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Neuroscience

कार्यात्मक और Neuropathological आकलन के लिए C57BL/6 चूहों में प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित न्युरैटिस प्रेरित करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण

Published: November 9, 2017 doi: 10.3791/56455
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy and Neuroscience, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne

Summary

इस रिपोर्ट को सफलतापूर्वक प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित न्युरैटिस (EAN) का उपयोग कर myelin प्रोटीन शूंय (P0)180-199 पेप्टाइड के संयोजन में Freund पूरा सहायक और कुक्कुर विष के साथ प्रेरित करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण की रूपरेखा । हम सही कार्यात्मक घाटे और neuropathology है कि इस EAN में होने की हद तक का आकलन करने में सक्षम एक परिष्कृत प्रतिमान वर्तमान ।

Abstract

प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित न्युरैटिस (EAN) स्व-प्रतिरक्षित परिधीय demyelinating रोगों की एक अच्छी तरह से सराहना की प्रयोगात्मक मॉडल है । EAN रोग परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) के घटकों की ओर एक भड़काऊ हमले को निर्देशित करने के लिए तंत्रिकाजन्य पेप्टाइड्स के साथ immunizing चूहों द्वारा प्रेरित है. हाल के अग्रिमों में EAN के अपेक्षाकृत प्रतिरोधी C57BL/6 myelin प्रोटीन शूंय (P0)106-125 या P0180-199 पेप्टाइड सहायक विष के इंजेक्शन के साथ संयुक्त में दिया का उपयोग कर लाइन में प्रेरण सक्षम है । C57BL/6 तनाव में EAN प्रेरित करने की क्षमता कई आनुवंशिक उपकरण है कि इस माउस पृष्ठभूमि पर मौजूद के उपयोग के लिए अनुमति देता है, और इस तरह रोग रोगजनन और उपंयास चिकित्सीय के यंत्रवत कार्रवाई के पूछताछ के परिष्कृत अध्ययन में अनुमति देता है ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण के साथ संयोजन । इस अध्ययन में, हम सफलतापूर्वक C57BL/6 चूहों में P0180-199 पेप्टाइड का उपयोग करते हुए EAN को प्रेरित करने के लिए एक सरल तरीका प्रदर्शित करते हैं । हम भी neuropathological सुविधाओं की एक सरणी के साथ इस मॉडल में होते हैं कि कार्यात्मक घाटे के आकलन के लिए एक प्रोटोकॉल रूपरेखा. इस प्रकार, इस मॉडल को मानव परिधीय demyelinating न्यूरोपैथी के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक मॉडल है, और myelin मरम्मत को बढ़ावा देने और स्व-प्रतिरक्षित में तंत्रिका क्षति के खिलाफ की रक्षा करने के उद्देश्य है कि संभावित उपचारों की प्रभावकारिता का निर्धारण करने के लिए न्युरैटिस.

Introduction

परिधीय न्यूरोपैथी या तो मूल में आनुवंशिक या प्राप्त कर सकते हैं, या तो चयापचय, ischaemic, भड़काऊ, या विषाक्त precipitants होने का अधिग्रहण न्यूरोपैथी के साथ । इन रोगों को भी उपयोगी मूल में या तो axonal या demyelinative के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं । सबसे आम अधिग्रहीत demyelinating परिधीय न्यूरोपैथी तीव्र सूजन demyelinating (AIDP, भी Guillain-Barré सिंड्रोम, जीबीएस के रूप में जाना जाता है) और जीर्ण सूजन demyelinating (CIDP)1है, 2 , 3 , 4; दोनों pathogenetically myelin म्यान के खिलाफ निर्देशित एक स्व-प्रतिरक्षित प्रतिक्रिया द्वारा विशेषता हैं, परिधीय नसों के ग्रासलेल्या के कारण । इन रोगों में, सक्रिय टी कोशिकाओं रक्त तंत्रिका बाधा पार और पीएन के भीतर एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करते हैं । तंत्रिका के भीतर मैक्रोफेज के सक्रियकरण तो ग्रासलेल्या या तो सीधे phagocytic हमले या परोक्ष रूप से स्रावित भड़काऊ मध्यस्थों के माध्यम से कारण बनता है, ऐसे पक्षाघात और संवेदी रोग के रूप में नैदानिक विकलांग में जिसके परिणामस्वरूप5। जबकि demyelinated axons ग्रासलेल्या निंनलिखित remyelinated होने की क्षमता को बनाए रखने, remyelination अक्सर देरी या अधूरा है, अपरिवर्तनीय क्षति के लिए नग्न axons की संवेदनशीलता में जिसके परिणामस्वरूप, स्थाई नैदानिक का प्रमुख कारण है विकलांगता. वर्तमान में, सबसे प्रभावी उपचार इम्यूनोमॉड्यूलेटरी हैं, लेकिन उनके प्रभावकारिता के बावजूद, कई मामलों में वसूली अक्सर धीमी है और ~ 25% रोगियों अवशिष्ट कार्यात्मक घाटे का अनुभव होगा कि काफी अपने जीवन की गुणवत्ता को कम6, 7.

