Summary
Dit protocol toont de inductie van cerebrale cavernous malformatie ziekte in een muismodel en gebruik contrast enhanced micro computertomografie voor het meten van de laesie Last. Deze methode verbetert de waarde van gevestigde Muismodellen te bestuderen van de moleculaire basis en mogelijke therapieën voor cerebrale cavernous misvorming en andere cerebrovasculaire ziekten.
Abstract
Mutaties in het CCM1 (aka KRIT1), CCM2, of CCM3 (aka PDCD10) gene cerebrale cavernous malformatie (CCM) bij de mens veroorzaken. Muismodellen voor CCM ziekte hebben opgericht door tamoxifen geïnduceerde schrapping van Ccm genen in postnatale dieren. Deze Muismodellen bieden waardevolle hulpmiddelen voor het onderzoek naar moleculaire mechanisme en therapeutische benaderingen voor CCM ziekte. Een nauwkeurige en kwantitatieve methode te beoordelen van de laesie lasten en progressie is essentieel voor het benutten van de volledige waarde van deze dierlijke modellen. Hier tonen we de inductie van CCM ziekte in een muismodel en het gebruik van het contrast enhanced X-ray micro computertomografie (micro-CT) methode aan maatregel CCM laesie last in muis hersenen. Op postnatale dag 1 (P1), we gewend 4-hydroxytamoxifen (4e) activeren van Cre recombinase activiteit van de Cdh5-CreErt2-transgenic te klieven van het floxed-allel voor Ccm2. CCM laesies in muis hersenen werden geanalyseerd op P8. Voor micro-CT, werd jodium gebaseerd Lugoljodium oplossing gebruikt om het contrast in hersenweefsel verbeteren. Wij hebben de parameters van de scan geoptimaliseerd en gebruikt een voxel dimensie van 9,5 µm, die leiden tot een minimale grootte van ongeveer 25 µm. Deze resolutie is voldoende voor het meten van CCM laesie volume en aantal wereldwijd en accuraat, en bieden hoge kwaliteit 3D-toewijzing van CCM letsels in de hersenen van de muis. Deze methode verbetert de waarde van de gevestigde Muismodellen te bestuderen van de moleculaire basis en mogelijke therapieën voor CCM en andere cerebrovasculaire ziekten.
Introduction
CCM dun zijn ommuurde, vasculaire misvormingen in de hersenen met een prevalentie van maximaal 0,5% in de menselijke populatie1uitgezet. CCM kan worden overgenomen als een dominante stoornis als gevolg van verlies-van-functie mutaties in één van drie genen: CCM1 (aka Krit1), CCM2en CCM3 (ook wel PDCD10genoemd)2,3,4 ,5,6. Deze genen zijn aanwezig in een honkslag signalering complex.
Verschillende modellen ontwikkeld model ziekten bij de mens CCM en begrijpen van de stroomafwaartse trajecten van CCM genen die verantwoordelijk voor CCM7,,8,,9,10 zijn. De meest robuuste model is het voorwaardelijk verwijderen om het even wie van de genen van de Ccm met tamoxifen-afleidbare Cdh5-CreERT2 bij P1 in pasgeboren pups8,10. Deze pups CCM letsels in de hersenen van P6 verder ontwikkelen en een ideaal model voor pre-klinische studies in zoeken naar mechanismen en therapeutische agenten in het behandelen van CCM ziekten worden verwacht.
CCM laesie last in muis hersenen is gemeten voornamelijk door histologie gebaseerde methoden, een aanpak die is zeer tijdrovend en onder voorbehoud van de onderzoeker bias10,11,12. MRI gebaseerde methoden zijn gebruikt om te beoordelen van CCM laesie last in de volwassen muis model9,13. Een gespecialiseerde kleine dierlijke MRI instrument en lange scan-tijd van enkele uren naar girale is echter vereist om een bevredigende oplossing aan het identificeren van CCM laesies. Ook, of MRI kan worden gebruikt voor het detecteren van CCM laesies in neonatale muizen is niet gemeld en resolutie gevoeligheid kan beperken.
