Summary
このレポートは、Freund 完全アジュバント、百日咳毒素との組み合わせでゼロ (P0)180 199ペプチド ミエリン蛋白を用いた実験的自己免疫性炎 (EAN) を正常に誘導するために単純な方法をについて説明します。機能的障害とこの EAN の発生病理の程度を正確に評価することができる洗練されたパラダイムを提案します。
Abstract
実験的自己免疫性視神経炎 (EAN) は自己免疫性末梢脱髄性疾患の実験モデルの当然です。EAN 病による神経因性ペプチドを持つマウスを免疫末梢神経系 (PNS) のコンポーネントに向かって炎症性攻撃を指示します。最近の進歩は、ミエリン蛋白ゼロ (P0)106 125や P0180 199ペプチド百日咳毒素の注入と組み合わせる補助で配信を使用して比較的耐性の C57BL/6 マウス ラインで EAN の誘導を可能にしました。C57BL/6 株に EAN を誘導する能力により、このマウスの背景に存在する多数の遺伝的ツールの使用とように洗練された病因学とで治療のメカニズムのアクションの尋問形質との組み合わせ。本研究では、c57bl/6 マウスで P0180 199ペプチドを用いた EAN を正常に誘導する単純なアプローチを示しています。我々 はまた、このモデルでは、神経病理学的機能の配列を伴って発生する機能的障害の評価のためのプロトコルを概説します。したがって、このモデルは強力な実験的モデル人間の末梢脱髄性ニューロパチーの病態を研究し、目的を髄修復を促進し、自己免疫の神経損傷に対する保護潜在的な療法の有効性を判断炎。
Introduction
末梢神経障害は起源で遺伝的または後天的のいずれかをすることができます取得したニューロパシー、どちらの代謝、虚血、炎症、または有毒な沈殿を持ちます。これらの疾患も便利、軸索または起源の demyelinative のいずれかに分類されます。最も一般的な脱髄性末梢神経障害、急性炎症性脱髄性多発ニューロパチー (AIDP、ギランバレー症候群、ギランバレー症候群とも呼ばれます) を取得し、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー (CIDP)1,2,3,4;両方は pathogenetically、末梢神経の脱髄を引き起こす、髄鞘に対する自己免疫反応によって特徴付けられます。これらの疾患における活性化 T 細胞は血液神経関門を通過し、PNS 内免疫反応を生成します。神経内マクロファージの活性化、貪食攻撃を介して直接、または麻痺など感覚機能障害5臨床的障害の結果分泌の炎症性メディエーターを介して間接的に脱髄を引き起こします。脱髄軸索は、remyelinated 次の脱髄をする能力を保持しながら検査がよく遅れているまたは恒久的な臨床の主な原因である不完全な不可逆的な損傷は、裸の軸索の感受性の結果障害者。現在、最も効果的な治療法は、免疫調節、しかし多くの場合その有効性にもかかわらず、回復はしばしば遅いと 〜 25% の患者は彼らの生活の質の6を大幅に削減残留の機能的障害を経験 7。
EAN は、貴重な洞察を病態と新規治療薬4を評価する手段を提供している末梢神経障害を脱髄の広く使用されている動物モデルです。このモデルは、種、ウサギなどに誘起することラット、マウス、モルモット、および神経因性抗原接種によって誘導されます。しかし、最終的に成功の EAN 誘導が発生する病気のための適切な免疫反応に依存します。免疫機能で種・種間・ひずみの変化を考えると、抗原とアジュバントの複数の組み合わせは、EAN を正常に誘導するために開発されています。マウスの遺伝学的ツールに関して C57BL/6 は最も広く使用されています。しかし、伝統的な P2 タンパク質ペプチド 57-81 (P257 81) SJL マウスひずみ8の影響を受けやすい病気の結果は、C57BL/6 株の機能障害につながる違法な病因にはできません。幸いにも、感作性パラダイム P0106 125または P0180 199ペプチドを使用して配信補助療法併用百日咳の注入と毒素に活用される高度な遺伝的ツールを有効にするこの障壁を克服することができます、EAN マウスモデル。
ここでは、簡便な c57bl/6 マウスに EAN の誘導が表示されます。さらに、病気に関連付けられている機能と神経病理学的赤字を評価する包括的な詳細なアプローチを提供しています。P0180-199ペプチド9は、P057 81代替10優先して選ばれました。P0180-199モデル P057 81代替10と比較して少ない重度の臨床症状を生成する記載されている、したがって潜在的の導入に耐えられる可能性は劇物の遺伝的摂動 (浸透圧ポンプ注入) などの手術から回復、トレッドミル歩行機能4のテストを受けやすいです。ただし、トレッドミル歩行機能検査と組織のプロトコルがここで説明した簡単に適用でした P057 81誘起変形の疾患を勉強しています。
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Protocol
ここで説明したすべての手順 Florey 研究所神経科学と精神的健康 (メルボルン脳中心部) 動物倫理委員会で承認されて、科学的研究の動物の使用のためオーストラリアのコード練習に従う目的.
