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Neuroscience

기능과 Neuropathological 평가 대 한 C57BL/6 쥐에 실험 자가 면역 신경 염을 유발 하는 간단한 방법

doi: 10.3791/56455 Published: November 9, 2017

Summary

이 보고서는 성공적으로 유도 실험 자가 면역 신경 염 (EAN) myelin 단백질을 사용 하 여 0 (P0)180-199 펩타이드 Freund의 완전 한 보조 및 백 일 해 독 소와 함께 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 우리는 정확 하 게 기능적인 적자와이 상품에서 발생 하는 neuropathology의 정도 평가 정교한 패러다임 제시.

Abstract

실험적인 자기 면역 신경 염 (EAN) 자기 면역 주변 demyelinating 질병의 잘 평가 실험 모델 이다. EAN 질환 말 초 신 경계 (PNS)의 구성 요소에 대 한 선 동적인 공격을 직접 neurogenic 펩 티 드와 마우스를 면역에 의해 유발 됩니다. 최근 발전은 myelin 단백질 제로 (P0)106-125 또는 P0180-199 펩 티 드 백 일 해 독 소의 주사 함께 보조 제공을 사용 하 여 상대적으로 내성 C57BL/6 마우스 라인에서 EAN의 유도 활성화 했습니다. C57BL/6 스트레인에 EAN을 유도 하는 능력이 마우스 배경에 존재 하는 수많은 유전 도구 사용에 대 한 허용 하 고 따라서 질병 병의 정교한 연구 및 심문에 새로운 치료제의 기계 작업의 수 유전자 변형 접근 조합입니다. 이 연구에서는 EAN C57BL/6 쥐에 P0180-199 펩 티 드를 사용 하 여 성공적으로 유도 하는 간단한 방법을 보여 줍니다. 우리는 또한 neuropathological 기능의 배열과 함께,이 모델에서 발생 하는 기능적인 적자의 평가 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 따라서,이 모델은 인간의 주변 demyelinating neuropathies의 병 인을 공부 하 고 myelin 복구를 촉진 하 고 면역에 신경 손상 으로부터 보호 하는 것을 목표로 하는 잠재적인 치료의 효능을 결정 하는 강력한 실험 모델 신경 염입니다.

Introduction

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주변 neuropathies 일 수 있다 근원에서 유전 인수, 인수 neuropathies 있는 어느 대사, ischaemic, 염증, 또는 독성 침. 이 질병도 유용 하 게 axonal 또는 근원에서 demyelinative로 분류 됩니다. 가장 일반적인 주변 neuropathies는 급성 염증 성 Demyelinating 증 (AIDP, Guillain-바레 증후군, GBS 라고도) demyelinating 인수 및 만성 염증 Demyelinating 증 (CIDP)1, 2 , 3 , 4. 둘 다 pathogenetically의 주변 신경 demyelination 일으키는 myelin 칼 집에 대 한 지시 자가 면역 반응에 의해 특징 이다. 이 질병에서 활성화 된 T 세포 혈액 신경 방 벽을 교차 하 고 PNS 내 면역 반응을 생성. 다음은 신경 내에서 대 식 세포의 활성화 demyelination phagocytic 공격을 통해 직접 또는 간접적으로 통해 분 비 염증 성 중재자, 마비 및 감각 부전5등 임상 장애의 결과로 발생 합니다. Demyelinated 축 삭 demyelination 다음 remyelinated 수 있는 능력을 유지 하는 동안 remyelination 자주 지연 또는 불완전, 돌이킬 수 없는 손상을, 벌 거 벗은 axons의 민감성에 따른 임상 영구의 주요 원인 장애입니다. 현재 가장 효과적인 치료는 immunomodulatory, 하지만 그들의 효 험에도 불구 하 고 많은 경우에는 복구는 종종 느린 고 25% 환자 크게 줄일 그들의 삶의 질6, 잔여 기능적인 적자를 경험할 것 이다 7.

