Summary
Denne protokol viser induktion af cerebral bundløs misdannelser sygdom i en musemodel og bruger kontrast forbedret mikro computertomografi for at måle læsion byrde. Denne metode øger værdien af etablerede musemodeller at studere det molekylære grundlag og potentielle terapier for cerebral bundløs misdannelser og andre cerebrovaskulære sygdomme.
Abstract
Mutationer i den CCM1 (aka KRIT1), CCM2, eller CCM3 (aka PDCD10) genet forårsage cerebral bundløs misdannelser (CCM) i mennesker. Musemodeller af CCM sygdom har været etableret af tamoxifen induceret sletning af Ccm gener i postnatal dyr. Disse musemodeller give uvurderlige værktøjer for at undersøge molekylære mekanisme og terapeutiske tilgange til CCM sygdom. En nøjagtig og kvantitativ metode til at vurdere læsion byrde og progression er vigtigt at udnytte den fulde værdi af disse dyremodeller. Her, vi vise induktion af CCM sygdom i en musemodel og brug af kontrasten forbedrede X-ray mikro computertomografi (mikro-CT) metode til foranstaltning CCM læsion byrde i mus hjerner. På postnatal dag 1 (P1) brugte vi 4-hydroxytamoxifen (4HT) til at aktivere Cre recombinase aktivitet fra Cdh5-CreErt2 transgen til kløver floxed allel af Ccm2. CCM læsioner i mus hjerner blev analyseret P8. For mikro-CT, blev jod baseret Lugol løsning brugt til at forbedre kontrasten i hjernevæv. Vi har optimeret scanningsparametrene og udnyttet en voxel dimentional i 9.5 µm, som fører til et minimum funktion størrelse af ca 25 µm. Denne beslutning er tilstrækkelig til at måle CCM læsion volumen og antallet globalt og præcist, og levere høj kvalitet 3D-kortlægning af CCM læsioner i mus hjerner. Denne metode øger værdien af de etablerede musemodeller at studere molekylære grundlag og potentielle terapier for CCM og andre cerebrovaskulære sygdomme.
Introduction
CCM er tynde vægge, dilaterede vaskulære misdannelser i hjernen med forekomsten af op til 0,5% i den menneskelige befolkning1. CCM kan nedarves som en dominant lidelse på grund af tab af funktion mutationer i en af tre gener: CCM1 (aka Krit1), CCM2og CCM3 (også kaldet PDCD10)2,3,4 ,5,6. Disse gener er til stede i en enkelt signalering komplekse.
Forskellige modeller er blevet udviklet til model menneskelige CCM sygdom og at forstå de downstream veje af CCM gener, der er ansvarlig for CCM7,8,9,10. Den mest robuste model er betinget slette en af Ccm gener med tamoxifen-inducerbar Cdh5-CreERT2 på P1 i nyfødte unger8,10. Disse hvalpe udvikle CCM læsioner i hjernen fra P6 fremefter og forventes at være en ideel model for prækliniske undersøgelser i søgen efter mekanismer og terapeutiske agenter i behandling af CCM sygdomme.
CCM læsion byrde i mus hjernen er blevet målt primært af histologi-baserede metoder, en tilgang, der er ekstremt tidskrævende og underlagt investigator bias10,11,12. Mr baseret metoder har været anvendt til at vurdere CCM læsion byrde i voksen mus model9,13. Dog er et stærkt specialiserede små dyr Mr instrument og scan-længe flere timer at overnatte kræves for at opnå en tilfredsstillende løsning at identificere CCM læsioner. Også, om Mr kan anvendes til at påvise CCM læsioner i neonatal mus er ikke blevet rapporteret og opløsning kan begrænse følsomhed.
