Summary
이 보고서는 성공적으로 유도 실험 자가 면역 신경 염 (EAN) myelin 단백질을 사용 하 여 0 (P0)180-199 펩타이드 Freund의 완전 한 보조 및 백 일 해 독 소와 함께 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 우리는 정확 하 게 기능적인 적자와이 상품에서 발생 하는 neuropathology의 정도 평가 정교한 패러다임 제시.
Abstract
실험적인 자기 면역 신경 염 (EAN) 자기 면역 주변 demyelinating 질병의 잘 평가 실험 모델 이다. EAN 질환 말 초 신 경계 (PNS)의 구성 요소에 대 한 선 동적인 공격을 직접 neurogenic 펩 티 드와 마우스를 면역에 의해 유발 됩니다. 최근 발전은 myelin 단백질 제로 (P0)106-125 또는 P0180-199 펩 티 드 백 일 해 독 소의 주사 함께 보조 제공을 사용 하 여 상대적으로 내성 C57BL/6 마우스 라인에서 EAN의 유도 활성화 했습니다. C57BL/6 스트레인에 EAN을 유도 하는 능력이 마우스 배경에 존재 하는 수많은 유전 도구 사용에 대 한 허용 하 고 따라서 질병 병의 정교한 연구 및 심문에 새로운 치료제의 기계 작업의 수 유전자 변형 접근 조합입니다. 이 연구에서는 EAN C57BL/6 쥐에 P0180-199 펩 티 드를 사용 하 여 성공적으로 유도 하는 간단한 방법을 보여 줍니다. 우리는 또한 neuropathological 기능의 배열과 함께,이 모델에서 발생 하는 기능적인 적자의 평가 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 따라서,이 모델은 인간의 주변 demyelinating neuropathies의 병 인을 공부 하 고 myelin 복구를 촉진 하 고 면역에 신경 손상 으로부터 보호 하는 것을 목표로 하는 잠재적인 치료의 효능을 결정 하는 강력한 실험 모델 신경 염입니다.
Introduction
주변 neuropathies 일 수 있다 근원에서 유전 인수, 인수 neuropathies 있는 어느 대사, ischaemic, 염증, 또는 독성 침. 이 질병도 유용 하 게 axonal 또는 근원에서 demyelinative로 분류 됩니다. 가장 일반적인 주변 neuropathies는 급성 염증 성 Demyelinating 증 (AIDP, Guillain-바레 증후군, GBS 라고도) demyelinating 인수 및 만성 염증 Demyelinating 증 (CIDP)1, 2 , 3 , 4. 둘 다 pathogenetically의 주변 신경 demyelination 일으키는 myelin 칼 집에 대 한 지시 자가 면역 반응에 의해 특징 이다. 이 질병에서 활성화 된 T 세포 혈액 신경 방 벽을 교차 하 고 PNS 내 면역 반응을 생성. 다음은 신경 내에서 대 식 세포의 활성화 demyelination phagocytic 공격을 통해 직접 또는 간접적으로 통해 분 비 염증 성 중재자, 마비 및 감각 부전5등 임상 장애의 결과로 발생 합니다. Demyelinated 축 삭 demyelination 다음 remyelinated 수 있는 능력을 유지 하는 동안 remyelination 자주 지연 또는 불완전, 돌이킬 수 없는 손상을, 벌 거 벗은 axons의 민감성에 따른 임상 영구의 주요 원인 장애입니다. 현재 가장 효과적인 치료는 immunomodulatory, 하지만 그들의 효 험에도 불구 하 고 많은 경우에는 복구는 종종 느린 고 25% 환자 크게 줄일 그들의 삶의 질6, 잔여 기능적인 적자를 경험할 것 이다 7.
EAN demyelinating pathogenesis 및 비 발한 치료 대리인4를 평가 하는 수단으로 귀중 한 통찰력을 제공 하고있다 주변 신경 병의 널리 사용 되는 동물 모델 이다. 이 모델은 토끼, 다른 종에서 유도 될 수 있다 쥐, 쥐 및 기니 피그와 neurogenic 항 원 가진 면역에 의해 유발 됩니다. 그러나, 궁극적으로 성공적인 EAN 유도 발생 하는 질병에 대 한 적절 한 면역 반응에 따라 다릅니다. 면역 기능에 종 (및 남북 species/스트레인) 변화를 감안할 때, 항 원 및 adjuvants의 여러 조합은 성공적으로 EAN을 유도 하기 위해 개발 되었습니다. Murine 유전 도구 점에서 C57BL/6은 가장 널리 사용 되 고; 그러나, 전통적인 P2 단백질 펩타이드 57-81 (P257-81) 취약 SJL 마우스 스트레인8 질병에서 발생 하는 불법 pathogenesis C57BL/6 스트레인에 기능적인 적자를 선도를 수 없습니다. 보조 결합에 민감 화 패러다임 P0106-125 또는 P0180-199 펩 티 드를 사용 하 여 전달 하는 다행히도, 백 일 해 주사와 함께 독 소 정교한 유전자 도구에 활용 될 수 있도록이 장애물을 극복할 수 있는 murine EAN 모델입니다.