EAN demyelinating pathogenesis 및 비 발한 치료 대리인4를 평가 하는 수단으로 귀중 한 통찰력을 제공 하고있다 주변 신경 병의 널리 사용 되는 동물 모델 이다. 이 모델은 토끼, 다른 종에서 유도 될 수 있다 쥐, 쥐 및 기니 피그와 neurogenic 항 원 가진 면역에 의해 유발 됩니다. 그러나, 궁극적으로 성공적인 EAN 유도 발생 하는 질병에 대 한 적절 한 면역 반응에 따라 다릅니다. 면역 기능에 종 (및 남북 species/스트레인) 변화를 감안할 때, 항 원 및 adjuvants의 여러 조합은 성공적으로 EAN을 유도 하기 위해 개발 되었습니다. Murine 유전 도구 점에서 C57BL/6은 가장 널리 사용 되 고; 그러나, 전통적인 P2 단백질 펩타이드 57-81 (P257-81) 취약 SJL 마우스 스트레인8 질병에서 발생 하는 불법 pathogenesis C57BL/6 스트레인에 기능적인 적자를 선도를 수 없습니다. 보조 결합에 민감 화 패러다임 P0106-125 또는 P0180-199 펩 티 드를 사용 하 여 전달 하는 다행히도, 백 일 해 주사와 함께 독 소 정교한 유전자 도구에 활용 될 수 있도록이 장애물을 극복할 수 있는 murine EAN 모델입니다.

여기, C57BL/6 쥐에 EAN의 감 응 작용을 위한 간단한 방법을 제시 합니다. 또한, 질병과 관련 된 기능 및 neuropathological 적자를 평가 하는 포괄적인 상세한 접근 제공 됩니다. P0180-199 펩 티 드9 P057-81 대체10우선 선정 되었다. P0180-199 모델 생산 P057-81 대체10에 비해 덜 심각한 임상 증상을 설명 및의 소개를 잠재적으로 견딜 것 이므로 해로운 유전자 섭, (와 같은 삼 투 펌프 이식) 수술에서 회복 이며 의무가 디딜 방 아 걸음 걸이 기능 테스트4. 그러나, 디딜 방 아 걸음 걸이 기능 테스트 및 여기서 설명 하는 조직학 프로토콜 수 쉽게 적용할 P057-81 유발 변종에 질병을 공부 하는 때.

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Protocol

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여기에서 설명한 모든 절차 Florey 연구소 신경 과학 및 정신 건강 (멜버른 두뇌 센터) 동물 윤리 위원회 승인 했다 고 과학에 대 한 동물의 사용에 대 한 호주 코드 연습을 따라 목적.

1. EAN 유도

참고: EAN 남성 C57BL/6 쥐 세 6-8 주 사이에서 성공적으로 유도 될 수 있다. 유도 프로토콜 총에서 9 일이 걸린다. 0 첫 번째 면역의 날을 말합니다. 이 프로토콜에 대 한 주사 마 취 실시 했다 (단계 1.1.2 아래 참조).