Vi har for nylig udviklet en mikro-CT teknik at billede og analysere CCM læsion14,15. Denne høje opløsning, tid og omkostningseffektiv metode dramatisk boostet værdien af CCM sygdom model i mekanistiske og terapeutiske undersøgelser. Øgning af kontrast, hele mount farvning metoder har været anvendt til micro-CT billeddannelse af blødt væv og mus embryoner16,17. Vi har tidligere brugt en osmium-baserede farvning for at forbedre kontrasten for micro-CT billeddannelse af CCM læsioner i hjernen14. I dette papir, vi brugte en mindre giftig, ikke-destruktiv, og omkostningseffektiv reagens, en jod baseret Lugols løsning, for at forbedre kontrasten for micro-CT billeddannelse. Jod kan diffuse hele hjernen og har en høj affinitet for blod18.
Den detaljerede protokollen er præsenteret her for induktion af CCM læsioner i en neonatal musemodel sammen med billedbehandling og analyse af CCM læsioner med en kontrast-baseret mikro-CT. Mikro-CT baseret metode giver kvantitative globale mål for CCM læsion volumen, præcist identificerer antallet og 3D-placeringen af CCM læsioner i hjernen, mus og reducerer omkostningerne og tiden skal fænotype disse dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle Dyreetik og protokoller blev godkendt af The Sydney lokale Health District dyr Velfærdsudvalget og institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Tianjin medicinske universitet. Alle eksperimenter blev udført under retningslinjer/forskrifter hundredåret Institute, University of Sydney og Tianjin medicinske universitet
1. Induktion af Cerebral bundløs misdannelser i musemodeller
- Cross Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl mus med Ccm2 fl/fl til at generere kuld med Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl (Ccm2 iECKO) unger og littermate kontrol (Ccm2 fl/fl). Cdh5-CreErt2 og Ccm2 fl/fl dyr har været tidligere beskrevet 19.
- Opløses 4HT i 100% ethanol og opbevares ved-80 ° C i delprøver af 30 µL (4HT koncentration: 10 mg/mL). På dagen for brug, fortyndes aliquoted 4HT i majsolie (0,5 mg/mL).
- Intragastrically indsprøjtes 50 µL af 4HT (0,5 mg/mL) til neonatal unger på P1 at fremkalde eksperimentelle CCM læsioner ved hjælp af en insulin sprøjten.
2. Prøve forberedelse af Micro-CT scanner
- Euthanize neonatal pups P8 via CO2-kvælning.
- Udføre intra hjerte perfusion ved at indsætte en 29-gauge kanyle med 3 mL 2% PARAFORMALDEHYD i PBS i en 10 mL sprøjte i ventrikel mus hjerte.
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftige; bære passende beskyttelse. - Detach hovedet fra kroppen ved hjælp af en saks. Fjerne alle hud off hovedet ved hjælp af en saks og skrælle kraniet ved hjælp af pincet til at dissekere hele hjernen.
- Tage billeder af hjernen med stereomikroskopet på 7.82 x forstørrelse, 1 x gevinst, 0,6 gamma og 20 ms eksponeringstid.
- Fix dissekeret hjerner med 4% PARAFORMALDEHYD i PBS løsning natten.
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftige; bære passende beskyttelse. - Den følgende dag, frigøre hindbrains bruger en pincet og vask med PBS løsning.
- Inkuberes hindbrains i Lugol ' s jodopløsning til 48 h.
- Efter inkubation, kort luft tørre hindbrains til at fjerne overskydende Lugol ' s jodopløsning.
- Pakke Lugol ' s jod farves hindbrains i 0,65 mL microcentrifuge rør og seal helt med plast paraffin film at undgå væv svind ( fig. 2 A).
- Placerer microcentrifuge rør i 5 mL plasticrør med svampe til at forhindre dem i at flytte under scanning ( figur 2 B).
3. Mikro-CT Skan af CCM i hjernen, mus
- lodret montere baghjernen pakket i et rør på en indehaver af en aluminium i ordningen med mikro-CT.
- Indstillet de scanningsparametre til 540 fremskrivninger og 2 s eksponeringstid med kilde betingelser på 50 kV og 10 W at erhverve den tomografisk datasæt (image resolution 9.5 μm/pixel).
- Røntgenbilleder fra scanningen er rekonstrueret automatisk af hardware-baserede projektion genopbygning software leveret af micro-CT system, producerer en billed serie af 16-bit aksial skiver (" TXM " fil).
