कार्यात्मक और Neuropathological आकलन के लिए C57BL/6 चूहों में प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित न्युरैटिस प्रेरित करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण
Summary
इस रिपोर्ट को सफलतापूर्वक प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित न्युरैटिस (EAN) का उपयोग कर myelin प्रोटीन शूंय (P0)180-199 पेप्टाइड के संयोजन में Freund पूरा सहायक और कुक्कुर विष के साथ प्रेरित करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण की रूपरेखा । हम सही कार्यात्मक घाटे और neuropathology है कि इस EAN में होने की हद तक का आकलन करने में सक्षम एक परिष्कृत प्रतिमान वर्तमान ।
Abstract
प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित न्युरैटिस (EAN) स्व-प्रतिरक्षित परिधीय demyelinating रोगों की एक अच्छी तरह से सराहना की प्रयोगात्मक मॉडल है । EAN रोग परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) के घटकों की ओर एक भड़काऊ हमले को निर्देशित करने के लिए तंत्रिकाजन्य पेप्टाइड्स के साथ immunizing चूहों द्वारा प्रेरित है. हाल के अग्रिमों में EAN के अपेक्षाकृत प्रतिरोधी C57BL/6 myelin प्रोटीन शूंय (P0)106-125 या P0180-199 पेप्टाइड सहायक विष के इंजेक्शन के साथ संयुक्त में दिया का उपयोग कर लाइन में प्रेरण सक्षम है । C57BL/6 तनाव में EAN प्रेरित करने की क्षमता कई आनुवंशिक उपकरण है कि इस माउस पृष्ठभूमि पर मौजूद के उपयोग के लिए अनुमति देता है, और इस तरह रोग रोगजनन और उपंयास चिकित्सीय के यंत्रवत कार्रवाई के पूछताछ के परिष्कृत अध्ययन में अनुमति देता है ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण के साथ संयोजन । इस अध्ययन में, हम सफलतापूर्वक C57BL/6 चूहों में P0180-199 पेप्टाइड का उपयोग करते हुए EAN को प्रेरित करने के लिए एक सरल तरीका प्रदर्शित करते हैं । हम भी neuropathological सुविधाओं की एक सरणी के साथ इस मॉडल में होते हैं कि कार्यात्मक घाटे के आकलन के लिए एक प्रोटोकॉल रूपरेखा. इस प्रकार, इस मॉडल को मानव परिधीय demyelinating न्यूरोपैथी के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक मॉडल है, और myelin मरम्मत को बढ़ावा देने और स्व-प्रतिरक्षित में तंत्रिका क्षति के खिलाफ की रक्षा करने के उद्देश्य है कि संभावित उपचारों की प्रभावकारिता का निर्धारण करने के लिए न्युरैटिस.
Introduction
परिधीय न्यूरोपैथी या तो मूल में आनुवंशिक या प्राप्त कर सकते हैं, या तो चयापचय, ischaemic, भड़काऊ, या विषाक्त precipitants होने का अधिग्रहण न्यूरोपैथी के साथ । इन रोगों को भी उपयोगी मूल में या तो axonal या demyelinative के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं । सबसे आम अधिग्रहीत demyelinating परिधीय न्यूरोपैथी तीव्र सूजन demyelinating (AIDP, भी Guillain-Barré सिंड्रोम, जीबीएस के रूप में जाना जाता है) और जीर्ण सूजन demyelinating (CIDP)1है, 2 , 3 , 4; दोनों pathogenetically myelin म्यान के खिलाफ निर्देशित एक स्व-प्रतिरक्षित प्रतिक्रिया द्वारा विशेषता हैं, परिधीय नसों के ग्रासलेल्या के कारण । इन रोगों में, सक्रिय टी कोशिकाओं रक्त तंत्रिका बाधा पार और पीएन के भीतर एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करते हैं । तंत्रिका के भीतर मैक्रोफेज के सक्रियकरण तो ग्रासलेल्या या तो सीधे phagocytic हमले या परोक्ष रूप से स्रावित भड़काऊ मध्यस्थों के माध्यम से कारण बनता है, ऐसे पक्षाघात और संवेदी रोग के रूप में नैदानिक विकलांग में जिसके परिणामस्वरूप5। जबकि demyelinated axons ग्रासलेल्या निंनलिखित remyelinated होने की क्षमता को बनाए रखने, remyelination अक्सर देरी या अधूरा है, अपरिवर्तनीय क्षति के लिए नग्न axons की संवेदनशीलता में जिसके परिणामस्वरूप, स्थाई नैदानिक का प्रमुख कारण है विकलांगता. वर्तमान में, सबसे प्रभावी उपचार इम्यूनोमॉड्यूलेटरी हैं, लेकिन उनके प्रभावकारिता के बावजूद, कई मामलों में वसूली अक्सर धीमी है और ~ 25% रोगियों अवशिष्ट कार्यात्मक घाटे का अनुभव होगा कि काफी अपने जीवन की गुणवत्ता को कम6, 7.