EAN demyelinating परिधीय न्यूरोपैथी के एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जानवर मॉडल है कि रोगजनन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है और एक उपंयास चिकित्सकीय एजेंटों का आकलन करने का मतलब है4। इस मॉडल खरगोश, चूहों, चूहों, और गिनी सूअरों के रूप में विभिन्न प्रजातियों में प्रेरित किया जा सकता है, और तंत्रिकाजन्य एंटीजन के साथ प्रतिरक्षण द्वारा प्रेरित है. हालांकि, अंततः सफल EAN प्रेरण रोग के लिए एक उपयुक्त प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर निर्भर करता है हो सकता है । प्रजातियों को देखते हुए (और अंतर प्रजातियों/प्रतिरक्षा समारोह में भिन्नता, एंटीजन और adjuvants के कई संयोजन सफलतापूर्वक EAN पैदा करने के लिए विकसित किया गया है. murine आनुवंशिक उपकरण के संदर्भ में, C57BL/6 सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया है; हालांकि, पारंपरिक P2 प्रोटीन पेप्टाइड 57-81 (P257-81) है कि अतिसंवेदनशील SJL माउस तनाव में रोग में परिणाम8 अवैध रोगजनन में असमर्थ है C57BL/6 तनाव में कार्यात्मक घाटे के लिए अग्रणी । सौभाग्य से, संवेदी मानदंड P0106-125 या P0180-199 पेप्टाइड्स का उपयोग कर, कुक्कुर विष के इंजेक्शन के साथ संयुक्त सहायक में दिया इस बाधा को दूर कर सकते हैं, परिष्कृत आनुवंशिक उपकरण को सक्षम करने में उपयोग किया जा करने के लिए murine EAN मॉडेल आहे.

यहां, C57BL/6 चूहों में EAN की प्रेरण के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत किया है । इसके अलावा, एक व्यापक विस्तृत दृष्टिकोण जिसके द्वारा रोग के साथ जुड़े कार्यात्मक और neuropathological घाटे का मूल्यांकन करने के लिए प्रदान की जाती है । P0१८०-१९९ पेप्टाइड9 P057-81 वैकल्पिक10को वरीयता में चुना गया था । P0१८०-१९९ मॉडल P057-81 वैकल्पिक10के साथ तुलना में कम गंभीर नैदानिक संकेत उत्पादन करने के लिए वर्णित किया गया है, और इसलिए संभावित का परिचय झेलने की संभावना है बचके आनुवंशिक perturbations, शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं से पुनर्प्राप्त (जैसे परासरणी पंप आरोपण के रूप में), और ट्रेडमिल चाल समारोह के लिए उत्तरदायी है4परीक्षण. हालांकि, ट्रेडमिल चाल समारोह परीक्षण और ऊतकीय प्रोटोकॉल यहां वर्णित आसानी से लागू किया जा सकता है जब एक P057-81 प्रेरित संस्करण में रोग का अध्ययन ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > यहां वर्णित सभी प्रक्रियाओं तंत्रिका विज्ञान और मानसिक स्वास्थ्य (मेलबोर्न ब्रेन सेंटर) पशु नैतिकता समिति के लिए Florey संस्थान द्वारा अनुमोदित और वैज्ञानिक के लिए जानवरों के उपयोग के लिए अभ्यास के ऑस्ट्रेलियाई कोड का पालन कर रहे थे प्रयोजनों के.

< p class = "jove_title" > 1. EAN प्रेरण

< p class = "jove_content" > नोट: EAN सफलतापूर्वक पुरुष C57BL में प्रेरित किया जा सकता है/6 6-8 सप्ताह के बीच आयु वर्ग के चूहों । प्रेरण प्रोटोकॉल कुल में 9 दिन लगते हैं । 0 दिन पहले प्रतिरक्षण के दिन को संदर्भित करता है । इस प्रोटोकॉल के लिए, इंजेक्शन संज्ञाहरण के तहत आयोजित किया गया & #160;(नीचे दिए गए चरण 1.1.2 देखें).