  1. 일에-1:
    1. 백 일 해 독 소를 준비 (재료의 표 참조) 솔루션의 1.6 µ g/mL의 멸 균 0.1 m M 마우스 isotonic 인산 염을 사용 하 여 식 염 수 (MT-PBS) 버퍼링.
    2. Isoflurane와 anesthetization:
      1. anesthetization 챔버에 마우스 (C57BL/6, 남성, 6-8 주)를 놓고 1 L/분에 산소 흐름을 조정
      2. Isoflurane 기화 기 설정, anesthetization, 및 호흡 하는 모니터에 대 한 2.5%로 조정 하 고 대기 2 분, 또는 때까지 기본 반사 (각 막 및 뒷 다리)는 더 이상 반응
    3. Anesthetization 상공에서 마우스를 제거 하 고 0.5 mL 주사기를 사용 하 여 30 1/2 G 바늘으로 복 (i.p.) 주사를 통해 위의 백 일 해 독 소 솔루션의 250 µ L 관리.
    4. 면역 주사 inoculum 준비:
      1. P0 180-199 펩 티 드의 2 mg/mL 해결책을 사용 하 여 준비 솔루션 (와 함께 > 98% 순도, 시퀀스 S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) 0.9% 염 분에서.
      2. 준비 솔루션 B 결핵균의 20 mg/mL 해결책을 사용 하 여 참조 테이블의 재료 Freund에 ' s 완전 한 보조 (FCA, 구성: 15% mannide monoolate + 파라핀 오일 0.5 mg/mL의 85% desiccated 살해와 말린 M 진 균 butyricum)의.
      3. 주입, 최종 inoculum을 비드 때리는에 해결책 A와 B의 동일 볼륨 부분을 결합 하 고 실내 온도에서 1 분 동안 최대 속도로 혼합.
        참고: 솔루션 A와 B 재고 유지 및 수 최대 한 달에 4 ° C에서 저장 된 있지만 결합 된 최종 inoculum 갓 마우스 주입의 일에 대비해 야 합니다.
  2. Inoculum (준비 단계 1.1.4에서에서 설명)의 50 µ L를 관리 하는 일에 0, 23 G 바늘을 사용 하 여 피하 주사를 통해 마우스에.
    참고: 주사 수 수 위에 양 어깨 사이 또는 뒷 다리와 꼬리 사이 꼬리 등.
  3. 하루 1에 1.2 µ g/mL의 백 일 해 독 소 솔루션 (MT-PBS)에서 만들고 i.p. 주입 30 1/2 G 바늘으로 0.5 mL 주사기를 사용 하 여 통해 마우스에 250 µ L 관리.
  4. 에 3 일, 반복 단계 위의 1.3.
    참고: 재고 솔루션 A와 B 구성 고 1 달 최대 4 ˚C에 저장 될 수 있습니다. 그러나, A와 B, 재고 솔루션을 결합 하 여 생산 최종 주사 inoculum 주사의 일에 이루어져야 합니다.
  5. 8 일에 관리 inoculum (준비 단계 1.1.4에서에서 설명)의 50 µ L 피하 주사를 통해 마우스에 (단계 위의 1.2 참조), (각 동물)에 대 한 1.2 단계 에서처럼 동일한 사출 사이트

2. 임상 점수

  1. 하루 0에 시작 하는 매일 밖으로 임상 점수 수행.
  2. 각 마우스의 0, 1, 2, 3, 또는 4 4 게시 된 기준 따라 점수를 제공합니다. EAN 임상 점수 표 1을 참조 하십시오.
    참고: 일관성을 위해 노력 하 여야 한다 동시에 쥐를 매일 같은 연구원에 의해.

3. 기능 평가 모터

참고: 동물의 동일한 코 호트에 대 한 임상 점수와 병렬로 모터 성능 평가. 모터 기능 평가 기구는 걸음 걸이 기능 이미징 시스템 (재료의 표 참조) 설치 되어 있는지 컴퓨터에 연결 되어야 합니다. 또한 평가 될 모든 쥐를 EAN 유도 전에 실행 중인 작업 익숙해져 한다는 것이 좋습니다. 이렇게 하려면 연습 실행 (마우스 당 2 테스트 실행) 3 일전 질병 유도 (하루-3) 수행 됩니다.

  1. 모터 기능 평가 장치 및 조명 버튼 스위치 설정.
  2. 아저씨 마우스 단단히 고 꼬리를 잡고 빨간 잉크 가득 컨테이너에 그것을 낮추는 방법으로 발 잉크.
    참고:이 단계는 C57BL/6 스트레인에 대 한 필요 하지만 마우스 스트레인 흰색 코트 색상으로 사용 하는 경우 건너뛸 수 있습니다.
  3. 걷는 구획에 마우스 고 15 cm에서 디딜 방 아의 속도 설정/미
  4. 디딜 방 아와 클릭은 " 기록 " 이미징 시스템 걸음 걸이 기능을 사용 하 여 마우스의 실행 모션 캡처 버튼 (재료의 표 참조).
  5. 타이머를 사용 하 고 36 각 실행 측정 s. 36 s, 정지 녹음 및 중지 디딜 방 아 후.
    참고: 성공적으로이 36 s 간격에 실행 중인 작업을 완료할 수 없는 쥐 실패 한 것으로 간주 됩니다.
  6. 지정 된 폴더에 비디오 파일을 저장.
  7. 평가를 각 마우스에 대 한 위의 단계를 반복 합니다. 3 일 마다 같은 실행 작업 마우스 테스트.
  8. 걸음 걸이 함수 매개 변수 (자료의 표 참조)에 대 한 소프트웨어를 사용 하 여 편집 된 비디오 파일을 분석.
    참고: 다른 모터 매개 변수를 분석 하는 방법의 세부 사항을 다 소프트웨어 사이 그렇게 제조 업체를 참조 하십시오 ' 분석 전에 s 지시. Axonal의 조직학 증거를 얻기 위해 immunohistochemistry 또는 전자 현미경 검사 법, 동물 조직 어떤 단계 게시물 모터 기능 평가 특정 목표에 따라 연구에 반입할 수 있습니다 통해 수 초 손상.

