Un approccio semplice per indurre la neurite Autoimmune Sperimentale in topi C57BL/6 per le valutazioni funzionali e Neuropathological
Summary
Questo rapporto descrive un approccio semplice per indurre con successo la neurite autoimmune sperimentale (EAN) utilizzando la proteina della mielina zero (P0)180-199 del peptide in combinazione con adiuvante completo di Freund e tossina della pertosse. Vi presentiamo un paradigma sofisticato in grado di valutare con precisione l’entità dei deficit funzionali e neuropatologia che si verificano in questo EAN.
Abstract
Neurite autoimmune sperimentale (EAN) è un modello sperimentale ben apprezzato delle malattie demielinizzanti periferiche autoimmuni. Malattia EAN è indotto immunizzando topi con peptidi neurogeni di dirigere un attacco infiammatorio verso componenti del sistema nervoso periferico (PNS). Gli avanzamenti recenti hanno permesso l’induzione di EAN nella linea di mouse C57BL/6 relativamente resistente usando la proteina del myelin zero (P0)106-125 o peptidi180-199 P0 consegnati in adiuvante combinato con l’iniezione di tossina della pertosse. La capacità di indurre EAN nel ceppo C57BL/6 consente l’utilizzo di numerosi strumenti genetici che esiste su questo sfondo del mouse e permette così sofisticato studio della patogenesi della malattia e interrogatorio dell’azione meccanicistico di approcci terapeutici in combinazione con approcci transgenici. In questo studio, dimostriamo un approccio semplice per indurre correttamente EAN utilizzando il peptide di180-199 P0 in topi C57BL/6. Abbiamo anche delineare un protocollo per la valutazione dei deficit funzionali che si verificano in questo modello, accompagnato da una serie di caratteristiche neuropathological. Così, questo modello è un potente modello sperimentale per studiare la patogenesi delle neuropatie demielinizzanti periferiche umane e per determinare l’efficacia di potenziali terapie che mirano a promuovere la riparazione della mielina e proteggono da danno del nervo in autoimmune neurite.
Introduction
Neuropatie periferiche possono essere di origine genetica o acquisita, con neuropatie acquisite avendo entrambi metabolica, ischemica, infiammatorie, o tossici precipitanti. Queste malattie sono anche utilmente classificate come assonale o demyelinative in origine. Il più comune acquisita demielinizzante neuropatie periferiche sono la polineuropatia Demyelinating infiammatoria acuta (AIDP, noto anche come sindrome di Guillain-Barré, GBS) e cronica infiammatoria demielinizzante polineuropatia (CIDP)1, 2 , 3 , 4; entrambi sono patogeneticamente caratterizzati da una reazione autoimmune diretta contro la guaina di mielina, che causa demielinizzazione dei nervi periferici. In queste malattie, le cellule di T attivate attraversano la barriera del nervo e generano una reazione immune all’interno il PNS. Attivazione dei macrofagi all’interno del nervo quindi causa demielinizzazione o direttamente tramite attacco fagocitica, oppure indirettamente tramite secrete mediatori infiammatori, con conseguente disabilità clinica come paralisi e disfunzione sensitiva5. Mentre gli assoni demyelinated mantengono la capacità di essere remyelinated seguito demielinizzazione, remyelination è spesso ritardato o incompleta, con conseguente suscettibilità degli assoni nudi a danni irreversibili, che è la causa principale della clinica permanente disabilità. Attualmente, i trattamenti più efficaci sono immunomodulatori, ma nonostante la loro efficacia, in molti casi il recupero è spesso lento e ~ 25% pazienti avvertiranno i deficit funzionali residui che riducono significativamente la loro qualità di vita6, 7.
EAN è un modello animale ampiamente usato di demielinizzanti neuropatia periferica che ha fornito le comprensioni importanti nella patogenesi e un mezzo per valutare nuovi agenti terapeutici4. Questo modello può essere indotta in specie diverse come i conigli, ratti, topi e porcellini d’India e viene indotta tramite immunizzazione con antigeni neurogeni. Tuttavia, l’induzione di EAN successo dipende in ultima analisi su una risposta immunitaria adeguata per la malattia si verifichi. In considerazione delle variazioni di specie (e inter-specie/ceppo) nella funzione immune, molteplici combinazioni di antigeni e adiuvanti sono stati sviluppati per indurre correttamente EAN. In termini di strumenti genetici murini, C57BL/6 è il più ampiamente usato; Tuttavia, il peptide di proteina P2 tradizionale 57-81 (P257-81) che provoca la malattia nel ceppo suscettibili SJL mouse8 è in grado di patogenesi illeciti portando a deficit funzionali nel ceppo C57BL/6. Fortunatamente, paradigmi di sensibilizzazione utilizzando il P0106-125 o P0180-199 peptidi, consegnato in adiuvante combinato con l’iniezione di pertosse tossina può superare questa barriera, abilitazione sofisticati strumenti genetici per essere utilizzato nella modello murino di EAN.
Qui, un metodo semplice per l’induzione di EAN nei topi C57BL/6 è presentato. Inoltre, viene fornito un approccio globale e dettagliato da cui valutare i deficit funzionali e neuropathological associati alla malattia. Il peptide di P0180–199 9 è stato scelto preferenza l’ alternativa1057-81 di P0. Il modello di199 180–P0 è stato descritto per produrre meno gravi segni clinici rispetto con l’ alternativa1057-81 di P0 e rischia pertanto di sostenere l’introduzione di potenzialmente perturbazioni genetiche deleterie, recuperare dalle procedure chirurgiche (ad esempio l’impianto pompa osmotica) ed è favorevole alla prova4funzione di andatura di tapis roulant. Tuttavia, i tapis roulant andatura funzione test e istologici protocolli descritti qui facilmente potrebbero essere applicati quando si studia la malattia in una variante di57-81 indotto P0.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo rapporto descrive un metodo semplice per indurre EAN utilizzando il peptide di180-199 P0 in topi C57BL/6, consentendo la quantificazione dei principali deficit neuropathological e funzionale in topi indotti con EAN. Distinto per il protocollo di induzione di EAN descritto qui è l’uso dell’anestesia durante l’esecuzione le iniezioni di immunizzazione. L’uso dell’anestesia isoflurano migliora notevolmente la capacità di garantire che il volume totale dell’inoculo viene iniettato per via sottocutanea nel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DGG è un NHMRC Peter Doherty e sclerosi multipla ricerca Australia (MSRA) precoce carriera Fellow. JLF è supportato da una borsa di studio post-dottorato di MSRA. Questo lavoro è stato supportato dal Australian National Health e progetto del Consiglio di ricerca medica (NHMRC) concedere #APP1058647 JX.
Materials
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
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