  1. On Day-1:
    1. तैयार कुक्कुर विष (देखें Table of सामग्री ) का समाधान १.६ & #181; छ/मिलीलीटर बाँझ ०.१ M माउस-isotonic फॉस्फेट का उपयोग कर (मीट्रिक टन-पंजाबियों).
    2. Anesthetization with isoflurane:
      1. C57BL कक्ष में माउस (Anesthetization/6, पुरुष, 6-8 सप्ताह) रखें और ऑक्सीजन प्रवाह को समायोजित करने के लिए 1 L/min.
      2. isoflurane vaporizer पर बारी, anesthetization के लिए २.५% के लिए इसे समायोजित, और सांस लेने की निगरानी और 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, या जब तक प्राथमिक सजगता (corneal और हिंद अंग) अब उत्तरदायी हैं #160;
    3. से माउस को हटा anesthetization कक्ष और प्रशासन २५० & #181; एल के ऊपर कुक्कुर विष समाधान के माध्यम से एक intraperitoneal (आईएफसआई) इंजेक्शन का उपयोग कर एक ०.५ एमएल सिरिंज के साथ एक 30 1/2 जी सुई.
    4. प्रतिरक्षण के लिए इंजेक्शन इनोक्युलम तैयार करें:
      1. तैयार समाधान A का उपयोग कर 2 mg/मब सॉल्यूशन का P0 180-199 पेप्टाइड (with & #62; ९८% शुद्धता, अनुक्रम s-s-K-r-G-r-Q-T-P-V-l-Y-A-M-l-D-H-s-r-s) में ०.९% खारा.
      2. तैयार हल ख का उपयोग कर 20 मिलीग्राम/एमएल माइकोबैक्टीरियम तपेदिक का समाधान (देखें Table of सामग्री ) in Freund & #39; s complete सहायक (FCA, शामिल: 15% mannide monoolate + ८५% आयल आयल तथा ०.५ mg/ च्या शुष्क मारा आणि सूख मी माइकोबैक्टीरियम butyricum ).
      3. इंजेक्शन के लिए अंतिम इनोक्युलम बनाने के लिए, एक मनका डिब्बा में समाधान a और B के बराबर मात्रा भागों गठबंधन और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए एक अधिकतम गति से उन्हें मिश्रण.
        नोट: समाधान a और B को स्टॉक के रूप में रखा जा सकता है और 4 & #176; C को अधिकतम एक माह के लिए रख सकते हैं लेकिन संयुक्त अंतिम इनोक्युलम को माउस इंजेक्शन के दिन नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए.
  2. पर दिन 0, प्रशासन ५० & #181; एल के इनोक्युलम (चरण 1.1.4 में उल्लिखित तैयारी) एक चमड़े के नीचे एक 23 जी सुई का उपयोग इंजेक्शन के माध्यम से एक माउस में ।
    नोट: इंजेक्शन कंधे ब्लेड के बीच रखा जा सकता है, या हिंद अंग और caudal पीठ.
    3. पर पूंछ के बीच दिन 1 पर
  3. , १.२ & #181 के कुक्कुर विष समाधान करना; जी/एमएल (मीट्रिक टन-पंजाब में) और प्रशासन २५० & #181; एल एक आईएफसआई इंजेक्शन के माध्यम से एक ०.५ मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर एक 30 1/2 जी सुई के साथ एक माउस में.
    4. 3 दिन पर
  4. , दोहराएँ चरण १.३ ऊपर.
    नोट: स्टॉक समाधान a और B को अधिकतम एक माह के लिए 4 & #730; C पर बनाया और संग्रहित किया जा सकता है । हालांकि, अंतिम इंजेक्शन इनोक्युलम, स्टॉक समाधान A और B के संयोजन द्वारा उत्पादित, इंजेक्शन के दिन पर किया जाना चाहिए.
  5. पर 8 दिन, प्रशासन ५० & #181; इनोक्युलम के एल (कदम 1.1.4 में उल्लिखित तैयारी) एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से एक चूहे में (चरण १.२ ऊपर देखें), एक ही इंजेक्शन साइट पर के रूप में चरण १.२ (प्रत्येक जानवर के लिए)
< p class = "jove_title" > 2. नैदानिक स्कोरिंग