1。 EAN 誘導
注: EAN は 6-8 週間の間高齢者男性の c57bl/6 マウスで正常に誘起すること。誘導のプロトコルは、合計 9 日間です。0 日は、最初の予防接種の日を指します。このプロトコルのため麻酔注射を行った (1.1.2 以下の手順を参照してください).
- 日-1:
- 百日咳毒素を準備 1.6 μ g/mL 滅菌 0.1 M マウス等張性リン酸を使用して (材料の表 を参照) 溶液緩衝生理食塩水 (MT PBS).
- とイソフルレン anesthetization:
- anesthetization 室でマウス (C57BL/6、男性、6-8 週間) を置き 1 L/分に酸素の流れを調整
- イソフルラン気化器をオン、anesthetization、および呼吸モニターの 2.5% にそれを調整し、待機、2 分間またはプライマリ反射 (角膜と後肢骨格筋) までは、もはや応答
- Anesthetization 室からマウスを削除し、250 μ L の 30 1/2 G 針で 0.5 mL シリンジを使用して腹腔注射を介して上記の百日咳毒素ソリューションを管理します 。
- 予防接種の注射接種の準備:
- 準備 ソリューション A P0 180 199 ペプチドの 2 mg/mL の溶液を使用する (と > 98% の高純度、シーケンス S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) 0.9% 生理食塩水中で 。
- 準備 ソリューション B 結核 菌 20 mg/mL の溶液を使用して (材料の表 を参照してください) フロイントの ' s 完全アジュバント (FCA で構成される: 15% mannide monoolate + パラフィン オイルと 0.5 mg/mL の 85%乾燥殺され、乾燥した 酪酸菌結核菌 M) の 。
- 、注入するため最終接種するビード ・ ビーターでソリューション A と B の等しいボリューム部分を組み合わせるし、室温で 1 分最大速度でそれらをミックスします
。 注: A と B のソリューションことがあります在庫として保管 1 ヶ月の最大のための 4 ° C で保存、マウス注入の日に結合された最終的な接種をたて準備しなければなりません 。
- 0 の日に管理 50 μ L 接種 (準備手順 1.1.4 に示した) の皮下注射器 23 G 針を使用して経由でマウスにします
。 注: 注射に使用される肩甲骨の間または後肢と尾の間尾背 。
- 日 1 には (MT-PBS) 内 1.2 μ g/mL の百日咳毒素ソリューションを行い 30 1/2 G 針で 0.5 mL シリンジを使用して i. p. 注入を介してマウスに 250 μ L を管理します 。
- の日 3、繰り返しステップ上記 1.3.
注: 在庫ソリューション A と B が成って、1 ヶ月の最大のための 4 ° C で保存します。ただし、在庫ソリューション A と B を組み合わせることによって生成された最終の注射接種は注射の日に行う必要があります 。
- 8 日管理 50 μ L 接種 (準備手順 1.1.4 に示した) の皮下注射を介してマウスに (上記 1.2 のステップを参照)、ステップ 1.2 (動物) と同様に同じ注射部位の
2 臨床得点
- 毎日開始 0 日目にうちの臨床スコアを実行します。 。
- は、各マウスに 0、1、2、3、または 4 基準によると 4 のスコアを与えます。EAN 臨床スコアの 表 1 を参照してください
。 注: 一貫性を保つのための努力すべきである同時にマウスをスコアに毎日同じ研究者によってします 。
3。関数評価をモーター
注: 動物の同じコホート臨床スコアと並行して運動のパフォーマンスを評価します。運動機能評価装置は、歩行機能のイメージング システム (材料の表 を参照してください) がインストールいることコンピューターに接続する必要があります。評価されるすべてのマウスに EAN 誘導する前に実行中のタスクに慣れる必要があることをお勧めします。これを行うには、練習走行 (マウスあたり 2 テスト実行) 疾患誘導 (日-3) の前に 3 日間実行します
。- 運動機能評価装置と光ボタンのスイッチをオンにします 。
- 首筋マウスしっかりとしっぽを押しながら赤インクを入れた容器にそれを下げることによってその足をインクと
。 注: この手順は C57BL/6 株、白衣の色を持つマウス株が使用されている場合はスキップできます 。
- ウォーキングのコンパートメントにマウスを置きますと 15 cm でトレッドミルの速度を設定/秒
- トレッドミルとクリックをオン、" 記録 " イメージング システム歩行機能を使用してマウスの実行中の動きをキャプチャするボタン (材料の表 を参照してください).