여기, C57BL/6 쥐에 EAN의 감 응 작용을 위한 간단한 방법을 제시 합니다. 또한, 질병과 관련 된 기능 및 neuropathological 적자를 평가 하는 포괄적인 상세한 접근 제공 됩니다. P0180-199 펩 티 드9 P057-81 대체10우선 선정 되었다. P0180-199 모델 생산 P057-81 대체10에 비해 덜 심각한 임상 증상을 설명 및의 소개를 잠재적으로 견딜 것 이므로 해로운 유전자 섭, (와 같은 삼 투 펌프 이식) 수술에서 회복 이며 의무가 디딜 방 아 걸음 걸이 기능 테스트4. 그러나, 디딜 방 아 걸음 걸이 기능 테스트 및 여기서 설명 하는 조직학 프로토콜 수 쉽게 적용할 P057-81 유발 변종에 질병을 공부 하는 때.
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Protocol
여기에서 설명한 모든 절차 Florey 연구소 신경 과학 및 정신 건강 (멜버른 두뇌 센터) 동물 윤리 위원회 승인 했다 고 과학에 대 한 동물의 사용에 대 한 호주 코드 연습을 따라 목적.
1. EAN 유도
참고: EAN 남성 C57BL/6 쥐 세 6-8 주 사이에서 성공적으로 유도 될 수 있다. 유도 프로토콜 총에서 9 일이 걸린다. 0 첫 번째 면역의 날을 말합니다. 이 프로토콜에 대 한 주사 마 취 실시 했다 (단계 1.1.2 아래 참조).
- 일에-1:
- 백 일 해 독 소를 준비 (재료의 표 참조) 솔루션의 1.6 µ g/mL의 멸 균 0.1 m M 마우스 isotonic 인산 염을 사용 하 여 식 염 수 (MT-PBS) 버퍼링.
- Isoflurane와 anesthetization:
- anesthetization 챔버에 마우스 (C57BL/6, 남성, 6-8 주)를 놓고 1 L/분에 산소 흐름을 조정
- Isoflurane 기화 기 설정, anesthetization, 및 호흡 하는 모니터에 대 한 2.5%로 조정 하 고 대기 2 분, 또는 때까지 기본 반사 (각 막 및 뒷 다리)는 더 이상 반응
- Anesthetization 상공에서 마우스를 제거 하 고 0.5 mL 주사기를 사용 하 여 30 1/2 G 바늘으로 복 (i.p.) 주사를 통해 위의 백 일 해 독 소 솔루션의 250 µ L 관리.
- 면역 주사 inoculum 준비:
- P0 180-199 펩 티 드의 2 mg/mL 해결책을 사용 하 여 준비 솔루션 (와 함께 > 98% 순도, 시퀀스 S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) 0.9% 염 분에서.
- 준비 솔루션 B 결핵균의 20 mg/mL 해결책을 사용 하 여 참조 테이블의 재료 Freund에 ' s 완전 한 보조 (FCA, 구성: 15% mannide monoolate + 파라핀 오일 0.5 mg/mL의 85% desiccated 살해와 말린 M 진 균 butyricum)의.
- 주입, 최종 inoculum을 비드 때리는에 해결책 A와 B의 동일 볼륨 부분을 결합 하 고 실내 온도에서 1 분 동안 최대 속도로 혼합.
참고: 솔루션 A와 B 재고 유지 및 수 최대 한 달에 4 ° C에서 저장 된 있지만 결합 된 최종 inoculum 갓 마우스 주입의 일에 대비해 야 합니다.
- Inoculum (준비 단계 1.1.4에서에서 설명)의 50 µ L를 관리 하는 일에 0, 23 G 바늘을 사용 하 여 피하 주사를 통해 마우스에.