Onlangs hebben we een techniek van micro-CT beeld en analyseren van CCM laesie14,15. Dit hoge resolutie, tijd en kosteneffectieve methode drastisch vergroot de waarde van het model van de ziekte CCM in mechanistische en therapeutische studies. Contrast-verbetering, geheel mount kleuring methoden zijn gebruikt voor micro-CT beeldvorming van de zachte weefsels en16,17van de embryo's van de muis. Wij hebben vroeger een osmium gebaseerde kleuring contrast voor micro-CT beeldvorming van CCM letsels in de hersenen14verbeteren. In deze paper, gebruikten we een minder giftig, niet-destructieve, en kosten-efficiënte reagens, een jodium op basis van oplossing Lugoljodium, ter verbetering van contrast voor micro-CT beeldvorming. Jodium kan verspreiden in de hersenen en heeft een hoge affiniteit voor bloed18.
Het gedetailleerd protocol wordt hier gepresenteerd voor de inductie van CCM letsels in een neonatale muismodel samen met de beeldvorming en analyse van CCM laesies met een contrast gebaseerde micro-CT. Deze micro-CT gebaseerde methode biedt kwantitatieve global volumemeting CCM laesie, nauwkeurig identificeert het aantal en de 3D-locatie van CCM letsels in de hersenen van de muis, en sterk vermindert de kosten en tijd verplicht tot fenotype deze dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle dierenethiek en protocollen werden goedgekeurd door het Sydney lokale gezondheid District Animal Welfare Comité en institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Tianjin Medizinische Universität. Alle experimenten werden uitgevoerd onder de richtlijnen/reglementen van eeuwfeest Instituut, Universiteit van Sydney en Tianjin Medizinische Universität
1. Inductie van cerebrale Cavernous misvormingen in muismodellen
- Kruis Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl muizen met Ccm2 fl/fl voor het genereren van de nesten met Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl (Ccm2 iECKO) pups en littermate besturingselementen (Ccm2 fl/fl). Cdh5-CreErt2 en Ccm2 fl/fl dieren geweest eerder beschreven 19.
- Los 4e in 100% ethanol en opslaan bij-80 ° C in porties van 30 µL (4e concentratie: 10 mg/mL). Op de dag van gebruik, Verdun aliquoted 4e in maïsolie (0,5 mg/mL).
- Intragastrically injecteren 50 µL van 4e (0,5 mg/mL) op neonatale pups bij P1 voor het opwekken van experimentele CCM laesies met een insuline-injectiespuit.
2. Proeven van de voorbereiding van Micro-CT Scans
- euthanaseren van neonatale pups op P8 via kooldioxide verstikking.
- Intra cardiale perfusie door het invoegen van een naald 29-gauge met 3 mL 2% paraformaldehyde in PBS in een 10 mL spuit in de ventrikel van het hart van de muis uitvoeren.
Let op: Paraformaldehyde is giftig; adequate bescherming dragen. - Losmaken het hoofd van het lichaam met behulp van een schaar. Verwijder alle de huid uit het hoofd met behulp van een schaar en afschilferen van de schedel met behulp van de verlostang om te ontleden de hele hersenen.
- Het nemen van beelden van de hersenen met stereomicroscoop op 7.82 x vergroting, 1 x winst, 0.6 gamma en 20 ms belichtingstijd.
- Bevestigen de ontleed hersenen 's nachts met 4% paraformaldehyde in PBS oplossing.
Let op: Paraformaldehyde is giftig; adequate bescherming dragen. - Op de volgende dag, hindbrains met behulp van een verlostang loskoppelen en wassen met PBS oplossing.
- De hindbrains in Lugol Incubeer ' s jodiumoplossing voor 48 h.
- Na de incubatie, kort lucht drogen de hindbrains te verwijderen van de overtollige Lugol ' s jodiumoplossing.
- Pack de Lugol ' s jodium gekleurd hindbrains in 0,65 mL microcentrifuge buizen en zegel compleet met kunststof paraffine film om te voorkomen dat weefsel krimp ( Figuur 2).
- Plaats van microcentrifuge buizen in 5 mL plastic buizen met sponzen te voorkomen dat ze bewegen tijdens scan ( Figuur 2 B).
3. Micro-CT Scan van CCM in de hersenen van de muis
- Verticaal monteren de hindbrain verpakt in een buis op een aluminium houder in het systeem van micro-CT.
- De scannen parameters ingesteld op 540 projecties en 2 s blootstellingstijd met bron voorwaarden van 50 kV en 10 W te verwerven de tomografische datasets (beeld resolutie 9.5 μm/pixel).