- タイマーを使用し、36 の各実行を測定 s。36 s があり、録音を停止、停止、トレッドミル後
。 注: この 36 秒間隔の実行中のタスクを正常に完了できないマウス失敗したと見なされます 。
- 指定したフォルダーにビデオ ファイルを保存します 。
- は、評価される各マウスの上記手順を繰り返します。ごとに 3 日間同じの実行中のタスクにマウスをテストします 。
- 歩行関数パラメーター (材料の表 を参照) のソフトウェアを使用して編集されたビデオ ファイルを分析します
。 メモ: 異なる運動パラメーターを分析する方法の詳細について異なるソフトウェア間でだから、製造元を参照してください ' 解析の前に s 命令。軸索の組織学的証拠を得るために、免疫組織化学または電子顕微鏡、動物、任意段階ポスト運動機能評価における特定の目的に応じて研究組織を取ることができるのいずれかを介して髄損傷 。
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Representative Results
P0180 199ペプチド誘導 EAN C57BL/6 マウスつながる相性疾患臨床スコア 25 dpi から最初の予防接種 (dpi)、および最大スコアの重大度を観察 6 日後から発症後いくつかの臨床スコア 40 dpi から改善期間 (図 1)4,9。歩行機能面でマウスは 6 dpi として早めに単純な実行中のタスクに失敗して 35 dpi のマウスでタスクを実行する単純なトレッドミルを完了する少し容量を持ってし始めるし、能力でも 55 dpi4 (図 1) を実行しているが改善しません。マウスは徐々 に時間をかけて実行中のタスクを実行する能力の低下した EAN が誘導。タスクの失敗を実行するトレッドミル走病4の期間にわたって解決しないキー機能赤字の拡大、後肢の歩行だけでなく、マウスの 80% で観察されます。
P0180 199のいくつか主要な神経病理学的機能による EAN があります: 髄鞘の損傷軸索のストレス高められたノードの幅とパラノード構造への損傷。坐骨神経から半薄いセクションの検討では、年齢をマッチさせた健常者 (図 2 a) から坐骨神経と比較して脱髄 (図 2 b, 矢印) の領域を明らかにします。重要なは、坐骨神経の半薄いセクション光顕4ハイパワーでイメージからキャプチャしたイメージから G 比を得ることが可能です。ただし、dysmyelinaton、ミエリン ラメラへの損傷など神経病理学的特徴を識別するために必要な高電力透過電子顕微鏡 (TEM) 像とミトコンドリアの膨潤など軸索の兆候のストレス (はみだしと稜や部分的または全体の cristolysis の歪み) (図 2-2 D)。軸索応力 (図 2-2D) の微細構造の証拠に一貫した、P0180 199誘導 EAN モデルも劇的に上昇の β-アミロイド前駆体によって示される急性の軸索損傷を表示します。坐骨神経 (図 3 a) のタンパク質 (APP) の式です。年齢をマッチさせた健常者組織 (図 3 a) でこれを見られない。ノードと、paranodes での神経病理学的変化は、GBS; にも記載されています。特に、アマン バリアント11,12。私たち EAN マウスモデルのノードと、paranode への影響の拡大が追加神経病理学的機能であることを識別します。 P0 の180 199誘導 EAN (図 3 b)。
図 1: EAN 誘導パラダイム、臨床の概略評価・実行能力をスコアには EAN 。C57bl/6 マウスのプロトコルの EAN 誘導の概要 (a)、期待される臨床スコアおよび (C) (B) の回路図を 6-8 週齢から開始実行時病コース (参考資料4を参照してください)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: EAN がマウス髄鞘の損失、髄損傷軸索のストレスの兆候を表示します。(A) A 明視野画像 (下 100 倍) 年齢をマッチさせた健常者から坐骨神経の厚切切片から撮影します。EAN の 55 日で誘発されるマウスから坐骨神経の厚切切片から撮影した (B) A 明視野画像 (下 100 倍) はポスト最初の予防接種 (dpi) です。髄鞘に囲まれて薄く有髄軸索 (矢印) が不足している領域を示す検査。