참고: 주사 수 수 위에 양 어깨 사이 또는 뒷 다리와 꼬리 사이 꼬리 등. - 하루 1에 1.2 µ g/mL의 백 일 해 독 소 솔루션 (MT-PBS)에서 만들고 i.p. 주입 30 1/2 G 바늘으로 0.5 mL 주사기를 사용 하 여 통해 마우스에 250 µ L 관리.
- 에 3 일, 반복 단계 위의 1.3.
참고: 재고 솔루션 A와 B 구성 고 1 달 최대 4 ˚C에 저장 될 수 있습니다. 그러나, A와 B, 재고 솔루션을 결합 하 여 생산 최종 주사 inoculum 주사의 일에 이루어져야 합니다. - 8 일에 관리 inoculum (준비 단계 1.1.4에서에서 설명)의 50 µ L 피하 주사를 통해 마우스에 (단계 위의 1.2 참조), (각 동물)에 대 한 1.2 단계 에서처럼 동일한 사출 사이트
2. 임상 점수
- 하루 0에 시작 하는 매일 밖으로 임상 점수 수행.
- 각 마우스의 0, 1, 2, 3, 또는 4 4 게시 된 기준 따라 점수를 제공합니다. EAN 임상 점수 표 1을 참조 하십시오.
참고: 일관성을 위해 노력 하 여야 한다 동시에 쥐를 매일 같은 연구원에 의해.
3. 기능 평가 모터
참고: 동물의 동일한 코 호트에 대 한 임상 점수와 병렬로 모터 성능 평가. 모터 기능 평가 기구는 걸음 걸이 기능 이미징 시스템 (재료의 표 참조) 설치 되어 있는지 컴퓨터에 연결 되어야 합니다. 또한 평가 될 모든 쥐를 EAN 유도 전에 실행 중인 작업 익숙해져 한다는 것이 좋습니다. 이렇게 하려면 연습 실행 (마우스 당 2 테스트 실행) 3 일전 질병 유도 (하루-3) 수행 됩니다.
- 모터 기능 평가 장치 및 조명 버튼 스위치 설정.
- 아저씨 마우스 단단히 고 꼬리를 잡고 빨간 잉크 가득 컨테이너에 그것을 낮추는 방법으로 발 잉크.
참고:이 단계는 C57BL/6 스트레인에 대 한 필요 하지만 마우스 스트레인 흰색 코트 색상으로 사용 하는 경우 건너뛸 수 있습니다. - 걷는 구획에 마우스 고 15 cm에서 디딜 방 아의 속도 설정/미
- 디딜 방 아와 클릭은 " 기록 " 이미징 시스템 걸음 걸이 기능을 사용 하 여 마우스의 실행 모션 캡처 버튼 (재료의 표 참조).
- 타이머를 사용 하 고 36 각 실행 측정 s. 36 s, 정지 녹음 및 중지 디딜 방 아 후.
참고: 성공적으로이 36 s 간격에 실행 중인 작업을 완료할 수 없는 쥐 실패 한 것으로 간주 됩니다. - 지정 된 폴더에 비디오 파일을 저장.
- 평가를 각 마우스에 대 한 위의 단계를 반복 합니다. 3 일 마다 같은 실행 작업 마우스 테스트.
- 걸음 걸이 함수 매개 변수 (자료의 표 참조)에 대 한 소프트웨어를 사용 하 여 편집 된 비디오 파일을 분석.
참고: 다른 모터 매개 변수를 분석 하는 방법의 세부 사항을 다 소프트웨어 사이 그렇게 제조 업체를 참조 하십시오 ' 분석 전에 s 지시. Axonal의 조직학 증거를 얻기 위해 immunohistochemistry 또는 전자 현미경 검사 법, 동물 조직 어떤 단계 게시물 모터 기능 평가 특정 목표에 따라 연구에 반입할 수 있습니다 통해 수 초 손상.
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Representative Results
P0180-199 펩 티 드에서 monophasic 질병 임상 점수 C57BL/6 마우스 리드 EAN 유도 첫 예방접종 (dpi), 그리고 최대한 점수 심각도 25에서 관찰은 6 일 게시물에서 발병 뒤 일부 임상 점수 40에서 개선 기간 (그림 1)4,9. 걸음 걸이 기능 측면에서 마우스 빠르면 6 dpi, 간단한 실행 중인 작업에 실패 35 dpi 마우스에 의해 간단한 디딜 방 아 실행 하는 작업을 완료 하는 데 작은 용량을가지고 시작 하 고 55 dpi4 (그림 1) 에서도 능력을 실행에 개선 하지 않으면. 마우스는 EAN 점차적으로 시간이 지남에 실행 작업을 수행 하는 기능에 거부를 유도 한다. 작업 실패 실행 마우스, 하지만이, 뒷 다리 걸음 걸이 질병의4기간 동안 해결 되지 않는 주요 기능 적자 실행 디딜 방 아에 확대 뿐만 아니라 80%에서 관찰 됩니다.