4. Analyse af Micro-CT datasæt
- åbne filen rekonstrueret image (" TXM " fil) i 3D-analyse software og visualisere hjernen ved hjælp af den " volume rendering " funktion.
- Omdanne baghjernen til den ønskede orientering ved hjælp af den " afgrænsningsrammen " og " klipning flyet " funktioner.
- Resample den transformerede billede i udvidet tilstand og bevare voxel størrelse.
- Opret " ny etiket redigeringsfeltet " på den transformerede billede (4.3) og fremhæve kun baghjernen ved hjælp af gråtoner intensitet.
- Tilføje de markerede områder og køre " label analyse " til at indhente målinger af den hele baghjernen (dvs., samlede rumfang og areal). Eksportere målinger i en Excel-fil.
- Visualisere baghjernen ved hjælp af den " isosurface gengivelse " funktion.
- Oprette en anden " nye etiket redigeringsfeltet " på de transformerede billede og fremhæve områder med læsioner ved hjælp af gråtoner intensitet.
- Tilføje de markerede områder og køre " etiket " analyse til at indhente målinger af læsioner i baghjernen (dvs., samlede rumfang og areal). Eksportere målinger i en Excel-fil.
- Visualisere læsioner ved hjælp af den " generere overflade " og " overflade Se " funktioner.
- Snapshot billeder af baghjernen på ønskede retningslinjer eller generere en film til 3D-visualisering af læsioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En enkelt injektion af 4HT på P1 var tilstrækkelig til at fremkalde CCM læsioner i lillehjernen. Lugols Jod kontrast mikro-CT tilstrækkeligt opdaget CCM læsioner og kunne kvantificere dens volumen og antal. Udnytte den optimerede mikro-CT, filmede vi CCM læsioner i hindbrains af Ccm2iECKO mus. Scannede X-ray billeder blev rekonstrueret til at producere 3D-billeder af hjernen, mus, der tillod visualisering af hele læsioner i hjernen parenkym på forskellige dybder og retningslinjer, og vurdering af strukturen og 3D-placering af læsioner i hjernen. Vigtigere, kan dette billede dataset også bruges til effektiv og præcis kvantificering af læsion størrelser og læsion numre.
Figur 1 viser succesfulde induktion af CCM læsioner i lillehjernen af Ccm2iECKO (B), men ikke i littermate kontrolelementer (Ccm2fl/fl) (A) P8.
Figur 2 viser en pakket prøve for micro-CT scanning (A-B), og repræsentant rekonstrueret billeder fra mikro-CT-scanning af kontrol (Ccm2fl/fl) (C) og Ccm2 iECKO (D-E). Figur 2 E' viser mærket læsioner i Ccm2iECKO.
Figur 3 viser en afsmeltet 3D-billede af en Ccm2iECKO hjerne med læsioner (A-B). Tilstødende tabel viser et eksempel på kvantitativ output af mærket individuelle læsioner.
Figur 1 : Induktion af CCM læsioner i neonatal mus. Makroskopiske billeder af Ccm2fl/fl (A) og Ccm2iECKO (B) hjerner på postnatal dag 8. Skalere barer (hvid), 5 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Prøve forberedelse og rekonstrueret 2D billeder. Prøven pakket i en microcentrifuge tube (A) og 5 mL rør (B). Grøn pil viser prøven. Repræsentative billeder af Ccm2fl/fl (C) og Ccm2iECKO (D-E) hjerner. (E') Markant læsioner i Ccm2iECKO hjerne. Skalere barer (hvid), 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Afsmeltet 3D-billeder. Gengives billedet af Ccm2iECKO hjernen med læsioner (A) og læsioner eneste (B). Læsioner er markeret med rødt. Tabellen til højre viser et eksempel på kvalitative output af individuelt markant læsioner. Skalere barer (hvid), 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CCM er en fælles vaskulære misdannelser, der påvirker op til 0,5% af individer1. CCM kan forekomme sporadiske eller familiær form. Patientens prognose er ofte uklart, da CCM læsioner kan briste uventet for at forårsage slagtilfælde og andre neurologiske konsekvenser. I øjeblikket er den eneste behandlingsmulighed kirurgisk fjerne læsioner, som er ledsaget af høj risiko.