これは高齢者をマッチさせた健常者 (A を参照) から得られる組織で観察されなかった。(C) A 代表的な電子顕微鏡撮影した画像 (下 5,000 X 倍率) fromsciatic 神経パネル B 示すミエリン病理学 (開矢印)、軸索はストレス (55 dpi で腫れのミトコンドリアを示すバインド広場) から。(D) (境界ボックス c) ハイパワー TEM 像軸索を示しているデモの腫れミトコンドリア ストレス (矢印) にこれはないから年齢をマッチさせた健常者 (データは示されていない)。スケール バー = 10 μ m (a, B)、および 500 nm (C, D)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 軸索ストレスとリンパ節の病理は、P0180 199の機能による EAN 。(A) 単一の平面共焦点 (下で 40 倍の倍率) 撮影した画像 55 dpi で坐骨神経を介して。EAN マウスから組織は劇的に高いアプリ式軸索ストレスの β III チューブリン (神経細胞マーカー) を示す兆候と共局在を表示します。(B) ハイパワー Z 予測 (100 倍) paranodes 坐骨神経のセクションで Caspr に対する抗体で染色の。EAN マウスからノード、ノードの拡大を示す隣接する paranodes 間増加の距離があります。さらに、paranode 構造体への影響などのリンパ節の病理が EAN マウスで観察することができますにはない年齢をマッチさせた健常者から。スケール バー = 10 μ m (A) と (B) の 5 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| スコア | 基準 | メモおよびコメントが評価基準の |
| 0 | 通常のマウス | |
| 1 | 以下の活気やせっけんの泡 | これはマウスは通常最初一日 5 記事予防接種から減らされた活動の兆しを見せ、通常処理と応答の評価は |
| 2 | 尾麻痺または | 尾麻痺 (尾にフリック) 尾ストローク テストによって評価されます。 |
| 軽度の四肢麻痺 | 軽度の四肢麻痺とは、平らな面の上を歩くとき、マウスは地面に彼らの腹をドラッグ | |
| 3 | 麻痺 + 軽度の四肢麻痺の尾または | 軽度の運動失調は、通常の歩行の難しさとして評価されます。 |
| 尾麻痺 + 軽度の運動失調や | ||
| 軽度の四肢麻痺 + 軽度の運動失調 | ||
| 4 | 重度運動失調 | 重度運動失調が後方の非定型によって識別されると共に歩いて、四肢麻痺、軽度の四肢麻痺、または尾麻痺 |
表 1: EAN 臨床スコア パラダイムです。
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Discussion
このレポートでは、誘発 EAN c57bl/6 マウスで P0180 199ペプチドを用いた、EAN がマウスのキー神経病理学的および機能欠損の定量化を可能にする簡単な方法について説明します。ここで記述されている EAN 誘導プロトコルは予防接種の注射を実行しながら麻酔の使用異なるです。イソフルラン麻酔の使用は、接種量が最小限のエラーと、動物へのストレスを目的の場所に皮下に注射されるように能力を大きく高めます。
マウスは、六つの dpi4 EAN 誘導のこのメソッドを使用してから病気の臨床徴候を表示する開始されます。ただし、発症の臨床スコアによって測定される以前 〜 10 dpi9,10から発生する報告されています。この病気発症の臨床スコアによって決定されるの違いは、さまざまな臨床スコア基準により部分的になる可能性が、というよりも EAN 誘導のため接種の異なるアジュバントの使用によって説明されます。このプロトコルは、 M. 酪酸菌、結核と補われるを含むフロイントの完全アジュバントを使用します。他の研究は、結核予防接種の P0 の180 199ペプチド9,10を含む注射接種のみを添加したフロイント アジュバントを使用します。
