Простой подход к побудить Экспериментальный аутоиммунный неврит мышей C57BL/6 для оценки функциональных и патологического
Summary
В настоящем докладе излагается простой подход к успешно побудить экспериментальной аутоиммунных неврит (EAN) с использованием миелиновый белок ноль (P0)180-199 пептида в сочетании с полного адъюванта Фройнд и коклюша токсин. Мы представляем современные парадигмы способны точно оценить степень функциональной дефицита и невропатологии, которые происходят в этом EAN.
Abstract
Экспериментальный аутоиммунный неврит (EAN) представляет собой хорошо оценили экспериментальный модель аутоиммунных периферийных демиелинизирующих заболеваний. МАКПТ болезни индуцируется иммунизация мышей с нейрогенной пептиды направлять нападение воспалительных сторону компонентов периферической нервной системы (ПНС). Последние достижения позволили индукции EAN в строке мыши относительно устойчивые C57BL/6, используя миелиновый белок ноль (P0)106-125 или P0180-199 пептиды доставлены в адъювант в сочетании с инъекции токсина коклюша. Способность вызывать EAN в штамм C57BL/6 позволяет для использования многочисленных генетических инструментов, которые существуют на этом фоне мыши и таким образом позволяет сложные исследования патогенеза заболевания и допроса механистический действий Роман терапии в комбинация с трансгенных подходов. В этом исследовании мы демонстрируем простой подход к успешно побудить EAN, используя P0180-199 пептида в мышей C57BL/6. Мы также наметить протокол для оценки функциональных дефициты, которые происходят в этой модели, в сопровождении массив патологического функций. Таким образом эта модель является мощным Экспериментальная модель для изучения патогенеза человека периферийных демиелинизирующих нейропатии и определить эффективность потенциальных терапий, которые направлены на содействие миелина ремонта и защиты от повреждения нерва в аутоиммунных неврит.
Introduction
Периферические нейропатии может быть генетическое происхождение или приобретенные, с приобретенных невропатий, имеющих либо метаболических, ишемическая, воспалительных, или токсических выделений. Эти заболевания целесообразно также классифицируются как аксональное или demyelinative происхождение. Наиболее распространенных приобретенных демиелинизирующих периферической нейропатии, острые воспалительные демиелинизирующих полиневропатии (МАУП, также известный как синдром Гийена-Барре, GBS) и хронические воспалительные полиневропатии демиелинизирующих (ХВДП)1, 2 , 3 , 4; патогенетически оба характеризуются аутоиммунные реакции, направленной против Миелиновые оболочки, вызывая демиелинизации периферических нервов. При этих заболеваниях активированные Т-клетки пересечь барьер крови нерва и генерировать иммунной реакции в рамках ПНС. Активация макрофагов в нерв затем вызывает демиелинизации либо непосредственно через фагоцитарной атаки, или косвенно через секретируемые медиаторы воспаления, что приводит к клинической инвалидов как паралич и сенсорные дисфункции5. В то время как demyelinated аксоны сохраняют способность быть remyelinated после демиелинизации, remyelination часто задерживается или неполными, что приводит восприимчивости голый аксоны необратимый ущерб, который является основной причиной постоянного клинического инвалидности. В настоящее время наиболее эффективных методов лечения иммуномодулирующих, но несмотря на их эффективность во многих случаях восстановление часто является медленным и ~ 25% пациентов будут испытывать остаточный функциональные дефициты, которые значительно уменьшить их качество жизни6, 7.
EAN-широко используемых животных модель демиелинизирующих периферической нейропатии, которая предоставила ценную информацию в патогенезе и средства для оценки роман терапевтических агентов4. Эта модель может быть наведено в различных видов, таких как кролики, крыс, мышей и морских свинок и индуцированный иммунизации с нейрогенной антигены. Однако в конечном счете успешное индукции EAN зависит соответствующий иммунный ответ для болезни происходят. Учитывая видов (и Межамери-species/штамм) изменения в иммунной функции, были разработаны несколько комбинаций антигенов и адъювантов успешно побудить EAN. С точки зрения мышиных генетических инструменты C57BL/6 является наиболее широко используемым; Однако традиционные P2 белка пептидные 57-81 (P257-81), что приводит к болезни в подверженных SJL мыши штамм8 неспособен незаконным патогенеза, ведущих к функциональные дефициты в штамм C57BL/6. К счастью, сенсибилизации парадигмы с помощью P0106-125 или P0180-199 пептиды, доставлены в адъювант в сочетании с вдуванием коклюша токсин может преодолеть этот барьер, позволяя сложных генетических инструменты для использования в мышиных EAN модель.
Здесь представлен простой метод для индукции EAN мышей C57BL/6. Кроме того предоставляется подробный всеобъемлющий подход для оценки функциональных и патологического недостатки, связанные с болезнью. P0-180––199 пептид9 был выбран предпочтение P057-81 альтернативных10. P0180–199 модель была описана производить менее тяжелые клинические признаки, по сравнению с57-81 альтернативных P010и поэтому вероятен выдержать введение потенциально пагубное генетических возмущений, оправиться от хирургических процедур (например, осмотических насосов имплантация) и поддается беговая дорожка походка функции тестирования4. Однако беговая дорожка походка функция тестов и гистологической протоколы, описанные здесь могут легко применяться при изучении болезни в варианте57-81 индуцированной P0.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем докладе излагается простой способ заставить EAN используя P0180-199 пептида в мышей C57BL/6, позволяя количественная оценка ключевых патологического и функциональные дефициты мышей, индуцированной с EAN. Собственный протокол индукции EAN, описанный здесь является использовани?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DGG-NHMRC Питер Доэрти и начале карьеры парень рассеянный склероз исследований Австралии (MSRA). JLF поддерживается MSRA докторантура стипендий. Эта работа была поддержана австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) проекта предоставить JX #APP1058647.
Materials
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
- Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
- Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
- Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
- Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
- Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy–update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
- Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
- Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
- Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
- Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
- Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
- Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).