Menneskelige CCM betingelser er for nylig blevet gengivet i dyre modeller7,8,9,10. Disse modeller leverer uvurderlige værktøjer for at undersøge mekanismer involveret i CCM sygdom. En korrekt, effektiv og kvantitative analysemetode, der vil bidrage til at udnytte den fulde værdi af disse modeller.
Vi har for nylig udviklet en mikro-CT metode til billede CCM læsioner i musemodeller ved hjælp af osmium tetraoxide som en kontrastfarve agent14. I den aktuelle undersøgelse, har vi efterfølgende brugt Lugols jodopløsning for at forbedre kontrasten af hjernevæv til at opdage læsioner. Lugols jodopløsning er mindre giftige, ikke-destruktiv og billigere i forhold til osmium tetraoxide. Prøverne kan derfor genbruges til andre formål, såsom histologi efter Lugols jodopløsning er vasket væk.
Vores micro-CT metode kunne producere tilstrækkelig billedkvalitet for at opdage CCM læsioner i hjernen, mus. Prøveforberedelsen er ligetil og kræver ikke højt specialiseret teknikker. Denne metode kan give høj opløsning fremskrivninger med en scanning tid på ca. en time. Kombinere datasæt fra mikro-CT-scanninger og 3-D analyse software er en kraftfuld måde at generere en 3D-global view af CCM læsioner i hjernen. Den kvantitative og kvalitative repræsentation af læsioner i forhold til hjernens anatomi er nemt at opnå. I forhold til histologi-baseret 3D-genopbygning, vores metode er meget tid - og omkostninger - effective og producerer langt mere nøjagtige 3D-repræsentationer.
Men der er også begrænsninger og kritisk skridt skal tages i betragtning. For det første kræver metoden en mikro-CT system, som er højt specialiseret udstyr og kan ikke være let tilgængelige. For det andet, dissekere neonatal mus hjernen kan være ganske udfordrende på grund af den blødhed og størrelsen af hjernevævet. Det er meget vigtigt ikke at skade hjernen under dissektion for at opnå nøjagtige målinger og visualisering af CCM læsioner i hjernen. Endelig er prøveforberedelse til mikro-CT-scanning kritisk. Lugols jod farves hjerner skal være pakket helt for at undgå væv svind på grund af fordampning. Også, skal prøverne placeres sikkert i løbet af micro-CT-scanning. Enhver bevægelse under scanningen vil ændre kvaliteten af scanningen og dermed kvantificering og visualisering.
Vi har anvendt vores metode kun i faste neonatal mus hjerner. Men denne metode kan bruges til andre undersøgelser, der involverer forskellige prøver og kan tjene som et spændende og nyt værktøj til andre vaskulære misdannelser forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender faciliteterne og den videnskabelige og tekniske bistand fra Sydney mikroskopi & mikroanalyser Research Facility (AMMRF) og den australske centrum for mikroskopi & mikroanalyser (ACMM) på University of Sydney. Disse undersøgelser blev støttet af Australian National Health og Medical Research Rådet (NHMRC) projektet give 161558 og APP1124011 (XZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
References
- Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis. Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).
- Liquori, C. L., et al. Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).
- Laberge-le Couteulx, S., et al. Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas. Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).
- Sahoo, T., et al. Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1). Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).
- Denier, C., et al. Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).
- Bergametti, F., et al. Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).
- McDonald, D. A., et al. A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease. Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).
- Boulday, G., et al. Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice. J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).
- Chan, A. C., et al. Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice. J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).
- Zheng, X., et al. Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor. Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).
- McDonald, D. A., et al. Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease. Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Gibson, C. C., et al. Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation. Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).
- Choi, J. P., et al. Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice. PLoS One. 11 (8), 0160833 (2016).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), 61 (2006).
- Anderson, R., Maga, A. M. A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast. PLoS One. 10 (11), 0142974 (2015).
- Zheng, X., et al. Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth. Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).