このプロトコルでは百日咳毒素 i. p. 注入を介して提供することは静脈に優先してお勧めします。 尾静脈注射。百日咳配信のモードは病気の発症や進行の4、大きく変わりませんが、静脈尾静脈ではなく、i. p. ルート経由で提供を選択は、リスク軽減、緩和の試みによって動機づけられていることが示されている、オペレーティング エラーのチャンス。頻繁に尾静脈点滴注射は、等量の注射と比較して技術的により困難します。アジュバントとして百日咳毒素の使用誘導 EAN P0180 199ペプチド9を使用する必要がある以前示されています。興味深いことに、前作は、に対してこのメソッドに記載されている百日咳の線量を半減が十分臨床スコア、神経病理学、および4を実行しているトレッドミル中に広がる歩行による違法な EAN を示しています。しかし、百日咳毒素の使用量を減少で EAN 中誘導大幅に影響を与える実行能力とマウスを実行大幅 EAN がこのメソッドに記載されている半分の百日咳用量で誘導されるときにタスクを実行するトレッドミルで良い4。
この P0180 199誘発ペプチド EAN モデルにみられる運動障害が伴うし、強力な神経病理学的証拠によってサポートされています。以前は、髄鞘の損傷の程度を定量化が EAN 誘導中に百日咳毒素の投与量を半減に起因する疾患の重症度の変化を検出する十分な機密性の高いことが実証されています。ここでは、軸索のストレスなどノード/パラノード構造の中断を EAN の他の特徴が識別され、EAN を誘発 P0180 199の量的な神経病理学的マーカーの一連の結果します。これにより神経病理学の慎重な検査に、病気プロセス、または新規の治療薬の有効性を評価するとき。興奮して、これらの神経病理学的評価はより深い洞察力と神経病理学と EAN のこのモデルの特徴である機能障害との関係のよりよい理解を提供するために入札で機能的な読み出しに相関があります。神経病理学的解析と本研究で用いられる歩行機能検査に加え神経伝導速度測定などの他の機能の評価が完全に治療を使用しての関数の結果をキャプチャするために提案されています。このモデル。
EAN は、末梢脱髄と坐骨神経と馬尾されて最もよく調査した末梢神経の検査を検討する強力で一般的に使用される実験的モデルです。EAN の主な利点は、神経保護と髄鞘修理臨床的観点からの分析ができるように、再現性や定量化が可能なモーター赤字になることです。さらに、ミエリン障害は急性かつ再現性髄鞘と軸索損傷の病理組織学的観点からの詳細な分析ができるようにです。
EAN モデル、末梢神経障害を脱髄を調査するエキサイティングな実験的意味が、技術的な課題と同様、潜在的な制限があります。免疫システムと PNS の間の複雑な相互作用を含む人間の末梢神経障害を脱髄性の不均一性の性質を理解することが重要です。現在の課題は 1 つ EAN 動物モデルがないがすべての面を忠実にまねることができます。さらに、病気の重症度と EAN モデルの進行に関する実質的な種間、系統のバリエーションがあります。たとえば、全体の EAN C67/B6 マウスで誘導は EAN がルイス ・ ラット (未発表データ) に誘導されるほどわかった同一系統内にも男女差があります。男性の C57/B6 マウス EAN モデルによる雌マウス、しかし、この男女差を支える正確な理由の 1 つはクリアよりもより再現性のある未発表データを示します。
結論として、我々 は男性の C57/B6 マウスで EAN モデルの堅牢かつ迅速に誘導を可能にするプロトコルを報告しました。臨床スコアと神経病理学的研究と運動機能評価を組み合わせること髄末梢神経障害臨床的および病理学的視点から研究するため戦略的なツールを提供します。重要なは、トランスジェニック マウスの手法を用いた末梢神経髄鞘修理を対象とする治療法のメカニズムに関する今後の研究を推進しています。
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Disclosures
著者はこの作品について利益相反があります。
Acknowledgments
武神は NHMRC ピートドハーティと多発性硬化症研究オーストラリア (MSRA) 初期キャリアの仲間です。JLF は、MSRA ポスドク研究員プログラムによってサポートされます。この仕事に支えられたオーストラリアの国民健康と医学研究評議会 (NHMRC) プロジェクトは JX に #APP1058647 を与えます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
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