있다 P0180-199 의 몇 가지 주요 neuropathological 기능 유도 EAN:; myelin 칼 집에 손상을 축 삭 스트레스; 증가 노드 너비와 paranodal 구조에 손상을. 좌 골 신경에서 찍은 반 얇은 섹션의 검사 나이 일치 하는 건강 한 컨트롤 (그림 2A)에서 좌 골 신경에 비해 demyelination (그림 2B, 화살표)의 영역을 보여준다. 중요 한 것은, 그것은 좌 골 신경 반 얇은 섹션 가벼운 현미경 검사 법4높은 전력에서 몇 군데에서 캡처한 이미지에서 G-비율을 얻을 수 있습니다. 그러나, 높은 전력 전송 전자 현미경 (TEM) 이미지 dysmyelinaton, myelin 얇은 판자에 손상 같은 특정 neuropathological 기능을 식별 하는 데 필요한 그리고 축 삭의 미토 콘 드리 아 붓기 같은 스트레스 (교란 및 왜곡 cristae의 부분 또는 전체 cristolysis) (-그림 2C2D). 축 삭 스트레스 (그림 2C-2D)의 ultrastructural 증거와 일치, P0180-199 유도 EAN 모델 또한 표시 급성 axonal 손상, 극적으로 상승 된 β 아 밀 로이드 선구자 여 좌 골 신경 (그림 3A)에 단백질 (APP) 식입니다. 이 없는 건강 한 제어 나이 일치 하는 조직 (그림 3A)에서 관찰 됩니다. 노드는 paranodes에서 neuropathological 변화 GBS;에서 잘 문서화 되어 특히, AMAN 변형11,12. 우리의 murine EAN 모델에서 우리는 노드는 paranode 중단의 확대 추가 neuropathological 기능 식별 P0의180-199 유도 EAN (그림 3B).
그림 1: 임상 EAN 유도 패러다임의 도식 표현 EAN 동안 평가, 및 실행 능력을 점수. EAN 유도의 개요 (A) C57BL/6 마우스 프로토콜, 예상된 임상 점수 및 (C) (B)의 회로도와 나이의 6-8 주에서 개시 질병 동안 상영 시간 코스 (참조4참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: myelin 손실, 수 초 손상, 및 축 삭 긴장의 표시를 표시 하는 EAN와 쥐. (A) A 밝은 필드 이미지 (아래 100 배 확대) 나이 일치 하는 건강 한 통제에서 좌 골 신경의 세미 얇은 섹션에서 가져온. (B) A 밝은 필드 이미지 (아래 100 배 확대) 55 일에서 EAN으로 유발 쥐에서 좌 골 신경의 세미 얇은 섹션에서 가져온 첫 번째 접종 (dpi) 게시. Myelin 얇게 myelinated 축 삭 (화살촉)로 둘러싸인 부족 지역 표시 remyelination; 이 아니라 일치 하는 세 건강 한 컨트롤 (참조)에서 얻은 조직에서 관찰 되었다. 패널 B 설명 myelin 병리학 (오픈 화살표) 및 축 삭 스트레스 (55 dpi에서 부 어 미토 콘 드리 아를 나타내는 바인딩 광장)에서 (C) A 대표 전자 현미경 이미지 (아래 5000 X 배율) fromsciatic 신경 (D) (경계 상자 c에서) 높은 전원 가장 이미지는 축 삭의 지표 설명 부 미토 콘 드리 아 (화살표 머리) 스트레스, 그러나 이것은 결 석 나이 일치 하는 건강 한 컨트롤 (데이터 표시 되지 않음). 스케일 바 = 10 µ m (A, B), 및 500 nm (C, D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 축 삭 스트레스와 결핵 병은 P0180-199 의 기능 유도 EAN. (A) 단일 평면 confocal 이미지 (아래 40 배 확대) 55로 좌 골 신경을 통해 촬영. EAN 쥐에서 조직 극적으로 높은 애플 리 케이 션 식 공동 axonal 긴장의 β-III tubulin (뉴런의 마커) 나타내는 표시와 지역화를 표시 합니다. (B) 고성능 Z 계획 (100 배 확대) 좌 골 신경 섹션에 Caspr에 대 한 항 체로 얼룩진 paranodes의. EAN 쥐에서 노드를 나타내는 노드를 확대 하는 인접 한 paranodes 사이 증가 거리가 있다. 더하여, paranode 구조 중단 등 결핵 병 리 EAN 쥐에서 관찰 될 수 있다 그러나 결 석 건강 한 컨트롤 일치 하는 나이에서. 스케일 바 = 10 µ m (A), 및 5 µ m (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 점수 | 기준 | 노트와 평가 기준의 |
