기능과 Neuropathological 평가 대 한 C57BL/6 쥐에 실험 자가 면역 신경 염을 유발 하는 간단한 방법
Summary
이 보고서는 성공적으로 유도 실험 자가 면역 신경 염 (EAN) myelin 단백질을 사용 하 여 0 (P0)180-199 펩타이드 Freund의 완전 한 보조 및 백 일 해 독 소와 함께 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 우리는 정확 하 게 기능적인 적자와이 상품에서 발생 하는 neuropathology의 정도 평가 정교한 패러다임 제시.
Abstract
실험적인 자기 면역 신경 염 (EAN) 자기 면역 주변 demyelinating 질병의 잘 평가 실험 모델 이다. EAN 질환 말 초 신 경계 (PNS)의 구성 요소에 대 한 선 동적인 공격을 직접 neurogenic 펩 티 드와 마우스를 면역에 의해 유발 됩니다. 최근 발전은 myelin 단백질 제로 (P0)106-125 또는 P0180-199 펩 티 드 백 일 해 독 소의 주사 함께 보조 제공을 사용 하 여 상대적으로 내성 C57BL/6 마우스 라인에서 EAN의 유도 활성화 했습니다. C57BL/6 스트레인에 EAN을 유도 하는 능력이 마우스 배경에 존재 하는 수많은 유전 도구 사용에 대 한 허용 하 고 따라서 질병 병의 정교한 연구 및 심문에 새로운 치료제의 기계 작업의 수 유전자 변형 접근 조합입니다. 이 연구에서는 EAN C57BL/6 쥐에 P0180-199 펩 티 드를 사용 하 여 성공적으로 유도 하는 간단한 방법을 보여 줍니다. 우리는 또한 neuropathological 기능의 배열과 함께,이 모델에서 발생 하는 기능적인 적자의 평가 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 따라서,이 모델은 인간의 주변 demyelinating neuropathies의 병 인을 공부 하 고 myelin 복구를 촉진 하 고 면역에 신경 손상 으로부터 보호 하는 것을 목표로 하는 잠재적인 치료의 효능을 결정 하는 강력한 실험 모델 신경 염입니다.
Introduction
주변 neuropathies 일 수 있다 근원에서 유전 인수, 인수 neuropathies 있는 어느 대사, ischaemic, 염증, 또는 독성 침. 이 질병도 유용 하 게 axonal 또는 근원에서 demyelinative로 분류 됩니다. 가장 일반적인 주변 neuropathies는 급성 염증 성 Demyelinating 증 (AIDP, Guillain-바레 증후군, GBS 라고도) demyelinating 인수 및 만성 염증 Demyelinating 증 (CIDP)1, 2 , 3 , 4. 둘 다 pathogenetically의 주변 신경 demyelination 일으키는 myelin 칼 집에 대 한 지시 자가 면역 반응에 의해 특징 이다. 이 질병에서 활성화 된 T 세포 혈액 신경 방 벽을 교차 하 고 PNS 내 면역 반응을 생성. 다음은 신경 내에서 대 식 세포의 활성화 demyelination phagocytic 공격을 통해 직접 또는 간접적으로 통해 분 비 염증 성 중재자, 마비 및 감각 부전5등 임상 장애의 결과로 발생 합니다. Demyelinated 축 삭 demyelination 다음 remyelinated 수 있는 능력을 유지 하는 동안 remyelination 자주 지연 또는 불완전, 돌이킬 수 없는 손상을, 벌 거 벗은 axons의 민감성에 따른 임상 영구의 주요 원인 장애입니다. 현재 가장 효과적인 치료는 immunomodulatory, 하지만 그들의 효 험에도 불구 하 고 많은 경우에는 복구는 종종 느린 고 25% 환자 크게 줄일 그들의 삶의 질6, 잔여 기능적인 적자를 경험할 것 이다 7.
EAN demyelinating pathogenesis 및 비 발한 치료 대리인4를 평가 하는 수단으로 귀중 한 통찰력을 제공 하고있다 주변 신경 병의 널리 사용 되는 동물 모델 이다. 이 모델은 토끼, 다른 종에서 유도 될 수 있다 쥐, 쥐 및 기니 피그와 neurogenic 항 원 가진 면역에 의해 유발 됩니다. 그러나, 궁극적으로 성공적인 EAN 유도 발생 하는 질병에 대 한 적절 한 면역 반응에 따라 다릅니다. 면역 기능에 종 (및 남북 species/스트레인) 변화를 감안할 때, 항 원 및 adjuvants의 여러 조합은 성공적으로 EAN을 유도 하기 위해 개발 되었습니다. Murine 유전 도구 점에서 C57BL/6은 가장 널리 사용 되 고; 그러나, 전통적인 P2 단백질 펩타이드 57-81 (P257-81) 취약 SJL 마우스 스트레인8 질병에서 발생 하는 불법 pathogenesis C57BL/6 스트레인에 기능적인 적자를 선도를 수 없습니다. 보조 결합에 민감 화 패러다임 P0106-125 또는 P0180-199 펩 티 드를 사용 하 여 전달 하는 다행히도, 백 일 해 주사와 함께 독 소 정교한 유전자 도구에 활용 될 수 있도록이 장애물을 극복할 수 있는 murine EAN 모델입니다.
여기, C57BL/6 쥐에 EAN의 감 응 작용을 위한 간단한 방법을 제시 합니다. 또한, 질병과 관련 된 기능 및 neuropathological 적자를 평가 하는 포괄적인 상세한 접근 제공 됩니다. P0180–199 펩 티 드9 P057-81 대체10우선 선정 되었다. P0180–199 모델 생산 P057-81 대체10에 비해 덜 심각한 임상 증상을 설명 및의 소개를 잠재적으로 견딜 것 이므로 해로운 유전자 섭, (와 같은 삼 투 펌프 이식) 수술에서 회복 이며 의무가 디딜 방 아 걸음 걸이 기능 테스트4. 그러나, 디딜 방 아 걸음 걸이 기능 테스트 및 여기서 설명 하는 조직학 프로토콜 수 쉽게 적용할 P057-81 유발 변종에 질병을 공부 하는 때.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 보고서는 EAN C57BL/6 마우스에 P0180-199 펩 티 드를 사용 하 여, EAN으로 유도 된 쥐에 있는 주요 neuropathological 및 기능적인 적자의 정량화를 활성화를 유도 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 여기에 설명 된 EAN 유도 프로토콜에 고유한 면역 주사를 수행 하는 동안 마 취를 사용 하 여가입니다. Isoflurane 마 취의 사용은 크게 inoculum의 총 볼륨 최소한의 오류 및 스트레스 동물을 원하는 위치에 피…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DGG은 NHMRC 피터도 허 티와 다 발성 경화 증 연구 호주 (MSRA) 초기 경력 연구원입니다. JLF는 MSRA 박사 친교에 의해 지원 됩니다. 이 작품은 호주 국민 건강에 의해 지원 되었다 고 의료 연구 위원회 (NHMRC) 프로젝트 JX를 #APP1058647을 부여 합니다.
Materials
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
- Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
- Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
- Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
- Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
- Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy–update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
- Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
- Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
- Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
- Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
- Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
- Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).
