C57BL/6 farelerde deneysel otoimmün nörite fonksiyonel ve Neuropathological değerlendirmeler için ikna etmek için basit bir yaklaşım
Summary
Bu raporu başarıyla miyelin protein kullanarak deneysel otoimmün nörite (EAN) sıfır (P0)180-199 peptid Freund’ın tam adjuvan ve boğmaca toksin ile birlikte ikna etmek için basit bir yaklaşım özetlenmektedir. Biz doğru bir şekilde işlevsel açıkları ve bu EAN meydana nevropatoloji ölçüde değerlendirirken yetenekli sofistike bir paradigma mevcut.
Abstract
Deneysel otoimmün nörite (EAN) otoimmün periferik demiyelinizan hastalıklar iyi takdir bir deneysel modeldir. EAN hastalığı inflamatuar saldırının periferik sinir sistemi (PNS) bileşenlerinin doğru yönlendirmek için fare ile Nörojenik peptidler immunizing tarafından indüklenen olduğu. Son gelişmeler EAN indüksiyon miyelin protein sıfır (P0)106-125 veya P0180-199 peptidler boğmaca toksin enjeksiyonu ile birlikte adjuvan teslim kullanarak nispeten dayanıklı C57BL/6 fare çizgi etkinleştirdiniz. EAN C57BL/6 zorlanma ikna yeteneği bu fare arka plan üzerinde mevcut çok sayıda genetik araçları kullanmak için izin verir ve böylece hastalığın patogenezinde, sofistike çalışma ve sorgulama roman therapeutics mekanik eylem sağlar transgenik yaklaşımlar ile birlikte. Bu çalışmada, EAN C57BL/6 farelerde P0180-199 peptid kullanarak başarılı bir şekilde ikna etmek için basit bir yaklaşım göstermektedir. Ayrıca bu modelde, neuropathological özellikleri dizesi ile birlikte ortaya çıkan fonksiyonel açıkları değerlendirilmesi için bir protokol anahat. Böylece, insan periferik demiyelinizan neuropathies patogenezi okumaya ve miyelin onarım teşvik ve otoimmün sinir hasarına karşı korumak amacı potansiyel tedavilerin etkinliğini belirlemek için güçlü bir deneme modeli bu modelidir nörite.
Introduction
Periferik neuropathies genetik kökenli veya edinsel, olabilir ya da metabolik, iskemik, enflamatuar veya toksik precipitants ile elde edilen neuropathies sahip. Bu hastalıklar da yararlı aksonal ya da demyelinative kökenli olarak sınıflandırılır. En yaygın alınan periferik neuropathies olan akut inflamatuvar demiyelinizan polinöropati (AIDP, GBS Guillain-Barré Sendromu olarak da bilinir) demiyelinizan ve kronik inflamatuvar demiyelinizan polinöropati (CIDP)1, 2 , 3 , 4; her ikisi de pathogenetically neden demiyelinizasyon periferik sinirlerin miyelin kılıf karşı yönettiği bir otoimmün reaksiyon ile karakterizedir. Bu hastalıklarda aktive T hücreleri kan sinir bariyerini çapraz ve PNS içinde bir bağışıklık reaksiyon oluşturur. O zaman makrofajlar içinde sinir aktivasyonu demiyelinizasyon fagositik saldırı üzerinden doğrudan veya dolaylı olarak felç ve duyusal disfonksiyon5gibi klinik Engelli sonuçlanan salgılanan inflamatuar aracılar üzerinden neden olur. Demyelinated akson demiyelinizasyon takip remyelinated yeteneği korumak, ancak remyelination kez ertelendiği veya eksik, geri dönüşümsüz hasara için çıplak aksonlar duyarlılık içinde kaynaklanan kalıcı klinik en önemli nedeni olduğu sakatlık. Şu anda, en etkili tedavi immunomodulatory, ama onların yeterlik rağmen birçok durumda kurtarma genellikle yavaş ve ~ % 25 hastaların önemli ölçüde azaltmak onların yaşam kalitesi6artık işlevsel açıkları yaşayacaksınız, 7.
EAN, değerli yorumlara Patogenez ve roman terapötik ajanlar4değerlendirmek için bir araç sağlamıştır periferik nöropati demiyelinizan yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelidir. Bu model tavşanlar gibi farklı türlerin indüklenen sıçanlar, fareler ve eskiden şiling şimdi pigs ve bağışıklama Nörojenik antijenleri ile tarafından indüklenen. Ancak, sonuçta başarılı EAN indüksiyon gerçekleşmesi hastalığı için uygun bir bağışıklık yanıtı bağlıdır. Tür (ve arası species/zorlanma) varyasyonları bağışıklık fonksiyonu göz önüne alındığında, Çoklu kombinasyonları antijenleri ve adjuvan başarıyla EAN ikna etmek için geliştirilmiştir. Fare genetik araçları açısından C57BL/6 en çok kullanılan olduğunu; Ancak, geleneksel P2 protein peptid 57-81 (P257-81) duyarlı SJL fare zorlanma8 hastalığında sonuçlanan yasadışı patogenezinde C57BL/6 gerginlik içinde işlevsel açıkları önde gelen değiştiremiyor. Neyse ki, sensitizasyon paradigmalar P0106-125 veya P0180-199 peptidler, kullanarak teslim adjuvan kombine boğmaca enjeksiyon ile toksin içinde kullanılmak üzere Gelişmiş genetik araçları etkinleştirme Bu bariyer üstesinden gelebilir fare EAN modeli.
Burada, EAN indüksiyon C57BL/6 farelerde için basit bir yöntem sunulur. Ayrıca, kapsamlı ve detaylı bir yaklaşım hastalığı ile ilişkili işlevsel ve neuropathological açıkları değerlendirileceği tarafından sağlanır. P0180–199 peptid9 P057-81 alternatif10tercih seçildi. P0180–199 modeli P057-81 alternatif10ile karşılaştırıldığında daha az şiddetli klinik belirtiler üretmek için açıklanan ve bu nedenle potansiyel olarak getirilmesi dayanacak şekilde yüksektir zararlı genetik tedirginlikler, cerrahi işlemler (örneğin, ozmotik pompa implantasyon) kurtarmak ve4test koşu bandı yürüyüş işleve mükellef. Ancak, koşu bandı yürüyüş fonksiyon testleri ve histolojik protokolleri burada açıklanan kolayca bir P0 indüklenen57-81 değişken hastalığında okurken uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu raporu C57BL/6 farelerde P0180-199 peptid kullanarak, anahtar neuropathological ve fonksiyonel açıkları EAN ile indüklenen farelerde miktar etkinleştirme EAN ikna etmek için basit bir yöntem özetliyor. Burada açıklanan EAN indüksiyon Protokolü bağışıklama enjeksiyonları gerçekleştirirken anestezi kullanımı farklıdır. İsoflurane anestezi kullanımını büyük ölçüde inoculum hacmi subkutan istenilen yere en az hata ve stres hayvanlara enjekte edilir emin olmak için yeteneğini ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DGG bir NHMRC Peter Doherty ve Multipl skleroz araştırma Avustralya (MSRA) erken kariyer adam var. JLF bir MSRA doktora sonrası bursu tarafından desteklenir. Bu eser Avustralya Ulusal Sağlık tarafından desteklenen ve tıbbi araştırma Konseyi (NHMRC) projesi hibe #APP1058647 JX için.
Materials
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
- Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
- Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
- Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
- Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
- Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy–update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
- Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
- Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
- Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
- Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
- Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
- Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).