  1. दिन पर शुरू बाहर नैदानिक स्कोरिंग प्रदर्शन 0.
  2. प्रत्येक माउस को प्रकाशित मापदंड के अनुसार 0, 1, 2, 3, या 4 का स्कोर दें < सुप class = "xref" > 4 . EAN नैदानिक स्कोरिंग के लिए तालिका 1 देखें.
    नोट: स्थिरता के लिए, एक प्रयास एक ही शोधकर्ता द्वारा दैनिक एक ही समय में चूहों स्कोर करने के लिए किया जाना चाहिए.
< p class = "jove_title" > 3. मोटर फंक्शन असेसमेंट

< p class = "jove_content" > नोट: मोटर प्रदर्शन समानांतर में पशुओं के समान पलटने के लिए नैदानिक स्कोरिंग के साथ मूल्यांकन किया है. मोटर समारोह मूल्यांकन उपकरण एक कंप्यूटर है कि एक चाल समारोह इमेजिंग प्रणाली है से जुड़ा होना चाहिए (सामग्री के तालिका देखें) स्थापित । यह भी अनुशंसित है कि सभी चूहों का मूल्यांकन किया जाना EAN प्रेरण से पूर्व चल रहे कार्य को आदत किया जाना चाहिए. ऐसा करने के लिए, अभ्यास चलाता है (2 परीक्षण माउस प्रति रन) रोग प्रेरण (दिन 3) से पहले तीन दिन प्रदर्शन कर रहे हैं ।

  1. मोटर समारोह मूल्यांकन उपकरण पर बारी और प्रकाश बटन पर स्विच ।
  2. कूड़ा माउस दृढ़ता से और स्याही अपने पैर लाल स्याही से भरा एक कंटेनर पर कम करके अपनी पूंछ पकड़े हुए ।
    नोट: यह चरण C57BL/6 दबाव के लिए आवश्यक है, लेकिन अगर एक सफेद कोट रंग के साथ एक माउस तनाव इस्तेमाल किया जा रहा है छोड़ दिया जा सकता है ।
  3. चलने के डिब्बे में माउस जगह और 15 सेमी/एस
    4. पर ट्रेडमिल गति निर्धारित
  4. चालू कर ट्रेडमिल पर क्लिक करें और & #34; रर & #34; बटन को चाल समारोह इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर माउस की चल गति को पकड़ने के लिए (सामग्री के तालिका देखें) ।
  5. एक टाइमर का उपयोग करें और ३६ s के लिए चल रहे प्रत्येक उपाय ३६ एस के बाद, रिकॉर्डिंग बंद करो और ट्रेडमिल बंद करो ।
    नोट: इस ३६ s अंतराल के लिए चल रहे कार्य सफलतापूर्वक पूर्ण नहीं कर सकता जो चूहों को विफल करने के लिए माना जाता है ।
  6. निर्दिष्ट फ़ोल्डर में वीडियो फ़ाइल सहेजें ।
  7. प्रत्येक माउस के लिए ऊपर कदम दोहराने का आकलन किया जाना है । प्रत्येक 3 दिन में एक ही चल रहे कार्य के साथ चूहों का परीक्षण.
  8. संपादित वीडियो फ़ाइलों का विश्लेषण चाल समारोह मापदंडों के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग ( सामग्री तालिका देखें) ।
    नोट: विभिन्न मोटर मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए कैसे का विवरण सॉफ्टवेयर के बीच भिन्न हो तो कृपया विश्लेषण से पहले निर्माता & #39; s अनुदेश देखें. या तो immunohistochemistry या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से axonal और myelin क्षति के ऊतकीय सबूत हासिल करने के लिए, पशुओं के ऊतकों किसी भी चरण पोस्ट मोटर समारोह मूल्यांकन अनुसंधान के विशिष्ट उद्देश्य के आधार पर लिया जा सकता है ।

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Representative Results

P0 में180-199 पेप्टाइड प्रेरित EAN C57BL/6 चूहों से नैदानिक स्कोर शुरुआत के साथ एक monophasic रोग की ओर जाता है 6 दिनों के बाद प्रथम प्रतिरक्षण (डीपीआई), और अधिक से अधिक स्कोर गंभीरता से मनाया जाता है 25 dpi से कुछ नैदानिक स्कोर सुधार के बाद ४० dpi अवधि (चित्र 1)4,9. चाल समारोह के संदर्भ में, चूहों के रूप में जल्दी 6 डीपीआई के रूप में एक सरल चल रहे कार्य में विफल करने के लिए शुरू, और ३५ डीपीआई चूहों ने कम क्षमता के लिए एक सरल काम चल ट्रेडमिल को पूरा करने और ५५ डीपीआई4 (चित्रा 1) में भी चलाने की क्षमता में सुधार नहीं है । EAN के साथ प्रेरित चूहों उत्तरोत्तर उनके समय के साथ चल रहे कार्य करने की क्षमता में गिरावट आई है । कार्य विफलता रनिंग चूहों के ८०% में मनाया जाता है, लेकिन इस के अलावा, हिंद अंग चाल ट्रेडमिल में चल रहे चौड़ी एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक घाटे है कि रोग की अवधि में हल नहीं करता है4।