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Representative Results

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P0180-199 펩 티 드에서 monophasic 질병 임상 점수 C57BL/6 마우스 리드 EAN 유도 첫 예방접종 (dpi), 그리고 최대한 점수 심각도 25에서 관찰은 6 일 게시물에서 발병 뒤 일부 임상 점수 40에서 개선 기간 (그림 1)4,9. 걸음 걸이 기능 측면에서 마우스 빠르면 6 dpi, 간단한 실행 중인 작업에 실패 35 dpi 마우스에 의해 간단한 디딜 방 아 실행 하는 작업을 완료 하는 데 작은 용량을가지고 시작 하 고 55 dpi4 (그림 1) 에서도 능력을 실행에 개선 하지 않으면. 마우스는 EAN 점차적으로 시간이 지남에 실행 작업을 수행 하는 기능에 거부를 유도 한다. 작업 실패 실행 마우스, 하지만이, 뒷 다리 걸음 걸이 질병의4기간 동안 해결 되지 않는 주요 기능 적자 실행 디딜 방 아에 확대 뿐만 아니라 80%에서 관찰 됩니다.

있다 P0180-199 의 몇 가지 주요 neuropathological 기능 유도 EAN:; myelin 칼 집에 손상을 축 삭 스트레스; 증가 노드 너비와 paranodal 구조에 손상을. 좌 골 신경에서 찍은 반 얇은 섹션의 검사 나이 일치 하는 건강 한 컨트롤 (그림 2A)에서 좌 골 신경에 비해 demyelination (그림 2B, 화살표)의 영역을 보여준다. 중요 한 것은, 그것은 좌 골 신경 반 얇은 섹션 가벼운 현미경 검사 법4높은 전력에서 몇 군데에서 캡처한 이미지에서 G-비율을 얻을 수 있습니다. 그러나, 높은 전력 전송 전자 현미경 (TEM) 이미지 dysmyelinaton, myelin 얇은 판자에 손상 같은 특정 neuropathological 기능을 식별 하는 데 필요한 그리고 축 삭의 미토 콘 드리 아 붓기 같은 스트레스 (교란 및 왜곡 cristae의 부분 또는 전체 cristolysis) (-그림 2C2D). 축 삭 스트레스 (그림 2C-2D)의 ultrastructural 증거와 일치, P0180-199 유도 EAN 모델 또한 표시 급성 axonal 손상, 극적으로 상승 된 β 아 밀 로이드 선구자 여 좌 골 신경 (그림 3A)에 단백질 (APP) 식입니다. 이 없는 건강 한 제어 나이 일치 하는 조직 (그림 3A)에서 관찰 됩니다. 노드는 paranodes에서 neuropathological 변화 GBS;에서 잘 문서화 되어 특히, AMAN 변형11,12. 우리의 murine EAN 모델에서 우리는 노드는 paranode 중단의 확대 추가 neuropathological 기능 식별 P0의180-199 유도 EAN (그림 3B).