| 0 | 일반 마우스 | |
| 1 | 활기찬 또는 lathery | 이 마우스 일반적으로 먼저 표시 주 5 게시물 예방 접종에서에서 감소 활동의 정상적인 처리에 대 한 응답 평가 |
| 2 | 꼬리 paresis 또는 | 꼬리 paresis 꼬리 치기 테스트 (flicking 꼬리)에 의해 평가 됩니다. |
| 온화한 사지 paresis | 온화한 사지 paresis 가리킵니다 때 평평한 표면에 걷는 쥐 지상에 그들의 배를 드래그 | |
| 3 | Paresis + 가벼운 다리 paresis 꼬리 또는 | 가벼운 운동 실 조는 일반 워킹에 어려움으로 평가 |
| 꼬리 paresis + 가벼운 운동 실 조 증 또는 | ||
| 온화한 사지 paresis + 가벼운 운동 실 조 | ||
| 4 | 심한 운동 실 조 | 심한 증 거꾸로 비정형으로 식별 되는 사지 paresis, 가벼운 다리 paresis, 또는 꼬리 paresis 함께 걷기, |
표 1: EAN 임상 점수 패러다임.
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Discussion
이 보고서는 EAN C57BL/6 마우스에 P0180-199 펩 티 드를 사용 하 여, EAN으로 유도 된 쥐에 있는 주요 neuropathological 및 기능적인 적자의 정량화를 활성화를 유도 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 여기에 설명 된 EAN 유도 프로토콜에 고유한 면역 주사를 수행 하는 동안 마 취를 사용 하 여가입니다. Isoflurane 마 취의 사용은 크게 inoculum의 총 볼륨 최소한의 오류 및 스트레스 동물을 원하는 위치에 피하 주입 되도록 기능을 향상 시킵니다.
마우스 6 dpi4 EAN 유도의이 방법을 사용 하 여 질병의 임상 증상을 표시 하기 시작 합니다. 그러나, 임상 평가 점수에 의해 측정 된 질병 발병 이전 ~ 10 dpi9,10에서 발생할 수 보고 되었습니다. 질병 발병 임상 평가 점수에 의해 결정에이 차이 다른 임상 점수 기준으로 인해 부분적으로 될 수 있는, 그것은 더 많은 가능성이 EAN 유도 inoculum 다른 adjuvants의 사용에 의해 설명 했다. 이 프로토콜 M. butyricum, M.결핵 보충 되는 포함 하는 Freund의 완전 한 보조 제를 사용 합니다. 다른 연구는 P0180-199 펩 티 드9,10 예방접종을 포함 하는 주입된 inoculum에 M. 결핵 만 보충 하는 Freund의 보조 제를 사용 합니다.
이 프로토콜에 i.p. 주입을 통해 백 일 해 독 소를 제공 하는 것이 좋습니다 정 맥 (i.v.) 우선 꼬리 정 맥 주입. 그것은 보였다 질병 발병 또는 진행4를 백 일 해 배달의 모드에서 크게 변경 되지 않습니다 하지만 i.v. 꼬리 정 맥, 반대로 i.p. 경로 통해 제공 하는 선택 위험 완화 및 감소 시키는 시도 의해 동기를 오류 운영의 기회입니다. 자주, 꼬리 정 맥 i.v. 주사 동일한 볼륨의 주사에 비해 기술적으로 더 도전입니다. 그것은 이전 보였다는 보조로 백 일 해 독 소의 사용은 P0180-199 펩 티 드9를 사용 하 여 때 EAN을 유도 하는 데 필요한. 흥미롭게도, 이전 작업이이 방법에서 설명 하는 백 일 해의 복용량을 등분 불법 EAN 임상 점수, neuropathology, 그리고 디딜 방 아4를 실행 하는 동안 확대 하는 걸음 걸이 의해 측정에 충분 한지를 보이고 있다. 그러나, 백 일 해 독 소 사용의 복용량을 감소에서 EAN 동안 유도 크게 실행 용량, 영향과 마우스 수행 크게 EAN이이 방법에 설명 된 반 백 복용량으로 유도 하는 경우 작업을 실행 하는 디딜 방 아에 더 나은 4.