P0180-199 प्रेरित EAN में कई प्रमुख neuropathological विशेषताएं हैं: myelin म्यान को नुकसान; axon तणाव; और नोड चौड़ाई और paranodal संरचनाओं को नुकसान में वृद्धि हुई । अर्द्ध पतली sciatic नसों से लिया वर्गों की परीक्षा ग्रासलेल्या के क्षेत्रों (चित्र बी, तीर) उम्र से मिलान स्वस्थ नियंत्रण (चित्रा 2a) से sciatic नसों की तुलना में पता चलता है. महत्वपूर्ण बात, यह G-अर्द्ध पतली sciatic तंत्रिका वर्गों से कब्जा कर लिया छवियों से अनुपात को प्राप्त करने के लिए संभव है प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ उच्च शक्ति पर छवि4। तथापि, उच्च शक्ति संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) छवियों dysmyelinaton, myelin lamella को नुकसान, और axon सूजन जैसे mitochondrial तनाव के लक्षण जैसे विशिष्ट neuropathological सुविधाओं की पहचान करने के लिए आवश्यक हैं (विव्यवस्था और cristae और आंशिक या कुल cristolysis की विकृति) (चित्र 2c-2d) । axon तनाव के ultrastructural साक्ष्य के अनुरूप (चित्रा 2c-2डी), P0180-199 प्रेरित EAN मॉडल भी तीव्र axonal क्षति प्रदर्शित करता है, नाटकीय रूप से ऊंचा द्वारा प्रदर्शन किया β-amyloid प्रणेता sciatic नसों (चित्रा 3ए) में प्रोटीन (एपीपी) अभिव्यक्ति. इस उंर में नहीं मनाया जाता है स्वस्थ नियंत्रण ऊतकों (चित्रा 3) मिलान । नोड्स में Neuropathological परिवर्तन और paranodes अच्छी तरह से जीबीएस में प्रलेखित किया गया है; खास तौर पर अमन वैरिएंट11,12. हमारे murine EAN मॉडल में, हम की पहचान है कि नोड्स और paranode को विघटन के चौड़ीकरण P0180-199 प्रेरित EAN (चित्र बी) के अतिरिक्त neuropathological विशेषताएं हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: EAN प्रेरण प्रतिमान के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, नैदानिक स्कोर मूल्यांकन, और EAN के दौरान क्षमता चल रही है । (क) C57BL/6 चूहों में EAN प्रेरण प्रोटोकॉल का अवलोकन, उम्र के 6-8 सप्ताह से शुरू, (ख) की उम्मीद नैदानिक स्कोर और (सी) रोग कोर्स के दौरान चल रहे समय (संदर्भ4देखें) के साथ. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: EAN प्रदर्शन myelin हानि, myelin क्षति के साथ चूहों, और axons तनाव के लक्षण । (क) एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि (100X आवर्धन के तहत) से sciatic नसों के अर्द्ध पतले वर्गों से लिया आयु मिलान स्वस्थ नियंत्रण । (ख) एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि (100X आवर्धन के तहत) ५५ दिन पहले प्रतिरक्षण (डीपीआई) के बाद EAN के साथ प्रेरित चूहों से sciatic नसों के अर्द्ध पतले वर्गों से लिया । क्षेत्रों में कमी myelin myelinated axons (ऐरोहेड) से घिरा हुआ संकेत remyelination; यह वृद्ध-मिलान स्वस्थ नियंत्रण से प्राप्त ऊतक में नहीं देखा गया था (एक देखें). (ग) एक प्रतिनिधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि (5 के तहत, 000X आवर्धन) पैनल बी से fromsciatic नसों लिया प्रदर्शन myelin विकृति (खुला तीर) और axon तनाव (बाध्यकारी वर्ग ५५ डीपीआई पर सूजन mitochondria संकेत) । (D) एक उच्च शक्ति उनि छवि (सी में बंधे बॉक्स) का प्रदर्शन सूजन mitochondria कि axon तनाव का संकेत कर रहे है (तीर सिर), लेकिन यह उंर मिलान स्वस्थ नियंत्रण से अनुपस्थित है (नहीं दिखाया गया डेटा) । स्केल बार्स = 10 µm (A, B), और ५०० एनएम (C, D) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: Axon तनाव और नोडल विकृति P0180-199 प्रेरित EAN की एक विशेषता है । (एक) एकल विमान फोकल छवियां (40X इज़ाफ़ा के तहत) ५५ डीपीआई पर sciatic नसों के माध्यम से लिया । EAN चूहों से ऊतक नाटकीय रूप से उन्नत अनुप्रयोग अभिव्यक्ति β-III tubulin (न्यूरॉन्स के एक मार्कर) axonal तनाव के संकेत का संकेत के साथ सह स्थानीयकृत दिखा. (ख) उच्च शक्ति Z-अनुमानों (100X आवर्धन) paranodes के sciatic तंत्रिका वर्गों में Caspr के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ दाग । EAN चूहों से नोड्स में, नोड को चौड़ा करने का संकेत आसन्न paranodes के बीच एक बढ़ी हुई दूरी है । इसके अलावा, paranode संरचना में व्यवधान जैसे नोडल विकृति EAN चूहों में मनाया जा सकता है, लेकिन उम्र से मिलान स्वस्थ नियंत्रण से अनुपस्थित है । स्केल पट्टियां = 10 µm (A), और 5 µm (B) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