Figure 1
그림 1: 임상 EAN 유도 패러다임의 도식 표현 EAN 동안 평가, 및 실행 능력을 점수. EAN 유도의 개요 (A) C57BL/6 마우스 프로토콜, 예상된 임상 점수 및 (C) (B)의 회로도와 나이의 6-8 주에서 개시 질병 동안 상영 시간 코스 (참조4참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: myelin 손실, 수 초 손상, 및 축 삭 긴장의 표시를 표시 하는 EAN와 쥐. (A) A 밝은 필드 이미지 (아래 100 배 확대) 나이 일치 하는 건강 한 통제에서 좌 골 신경의 세미 얇은 섹션에서 가져온. (B) A 밝은 필드 이미지 (아래 100 배 확대) 55 일에서 EAN으로 유발 쥐에서 좌 골 신경의 세미 얇은 섹션에서 가져온 첫 번째 접종 (dpi) 게시. Myelin 얇게 myelinated 축 삭 (화살촉)로 둘러싸인 부족 지역 표시 remyelination; 이 아니라 일치 하는 세 건강 한 컨트롤 (참조)에서 얻은 조직에서 관찰 되었다. 패널 B 설명 myelin 병리학 (오픈 화살표) 및 축 삭 스트레스 (55 dpi에서 부 어 미토 콘 드리 아를 나타내는 바인딩 광장)에서 (C) A 대표 전자 현미경 이미지 (아래 5000 X 배율) fromsciatic 신경 (D) (경계 상자 c에서) 높은 전원 가장 이미지는 축 삭의 지표 설명 부 미토 콘 드리 아 (화살표 머리) 스트레스, 그러나 이것은 결 석 나이 일치 하는 건강 한 컨트롤 (데이터 표시 되지 않음). 스케일 바 = 10 µ m (A, B), 및 500 nm (C, D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 축 삭 스트레스와 결핵 병은 P0180-199 의 기능 유도 EAN. (A) 단일 평면 confocal 이미지 (아래 40 배 확대) 55로 좌 골 신경을 통해 촬영. EAN 쥐에서 조직 극적으로 높은 애플 리 케이 션 식 공동 axonal 긴장의 β-III tubulin (뉴런의 마커) 나타내는 표시와 지역화를 표시 합니다. (B) 고성능 Z 계획 (100 배 확대) 좌 골 신경 섹션에 Caspr에 대 한 항 체로 얼룩진 paranodes의. EAN 쥐에서 노드를 나타내는 노드를 확대 하는 인접 한 paranodes 사이 증가 거리가 있다. 더하여, paranode 구조 중단 등 결핵 병 리 EAN 쥐에서 관찰 될 수 있다 그러나 결 석 건강 한 컨트롤 일치 하는 나이에서. 스케일 바 = 10 µ m (A), 및 5 µ m (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

점수 기준 노트와 평가 기준의
0 일반 마우스
1 활기찬 또는 lathery 이 마우스 일반적으로 먼저 표시 주 5 게시물 예방 접종에서에서 감소 활동의 정상적인 처리에 대 한 응답 평가
2 꼬리 paresis 또는 꼬리 paresis 꼬리 치기 테스트 (flicking 꼬리)에 의해 평가 됩니다.
온화한 사지 paresis 온화한 사지 paresis 가리킵니다 때 평평한 표면에 걷는 쥐 지상에 그들의 배를 드래그
3 Paresis + 가벼운 다리 paresis 꼬리 또는 가벼운 운동 실 조는 일반 워킹에 어려움으로 평가
꼬리 paresis + 가벼운 운동 실 조 증 또는
온화한 사지 paresis + 가벼운 운동 실 조
4 심한 운동 실 조 심한 증 거꾸로 비정형으로 식별 되는 사지 paresis, 가벼운 다리 paresis, 또는 꼬리 paresis 함께 걷기,

표 1: EAN 임상 점수 패러다임.

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Discussion

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이 보고서는 EAN C57BL/6 마우스에 P0180-199 펩 티 드를 사용 하 여, EAN으로 유도 된 쥐에 있는 주요 neuropathological 및 기능적인 적자의 정량화를 활성화를 유도 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 여기에 설명 된 EAN 유도 프로토콜에 고유한 면역 주사를 수행 하는 동안 마 취를 사용 하 여가입니다. Isoflurane 마 취의 사용은 크게 inoculum의 총 볼륨 최소한의 오류 및 스트레스 동물을 원하는 위치에 피하 주입 되도록 기능을 향상 시킵니다.