EAN demyelinating परिधीय न्यूरोपैथी के एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जानवर मॉडल है कि रोगजनन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है और एक उपंयास चिकित्सकीय एजेंटों का आकलन करने का मतलब है4। इस मॉडल खरगोश, चूहों, चूहों, और गिनी सूअरों के रूप में विभिन्न प्रजातियों में प्रेरित किया जा सकता है, और तंत्रिकाजन्य एंटीजन के साथ प्रतिरक्षण द्वारा प्रेरित है. हालांकि, अंततः सफल EAN प्रेरण रोग के लिए एक उपयुक्त प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर निर्भर करता है हो सकता है । प्रजातियों को देखते हुए (और अंतर प्रजातियों/प्रतिरक्षा समारोह में भिन्नता, एंटीजन और adjuvants के कई संयोजन सफलतापूर्वक EAN पैदा करने के लिए विकसित किया गया है. murine आनुवंशिक उपकरण के संदर्भ में, C57BL/6 सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया है; हालांकि, पारंपरिक P2 प्रोटीन पेप्टाइड 57-81 (P257-81) है कि अतिसंवेदनशील SJL माउस तनाव में रोग में परिणाम8 अवैध रोगजनन में असमर्थ है C57BL/6 तनाव में कार्यात्मक घाटे के लिए अग्रणी । सौभाग्य से, संवेदी मानदंड P0106-125 या P0180-199 पेप्टाइड्स का उपयोग कर, कुक्कुर विष के इंजेक्शन के साथ संयुक्त सहायक में दिया इस बाधा को दूर कर सकते हैं, परिष्कृत आनुवंशिक उपकरण को सक्षम करने में उपयोग किया जा करने के लिए murine EAN मॉडेल आहे.
यहां, C57BL/6 चूहों में EAN की प्रेरण के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत किया है । इसके अलावा, एक व्यापक विस्तृत दृष्टिकोण जिसके द्वारा रोग के साथ जुड़े कार्यात्मक और neuropathological घाटे का मूल्यांकन करने के लिए प्रदान की जाती है । P0१८०–१९९ पेप्टाइड9 P057-81 वैकल्पिक10को वरीयता में चुना गया था । P0१८०–१९९ मॉडल P057-81 वैकल्पिक10के साथ तुलना में कम गंभीर नैदानिक संकेत उत्पादन करने के लिए वर्णित किया गया है, और इसलिए संभावित का परिचय झेलने की संभावना है बचके आनुवंशिक perturbations, शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं से पुनर्प्राप्त (जैसे परासरणी पंप आरोपण के रूप में), और ट्रेडमिल चाल समारोह के लिए उत्तरदायी है4परीक्षण. हालांकि, ट्रेडमिल चाल समारोह परीक्षण और ऊतकीय प्रोटोकॉल यहां वर्णित आसानी से लागू किया जा सकता है जब एक P057-81 प्रेरित संस्करण में रोग का अध्ययन ।
Protocol
यहां वर्णित सभी प्रक्रियाओं तंत्रिका विज्ञान और मानसिक स्वास्थ्य (मेलबोर्न ब्रेन सेंटर) पशु नैतिकता समिति के लिए Florey संस्थान द्वारा अनुमोदित और वैज्ञानिक के लिए जानवरों के उपयोग के लिए अभ्यास के ऑस्ट्रेलियाई कोड का पालन कर रहे थे प्रयोजनों के.