स्कोर मापदंड नोट्स और मूल्यांकन मानदंड की टिप्पणियां
0 सामांय माउस
1 कम जीवंत या खराद यह सामांय हैंडलिंग के जवाब में मूल्यांकन किया है, चूहों आमतौर पर पहली बार 5 पद प्रतिरक्षण दिन से कम गतिविधि के लक्षण दिखाने
2 पट पेशियों या पूंछ पेशियों पूंछ स्ट्रोक परीक्षण (पूंछ फ़्लिक) द्वारा मूल्यांकन किया है ।
हल्के अंग पेशियों हल्के अंग पेशियों चूहों को संदर्भित करता है जब एक सपाट सतह पर चलने जमीन पर उनके पेट खींचें
3 पट पेशियों + हल्के अंग पेशियों या हल्के गतिभंग सामान्य चलने में किसी भी कठिनाई के रूप में मूल्यांकन किया जाता है
पट पेशियों + हल्के गतिभंग या
हल्के अंग पेशियों + हल्के गतिभंग
4 गंभीर गतिभंग गंभीर गतिभंग असामान्य पीछे घूमना, या तो अंग पेशियों, हल्के अंग पेशियों, या पूंछ पेशियों के साथ संयुक्त द्वारा की पहचान की है

तालिका 1: EAN नैदानिक स्कोर प्रतिमान ।

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Discussion

इस रिपोर्ट में C57BL/6 चूहों में P0180-199 पेप्टाइड का उपयोग EAN प्रेरित करने के लिए एक सरल विधि की रूपरेखा, neuropathological के साथ प्रेरित चूहों में कुंजी EAN और कार्यात्मक घाटे के ठहराव को सक्षम करने से. EAN प्रेरण प्रोटोकॉल के लिए अलग वर्णित यहां संज्ञाहरण का उपयोग करते हुए प्रतिरक्षण इंजेक्शन प्रदर्शन है । isoflurane संज्ञाहरण का उपयोग बहुत है कि इनोक्युलम की कुल मात्रा कम त्रुटि और पशुओं के लिए तनाव के साथ वांछित स्थान में चमड़े के नीचे इंजेक्शन है सुनिश्चित करने की क्षमता को बढ़ाता है ।

चूहों 6 डीपीआई से रोग के नैदानिक लक्षण प्रदर्शित करने के लिए शुरू हो जाएगा4 EAN प्रेरण की इस विधि का उपयोग कर । हालांकि, नैदानिक स्कोर से मापा के रूप में रोग की शुरुआत पहले से उत्पन्न करने के लिए सूचित किया गया है ~ 10 डीपीआई9,10. जबकि नैदानिक स्कोर द्वारा निर्धारित के रूप में रोग की शुरुआत में यह अंतर आंशिक रूप से अलग नैदानिक स्कोरिंग मानदंड के कारण हो सकता है, यह अधिक संभावना EAN प्रेरण के लिए इनोक्युलम में विभिन्न adjuvants के उपयोग द्वारा समझाया गया है. यह प्रोटोकॉल m. तपेदिकके साथ पूरक है, जो एम. butyricumयुक्त एक Freund पूर्ण सहायक का उपयोग करता है । अंय अध्ययनों का उपयोग है Freund सहायक केवल एम. तपेदिक के साथ इंजेक्शन इनोक्युलम में P0180-199 पेप्टाइड युक्त9,प्रतिरक्षण के लिए10 ।