모터 적자가 P0180-199 유도 펩타이드 EAN 모델에 동반 하 고 강한 neuropathological 증거에 의해 지원. 이전에, 그것은 myelin 손상의 정도 측정 충분히 민감한 EAN 유도 중 백 일 해 독 소의 복용량을 등분의 결과 질병 심각도 변경 감지 하는 입증 되었습니다. 여기, axonal 스트레스 등 장애 노드/paranodal 구조에 EAN의 다른 특징은 식별, EAN 유도 P0180-199 양적 neuropathological 마커의 제품군에 발생. 질병 과정, 또는 새로운 치료제의 효능을 평가할 때 neuropathology의 더 신중 하 게 시험에 대 한 수 있습니다. Excitingly, 이러한 neuropathological 평가 깊은 통찰력과 neuropathology와 EAN의이 모델의 특징은 함수 적자 사이 관계의 더 나은 이해를 제공 하기 위하여에서 기능 해독에 상관 될 수 있습니다. Neuropathological 분석 및 보 행 기능 시험이이 연구에서, 신경 전도 속도 측정 등 다른 기능 평가 완전히 사용 하는 치료 내정간섭의 함수 결과 캡처하기 위해 제안 이 모델.
EAN 주변 demyelination 그리고 remyelination, 좌 골 신경 및 cauda equina 가장 자주 주변 신경 조사 되 고 검사를 강력 하 고 일반적으로 사용 되 실험 모델입니다. EAN의 주요 장점은 재현 고 정량 모터 적자 되므로 neuroprotection 및 myelin 복구 임상 관점에서의 분석 결과. 또한, 수 초 손상 급성 이며 재현 되므로 수 초 및 histopathological 관점에서 axonal 손상의 상세한 분석.
EAN 모델 demyelinating 주변 신경 병을 조사 하는 흥미로운 실험 평균을 나타내는, 기술적인 도전 뿐만 아니라 잠재적인 한계 있다. 그것은 면역 시스템 및 PNS 사이 복잡 한 상호 작용을 포함 하는 인 간에 있는 주변 신경 demyelinating의 자연에 감사 하는 것이 중요. 현재 문제는 아니 한 EAN 동물 모델 충실 하 게 모든 측면을 모방 수 있습니다. 또한, 질병의 심각도 EAN 모델의 진행에 관한 상당한 간 종 및 간 긴장 변이가 있다. 예를 들어 우리는 EAN 유도 C67/b 6 쥐에 그 전체를는 EAN 루이스 쥐 (되지 않은 데이터)에서 유도 보다 덜 심각한 발견. 같은 변형 내에서 성별 차이입니다. 그러나 게시 되지 않은 데이터 남성 C57/B6 쥐에서 유도 된 EAN 모델 보다 정확한 이유가 성별 차이 underpinning 여성 쥐,,에서 유도 된 것은 분명 더 재현을 보여줍니다.
결론적으로, 우리는 남성 C57/B6 쥐에서 EAN 모델의 강력 하 고 빠른 유도 허용 하는 프로토콜을 보고. 임상 점수와 모터 기능 평가 neuropathological 연구와 임상 및 병 리 학적 관점에서 주변 신경 demyelinating 공부에 대 한 전략적 도구를 제공 합니다. 중요 한 것은, 그것은 주변 신경 myelin 복구 유전자 변형 마우스 접근을 사용 하 여 대상 치료의 메커니즘에 대 한 미래의 연구를 촉진 합니다.
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Disclosures
저자는이 작품에 대 한 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
DGG은 NHMRC 피터도 허 티와 다 발성 경화 증 연구 호주 (MSRA) 초기 경력 연구원입니다. JLF는 MSRA 박사 친교에 의해 지원 됩니다. 이 작품은 호주 국민 건강에 의해 지원 되었다 고 의료 연구 위원회 (NHMRC) 프로젝트 JX를 #APP1058647을 부여 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
- Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
- Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
- Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
- Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
- Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
- Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
- Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
- Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
- Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
- Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
- Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).