1. EAN प्रेरण
नोट: EAN सफलतापूर्वक पुरुष C57BL में प्रेरित किया जा सकता है/6 6-8 सप्ताह के बीच आयु वर्ग के चूहों । प्रेरण प्रोटोकॉल कुल में 9 दिन लगते हैं । 0 दिन पहले प्रतिरक्षण के दिन को संदर्भित करता है । इस प्रोटोकॉल के लिए, इंजेक्शन संज्ञाहरण के तहत आयोजित किया गया & #160;(नीचे दिए गए चरण 1.1.2 देखें). On Day-1: तैयार कुक्कुर विष (देखें Table of सामग्री ) का समाधान १.६ & #181; छ/मिलीलीटर बाँझ ०.१ M माउस-isotonic फॉस्फेट का उपयोग कर (मीट्रिक टन-पंजाबियों). Anesthetization with isoflurane: C57BL कक्ष में माउस (Anesthetization/6, पुरुष, 6-8 सप्ताह) रखें और ऑक्सीजन प्रवाह को समायोजित करने के लिए 1 L/min. isoflurane vaporizer पर बारी, anesthetization के लिए २.५% के लिए इसे समायोजित, और सांस लेने की निगरानी और 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, या जब तक प्राथमिक सजगता (corneal और हिंद अंग) अब उत्तरदायी हैं #160; से माउस को हटा anesthetization कक्ष और प्रशासन २५० & #181; एल के ऊपर कुक्कुर विष समाधान के माध्यम से एक intraperitoneal (आईएफसआई) इंजेक्शन का उपयोग कर एक ०.५ एमएल सिरिंज के साथ एक 30 1/2 जी सुई. प्रतिरक्षण के लिए इंजेक्शन इनोक्युलम तैयार करें: तैयार समाधान A का उपयोग कर 2 mg/मब सॉल्यूशन का P0 180-199 पेप्टाइड (with & #62; ९८% शुद्धता, अनुक्रम s-s-K-r-G-r-Q-T-P-V-l-Y-A-M-l-D-H-s-r-s) में ०.९% खारा. तैयार हल ख का उपयोग कर 20 मिलीग्राम/एमएल माइकोबैक्टीरियम तपेदिक का समाधान (देखें Table of सामग्री ) in Freund & #39; s complete सहायक (FCA, शामिल: 15% mannide monoolate + ८५% आयल आयल तथा ०.५ mg/ च्या शुष्क मारा आणि सूख मी माइकोबैक्टीरियम butyricum ). इंजेक्शन के लिए अंतिम इनोक्युलम बनाने के लिए, एक मनका डिब्बा में समाधान a और B के बराबर मात्रा भागों गठबंधन और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए एक अधिकतम गति से उन्हें मिश्रण. नोट: समाधान a और B को स्टॉक के रूप में रखा जा सकता है और 4 & #176; C को अधिकतम एक माह के लिए रख सकते हैं लेकिन संयुक्त अंतिम इनोक्युलम को माउस इंजेक्शन के दिन नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए. पर दिन 0, प्रशासन ५० & #181; एल के इनोक्युलम (चरण 1.1.4 में उल्लिखित तैयारी) एक चमड़े के नीचे एक 23 जी सुई का उपयोग इंजेक्शन के माध्यम से एक माउस में । नोट: इंजेक्शन कंधे ब्लेड के बीच रखा जा सकता है, या हिंद अंग और caudal पीठ. पर पूंछ के बीच दिन 1 पर , १.२ & #181 के कुक्कुर विष समाधान करना; जी/एमएल (मीट्रिक टन-पंजाब में) और प्रशासन २५० & #181; एल एक आईएफसआई इंजेक्शन के माध्यम से एक ०.५ मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर एक 30 1/2 जी सुई के साथ एक माउस में. 3 दिन पर , दोहराएँ चरण १.३ ऊपर. नोट: स्टॉक समाधान a और B को अधिकतम एक माह के लिए 4 & #730; C पर बनाया और संग्रहित किया जा सकता है । हालांकि, अंतिम इंजेक्शन इनोक्युलम, स्टॉक समाधान A और B के संयोजन द्वारा उत्पादित, इंजेक्शन के दिन पर किया जाना चाहिए. पर 8 दिन, प्रशासन ५० & #181; इनोक्युलम के एल (कदम 1.1.4 में उल्लिखित तैयारी) एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से एक चूहे में (चरण १.२ ऊपर देखें), एक ही इंजेक्शन साइट पर के रूप में चरण १.२ (प्रत्येक जानवर के लिए)
2. नैदानिक स्कोरिंग दिन पर शुरू बाहर नैदानिक स्कोरिंग प्रदर्शन 0. प्रत्येक माउस को प्रकाशित मापदंड के अनुसार 0, 1, 2, 3, या 4 का स्कोर दें 4 . EAN नैदानिक स्कोरिंग के लिए तालिका 1 देखें. नोट: स्थिरता के लिए, एक प्रयास एक ही शोधकर्ता द्वारा दैनिक एक ही समय में चूहों स्कोर करने के लिए किया जाना चाहिए.