마우스 6 dpi4 EAN 유도의이 방법을 사용 하 여 질병의 임상 증상을 표시 하기 시작 합니다. 그러나, 임상 평가 점수에 의해 측정 된 질병 발병 이전 ~ 10 dpi9,10에서 발생할 수 보고 되었습니다. 질병 발병 임상 평가 점수에 의해 결정에이 차이 다른 임상 점수 기준으로 인해 부분적으로 될 수 있는, 그것은 더 많은 가능성이 EAN 유도 inoculum 다른 adjuvants의 사용에 의해 설명 했다. 이 프로토콜 M. butyricum, M.결핵 보충 되는 포함 하는 Freund의 완전 한 보조 제를 사용 합니다. 다른 연구는 P0180-199 펩 티 드9,10 예방접종을 포함 하는 주입된 inoculum에 M. 결핵 만 보충 하는 Freund의 보조 제를 사용 합니다.

이 프로토콜에 i.p. 주입을 통해 백 일 해 독 소를 제공 하는 것이 좋습니다 정 맥 (i.v.) 우선 꼬리 정 맥 주입. 그것은 보였다 질병 발병 또는 진행4를 백 일 해 배달의 모드에서 크게 변경 되지 않습니다 하지만 i.v. 꼬리 정 맥, 반대로 i.p. 경로 통해 제공 하는 선택 위험 완화 및 감소 시키는 시도 의해 동기를 오류 운영의 기회입니다. 자주, 꼬리 정 맥 i.v. 주사 동일한 볼륨의 주사에 비해 기술적으로 더 도전입니다. 그것은 이전 보였다는 보조로 백 일 해 독 소의 사용은 P0180-199 펩 티 드9를 사용 하 여 때 EAN을 유도 하는 데 필요한. 흥미롭게도, 이전 작업이이 방법에서 설명 하는 백 일 해의 복용량을 등분 불법 EAN 임상 점수, neuropathology, 그리고 디딜 방 아4를 실행 하는 동안 확대 하는 걸음 걸이 의해 측정에 충분 한지를 보이고 있다. 그러나, 백 일 해 독 소 사용의 복용량을 감소에서 EAN 동안 유도 크게 실행 용량, 영향과 마우스 수행 크게 EAN이이 방법에 설명 된 반 백 복용량으로 유도 하는 경우 작업을 실행 하는 디딜 방 아에 더 나은 4.

모터 적자가 P0180-199 유도 펩타이드 EAN 모델에 동반 하 고 강한 neuropathological 증거에 의해 지원. 이전에, 그것은 myelin 손상의 정도 측정 충분히 민감한 EAN 유도 중 백 일 해 독 소의 복용량을 등분의 결과 질병 심각도 변경 감지 하는 입증 되었습니다. 여기, axonal 스트레스 등 장애 노드/paranodal 구조에 EAN의 다른 특징은 식별, EAN 유도 P0180-199 양적 neuropathological 마커의 제품군에 발생. 질병 과정, 또는 새로운 치료제의 효능을 평가할 때 neuropathology의 더 신중 하 게 시험에 대 한 수 있습니다. Excitingly, 이러한 neuropathological 평가 깊은 통찰력과 neuropathology와 EAN의이 모델의 특징은 함수 적자 사이 관계의 더 나은 이해를 제공 하기 위하여에서 기능 해독에 상관 될 수 있습니다. Neuropathological 분석 및 보 행 기능 시험이이 연구에서, 신경 전도 속도 측정 등 다른 기능 평가 완전히 사용 하는 치료 내정간섭의 함수 결과 캡처하기 위해 제안 이 모델.