इस प्रोटोकॉल में, आईएफसआई इंजेक्शन के माध्यम से कुक्कुर विष वितरित नसों में (i.v.) पूंछ नस इंजेक्शन को वरीयता में सिफारिश की है । यह दिखाया गया है कि कुक्कुर प्रसव के मोड काफी रोग शुरुआत या प्रगति4बदल नहीं है, लेकिन चुनाव आईएफसआई मार्ग के माध्यम से देने के लिए, के रूप में i.v. पूंछ नस का विरोध किया, जोखिम शमन और एक को कम करने का प्रयास से प्रेरित है ऑपरेटिंग त्रुटि का मौका । अक्सर, पूंछ नस i.v. इंजेक्शन एक बराबर मात्रा के इंजेक्शन के साथ तुलना में तकनीकी रूप से अधिक चुनौतीपूर्ण हैं । यह पहले से दिखाया गया है कि एक सहायक के रूप में कुक्कुर विष का उपयोग EAN प्रेरित जब P0180-199 पेप्टाइड9का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । दिलचस्प है, पिछले काम से पता चला है कि halving कुक्कुर की खुराक इस पद्धति में उल्लिखित, अवैध नैदानिक स्कोर, neuropathology द्वारा मापा EAN के लिए पर्याप्त है, और चाल4चलाने ट्रेडमिल के दौरान चौड़ी । हालांकि, कुक्कुर विष की खुराक कम करने में इस्तेमाल किया EAN प्रेरण काफी क्षमता चल प्रभावित करता है, और चूहों काम चल ट्रेडमिल पर काफी बेहतर प्रदर्शन जब EAN आधा कुक्कुर इस पद्धति में वर्णित खुराक के साथ प्रेरित है 4.

मोटर इस P0180-199 पेप्टाइड प्रेरित EAN मॉडल में मनाया घाटे के साथ और मजबूत neuropathological सबूत द्वारा समर्थित है । पहले, यह दिखा दिया गया है कि myelin क्षति की हद तक काफी संवेदनशील रोग गंभीरता में परिवर्तन का पता लगाने कि EAN प्रेरण के दौरान कुक्कुर विष की खुराक halving से परिणाम है । यहां, नोड/paranodal संरचनाओं के लिए axonal तनाव और व्यवधान के रूप में EAN की अंय बानगी, पहचाने जाते है P0180-199 प्रेरित EAN के लिए मात्रात्मक neuropathological मार्करों के एक कमरे में जिसके परिणामस्वरूप । यह neuropathology की अधिक विवेकपूर्ण परीक्षाओं के लिए सक्षम बनाता है जब रोग प्रक्रियाओं, या उपंयास चिकित्सीय एजेंटों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन । रोमांचक रूप से, इन neuropathological आकलन गहरी अंतर्दृष्टि और neuropathology और समारोह घाटे कि EAN के इस मॉडल की एक विशेषता है के बीच संबंधों की एक बेहतर समझ प्रदान करने के लिए एक बोली में कार्यात्मक readouts को संबद्ध किया जा सकता है । neuropathological विश्लेषण और चाल समारोह इस अध्ययन में कार्यरत परीक्षण के अलावा, इस तरह के तंत्रिका आचरण वेग माप के रूप में अन्य कार्यात्मक आकलन के लिए पूरी तरह से चिकित्सकीय हस्तक्षेप का उपयोग कर समारोह परिणामों पर कब्जा करने के लिए सुझाव दिया जाता है इस मॉडल ।

EAN एक शक्तिशाली और आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक मॉडल परिधीय ग्रासलेल्या और remyelination की जांच करने के लिए है, sciatic नसों और cauda equina जा रहा है अक्सर जांच परिधीय नसों के साथ । EAN का प्रमुख लाभ यह है कि यह एक प्रतिलिपि और quantifiable मोटर घाटे में परिणाम है, इस प्रकार एक नैदानिक परिप्रेक्ष्य से neuroprotection और myelin मरंमत के विश्लेषण की अनुमति । इसके अलावा, myelin क्षति तीव्र और प्रतिलिपि इस प्रकार एक histopathological परिप्रेक्ष्य से myelin और axonal क्षति का विस्तृत विश्लेषण की अनुमति है ।