3. मोटर फंक्शन असेसमेंट
नोट: मोटर प्रदर्शन समानांतर में पशुओं के समान पलटने के लिए नैदानिक स्कोरिंग के साथ मूल्यांकन किया है. मोटर समारोह मूल्यांकन उपकरण एक कंप्यूटर है कि एक चाल समारोह इमेजिंग प्रणाली है से जुड़ा होना चाहिए (सामग्री के तालिका देखें) स्थापित । यह भी अनुशंसित है कि सभी चूहों का मूल्यांकन किया जाना EAN प्रेरण से पूर्व चल रहे कार्य को आदत किया जाना चाहिए. ऐसा करने के लिए, अभ्यास चलाता है (2 परीक्षण माउस प्रति रन) रोग प्रेरण (दिन 3) से पहले तीन दिन प्रदर्शन कर रहे हैं । मोटर समारोह मूल्यांकन उपकरण पर बारी और प्रकाश बटन पर स्विच । कूड़ा माउस दृढ़ता से और स्याही अपने पैर लाल स्याही से भरा एक कंटेनर पर कम करके अपनी पूंछ पकड़े हुए । नोट: यह चरण C57BL/6 दबाव के लिए आवश्यक है, लेकिन अगर एक सफेद कोट रंग के साथ एक माउस तनाव इस्तेमाल किया जा रहा है छोड़ दिया जा सकता है । चलने के डिब्बे में माउस जगह और 15 सेमी/एस पर ट्रेडमिल गति निर्धारित चालू कर ट्रेडमिल पर क्लिक करें और & #34; रर & #34; बटन को चाल समारोह इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर माउस की चल गति को पकड़ने के लिए (सामग्री के तालिका देखें) । एक टाइमर का उपयोग करें और ३६ s के लिए चल रहे प्रत्येक उपाय ३६ एस के बाद, रिकॉर्डिंग बंद करो और ट्रेडमिल बंद करो । नोट: इस ३६ s अंतराल के लिए चल रहे कार्य सफलतापूर्वक पूर्ण नहीं कर सकता जो चूहों को विफल करने के लिए माना जाता है । निर्दिष्ट फ़ोल्डर में वीडियो फ़ाइल सहेजें । प्रत्येक माउस के लिए ऊपर कदम दोहराने का आकलन किया जाना है । प्रत्येक 3 दिन में एक ही चल रहे कार्य के साथ चूहों का परीक्षण. संपादित वीडियो फ़ाइलों का विश्लेषण चाल समारोह मापदंडों के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग ( सामग्री तालिका देखें) । नोट: विभिन्न मोटर मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए कैसे का विवरण सॉफ्टवेयर के बीच भिन्न हो तो कृपया विश्लेषण से पहले निर्माता & #39; s अनुदेश देखें. या तो immunohistochemistry या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से axonal और myelin क्षति के ऊतकीय सबूत हासिल करने के लिए, पशुओं के ऊतकों किसी भी चरण पोस्ट मोटर समारोह मूल्यांकन अनुसंधान के विशिष्ट उद्देश्य के आधार पर लिया जा सकता है ।
Representative Results
Discussion
इस रिपोर्ट में C57BL/6 चूहों में P0180-199 पेप्टाइड का उपयोग EAN प्रेरित करने के लिए एक सरल विधि की रूपरेखा, neuropathological के साथ प्रेरित चूहों में कुंजी EAN और कार्यात्मक घाटे के ठहराव को सक्षम करने से. EAN प्रेरण प्रोटोकॉ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DGG एक NHMRC पीटर Doherty और मल्टीपल स्केलेरोसिस रिसर्च ऑस्ट्रेलिया (MSRA) के शुरुआती करियर फेलो हैं । JLF एक MSRA Postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित है । इस काम को JX के लिए ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC) परियोजना अनुदान #APP1058647 द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0<sub>180–199 </sub>peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0<sub>180–199</sub>, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| <strong>Name</strong> | <strong>Company</strong> | <strong>Catalog Number</strong> | <strong>Comments</strong> |
| <strong>Equipment</strong> | |||
| 0.5 mL syringe with 30<sup>1/2</sup> g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
- Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
- Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
- Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
- Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
- Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy–update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
- Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
- Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
- Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
- Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
- Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
- Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).