EAN 주변 demyelination 그리고 remyelination, 좌 골 신경 및 cauda equina 가장 자주 주변 신경 조사 되 고 검사를 강력 하 고 일반적으로 사용 되 실험 모델입니다. EAN의 주요 장점은 재현 고 정량 모터 적자 되므로 neuroprotection 및 myelin 복구 임상 관점에서의 분석 결과. 또한, 수 초 손상 급성 이며 재현 되므로 수 초 및 histopathological 관점에서 axonal 손상의 상세한 분석.

EAN 모델 demyelinating 주변 신경 병을 조사 하는 흥미로운 실험 평균을 나타내는, 기술적인 도전 뿐만 아니라 잠재적인 한계 있다. 그것은 면역 시스템 및 PNS 사이 복잡 한 상호 작용을 포함 하는 인 간에 있는 주변 신경 demyelinating의 자연에 감사 하는 것이 중요. 현재 문제는 아니 한 EAN 동물 모델 충실 하 게 모든 측면을 모방 수 있습니다. 또한, 질병의 심각도 EAN 모델의 진행에 관한 상당한 간 종 및 간 긴장 변이가 있다. 예를 들어 우리는 EAN 유도 C67/b 6 쥐에 그 전체를는 EAN 루이스 쥐 (되지 않은 데이터)에서 유도 보다 덜 심각한 발견. 같은 변형 내에서 성별 차이입니다. 그러나 게시 되지 않은 데이터 남성 C57/B6 쥐에서 유도 된 EAN 모델 보다 정확한 이유가 성별 차이 underpinning 여성 쥐,,에서 유도 된 것은 분명 더 재현을 보여줍니다.

결론적으로, 우리는 남성 C57/B6 쥐에서 EAN 모델의 강력 하 고 빠른 유도 허용 하는 프로토콜을 보고. 임상 점수와 모터 기능 평가 neuropathological 연구와 임상 및 병 리 학적 관점에서 주변 신경 demyelinating 공부에 대 한 전략적 도구를 제공 합니다. 중요 한 것은, 그것은 주변 신경 myelin 복구 유전자 변형 마우스 접근을 사용 하 여 대상 치료의 메커니즘에 대 한 미래의 연구를 촉진 합니다.

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Disclosures

저자는이 작품에 대 한 관심의 없습니다 충돌 있다.

Acknowledgments

DGG은 NHMRC 피터도 허 티와 다 발성 경화 증 연구 호주 (MSRA) 초기 경력 연구원입니다. JLF는 MSRA 박사 친교에 의해 지원 됩니다. 이 작품은 호주 국민 건강에 의해 지원 되었다 고 의료 연구 위원회 (NHMRC) 프로젝트 JX를 #APP1058647을 부여 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin List Biological Laboratories, Inc., CA, USA #181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane Pharmachem, QLD, Australia Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) Difco, MI, USA #231141
Freund's complete adjuvant (FCA) Difco, MI, USA #263910
16% Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Services #15710 Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia #11-30-8 Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia SL189 Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia SA030 Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium Sakura Finetek, CA, USA #4583
Normal donkey serum Merck Millipore, MA, USA #S30-100 Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100 Sigma Aldrich, MI, USA #90o2-31-1 Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) Invitrogen (Life Technologies), CA, USA S12700 Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA Various Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution Dako (Agilent), CA, USA #S3023 Each laboratory will have their own preference.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles BD #326105
23 g needles BD #305143
Red ink pad Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill) eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch Any timer may be used.
DigiGait 8 Software eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope Zeiss Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd SF41296SP
Cyrostat Leica Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene GeneTex (USA) Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope Zeis LSM780 Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J National Institues of Health Available from www.fiji.sc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69, (10), 2405-2410 (2004).
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기능과 Neuropathological 평가 대 한 C57BL/6 쥐에 실험 자가 면역 신경 염을 유발 하는 간단한 방법
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Gonsalvez, D. G., Fletcher, J. L., Yoo, S. W., Wood, R. J., Murray, S. S., Xiao, J. A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (129), e56455, doi:10.3791/56455 (2017).More

Gonsalvez, D. G., Fletcher, J. L., Yoo, S. W., Wood, R. J., Murray, S. S., Xiao, J. A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (129), e56455, doi:10.3791/56455 (2017).

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