية المتطورة التي ستستخدم في موريني EAN النموذجي.
ويرد هنا، طريقة بسيطة لاستحثاث EAN في الفئران C57BL/6. وباﻹضافة إلى ذلك، تقدم نهجاً مفصلة شاملة لتقييم العجز الوظيفي ولاثيل المرتبطة بهذا المرض. واختير P0180–199 الببتيد9 تفضيل البديل57-81 P010. الطراز199 180–P0 قد وصفت لإنتاج علامات سريرية أقل حدة بالمقارنة مع البديل57-81 P010فمن المرجح أن تحمل إدخال يحتمل أن الاضطرابات الوراثية الضارة، التعافي من العمليات الجراحية (مثل غرس مضخة ناضح)، وهي قابلة للمطحنة مشيه دالة اختبار4. ومع ذلك، الاختبارات الدالة مشيه المطحنة وغذائها البروتوكولات المذكورة هنا يمكن بسهولة تطبيق عند دراسة هذا المرض في متغير57-81 التي يسببها P0.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويوجز هذا التقرير طريقة بسيطة لحمل EAN استخدام الببتيد180-199 P0 في الفئران C57BL/6، وتمكين التحديد الكمي للعجز لاثيل والوظيفية الرئيسية في الفئران التي يسببها مع EAN. متميزة في بروتوكول التعريفي EAN الموصوفة هنا استخدام التخدير أثناء إجراء حقن التحصين. استخدام التخدير isoflurane يعزز إلى حد كبير ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وهو استيراد NHMRC بيتر دوهرتي وزميل مهنة أوائل أستراليا البحوث التصلب المتعدد (MSRA). جلف معتمد من قبل MSRA زمالات ما بعد الدكتوراه. تم دعم هذا العمل الصحة الوطنية الأسترالية ومنح المشروع مجلس البحوث الطبية (NHMRC) #APP1058647 JX.
Materials
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
- Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
- Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
- Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
- Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
- Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy–update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
- Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
- Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
- Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
- Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
- Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
- Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).