जबकि EAN मॉडल एक रोमांचक प्रयोगात्मक demyelinating परिधीय न्यूरोपैथी की जांच करने के लिए मतलब का प्रतिनिधित्व करता है, वहां संभावित सीमाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तकनीकी चुनौतियां हैं । यह मानव में demyelinating परिधीय न्यूरोपैथी के विविधता प्रकृति की सराहना करने के लिए महत्वपूर्ण है, प्रतिरक्षा प्रणाली और पीएन के बीच एक जटिल बातचीत को शामिल. वर्तमान चुनौती है कि कोई भी EAN पशु मॉडल ईमानदारी से अपने सभी पहलुओं की नकल कर सकते हैं । इसके अलावा, वहां पर्याप्त अंतर प्रजातियों और अंतर तनाव रोग गंभीरता और EAN मॉडल की प्रगति के बारे में भिंनता है । उदाहरण के लिए, हमने पाया है कि कुल मिलाकर EAN C67/बी-6 चूहों में प्रेरित लुईस चूहों (अप्रकाशित डेटा) में प्रेरित EAN से कम गंभीर है । इसी तनाव के भीतर भी लैंगिक अंतर है । हमारे अप्रकाशित डेटा से पता चलता है कि पुरुष C57/B6 चूहों में प्रेरित EAN मॉडल मादा चूहों में प्रेरित एक से अधिक प्रतिलिपि है, तथापि, इस लिंग अंतर underpinning सटीक कारण अस्पष्ट है ।

अंत में, हम एक प्रोटोकॉल है कि पुरुष C57/B6 चूहों में EAN मॉडल की एक मजबूत और तेजी से प्रेरण की अनुमति देता है की सूचना दी । नैदानिक स्कोरिंग और मोटर समारोह मूल्यांकन neuropathological अध्ययन के साथ संयोजन दोनों नैदानिक और रोग के दृष्टिकोण से demyelinating परिधीय न्यूरोपैथी का अध्ययन करने के लिए एक रणनीतिक उपकरण प्रदान करता है. महत्वपूर्ण बात, यह चिकित्सा के तंत्र पर भविष्य के अध्ययन को बढ़ावा देता है कि लक्ष्य परिधीय तंत्रिका myelin मरंमत ट्रांसजेनिक माउस दृष्टिकोण का उपयोग कर ।

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Disclosures

लेखकों के पास इस काम के बारे में रुचि का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

DGG एक NHMRC पीटर Doherty और मल्टीपल स्केलेरोसिस रिसर्च ऑस्ट्रेलिया (MSRA) के शुरुआती करियर फेलो हैं । JLF एक MSRA Postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित है । इस काम को JX के लिए ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC) परियोजना अनुदान #APP1058647 द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin List Biological Laboratories, Inc., CA, USA #181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane Pharmachem, QLD, Australia Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) Difco, MI, USA #231141
Freund's complete adjuvant (FCA) Difco, MI, USA #263910
16% Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Services #15710 Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia #11-30-8 Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia SL189 Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia SA030 Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium Sakura Finetek, CA, USA #4583
Normal donkey serum Merck Millipore, MA, USA #S30-100 Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100 Sigma Aldrich, MI, USA #90o2-31-1 Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) Invitrogen (Life Technologies), CA, USA S12700 Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA Various Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution Dako (Agilent), CA, USA #S3023 Each laboratory will have their own preference.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles BD #326105
23 g needles BD #305143
Red ink pad Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill) eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch Any timer may be used.
DigiGait 8 Software eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope Zeiss Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd SF41296SP
Cyrostat Leica Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene GeneTex (USA) Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope Zeis LSM780 Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J National Institues of Health Available from www.fiji.sc

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References

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कार्यात्मक और Neuropathological आकलन के लिए C57BL/6 चूहों में प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित न्युरैटिस प्रेरित करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण
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Gonsalvez, D. G., Fletcher, J. L., Yoo, S. W., Wood, R. J., Murray, S. S., Xiao, J. A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (129), e56455, doi:10.3791/56455 (2017).… More

Gonsalvez, D. G., Fletcher, J. L., Yoo, S. W., Wood, R. J., Murray, S. S., Xiao, J. A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (129), e56455, doi:10.3791/56455 (2017).

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