- Röntgenfoto's van de scan worden automatisch gereconstrueerd door hardware gebaseerde projectie wederopbouw software geleverd door het systeem van micro-CT, produceren een serie van de afbeelding van 16-bits axiale segmenten (" TXM " bestand).
4. Analyse van Micro-CT Datasets
- het gereconstrueerde beeldbestand openen (" TXM " bestand) in de 3D-analysesoftware en visualiseren van de hersenen met behulp van de " volume rendering " functie.
- Transformeren de hindbrain naar de gewenste oriëntatie, met behulp van de " selectiekader " en " knipvlak " functies.
- Resample het getransformeerde beeld in de uitgebreide modus en het behoud van de grootte van voxel.
- Maken " bewerken nieuwe labelveld " op de getransformeerde afbeelding (4.3) en alleen de hindbrain met behulp van greyscale intensiteit Markeer.
- Toevoegen van de gemarkeerde gebieden en uitvoeren " label analyse " verkrijgen van metingen van de hele hindbrain (d.w.z., totaal volume en gebied). Metingen in een Excel-bestand exporteren.
- Visualiseren met behulp van de hindbrain de " isosurface rendering " functie.
- Maken een andere " bewerken nieuwe labelveld " op de getransformeerde beeld en markeren gebieden met laesies met grijswaarden intensiteit.
- Toevoegen van de gemarkeerde gebieden en uitvoeren " etiket " analyse te verkrijgen van de metingen van de laesies in het hindbrain (dat wil zeggen, totaal volume en gebied). Metingen in een Excel-bestand exporteren.
- Visualiseren van de laesies met behulp van de " genereren van oppervlakte " en " oppervlakte weergave " functies.
- Momentopname van de beelden van de hindbrain op de gewenste oriëntaties of het genereren van een film voor 3D-visualisatie van de laesies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een enkele injectie van 4e bij P1 was voldoende voor het opwekken van CCM laesies in het cerebellum. Lugoljodium jodium contrasteerde micro-CT voldoende gedetecteerd CCM laesies en kan kwantificeren zijn volume en aantal. Gebruik makend van de geoptimaliseerde micro-CT, beeld we CCM laesies in het hindbrains van Ccm2iECKO muizen. Gescande X-ray beelden werden gereconstrueerd voor de productie van de 3D-beelden van de hersenen van de muis, waardoor de visualisatie van hele letsels in de hersenen parenchym op verschillende diepten en richtsnoeren, en beoordelen van de structuur en 3D-locatie van letsels in de hersenen. Nog belangrijker is, kan de dataset van dit beeld ook worden gebruikt voor efficiënte en nauwkeurige kwantificering van de laesie maten en aantallen van de laesie.
Figuur 1 toont succesvolle inductie van CCM laesies in het cerebellum van Ccm2iECKO (B) maar niet in littermate controles (Ccm2fl/fl) (A) aan de P8.
Figuur 2 toont een ingepakte steekproef voor micro-CT-scan (A-B), en vertegenwoordiger gereconstrueerd beelden van de micro-CT-scan van de controle (Ccm2fl/fl) (C) en Ccm2 iECKO (D-E). Figuur 2 E' toont gemarkeerd laesies in Ccm2iECKO.
Figuur 3 toont een 3D-gerenderde afbeelding van de hersenen van een Ccm2iECKO met laesies (A-B). Aangrenzende tabel ziet u een voorbeeld van kwantitatieve output van de gelabelde individuele laesies.
Figuur 1 : Inductie van CCM laesies in neonatale muis. Macroscopische beelden van Ccm2fl/fl (A) en Ccm2iECKO (B) hersenen op postnatale dag 8. Balken (wit), 5 mm. schaal Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Proeven van voorbereiding en gereconstrueerd 2D beelden. Monster verpakt in een microcentrifuge buis (A) en 5 mL buisjes (B). Groene pijl toont het monster. Representatieve beelden van Ccm2fl/fl (C) en Ccm2iECKO (D-E) hersenen. (E') Gemarkeerde letsels in de hersenen Ccm2iECKO . Balken (wit), 1 mm. schaal Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : 3D-beelden weergegeven. Weergegeven beeld van Ccm2iECKO hersenen met laesies (A) en letsels enige (B). Letsels zijn rood gemarkeerd. Tabel aan de rechterkant ziet u een voorbeeld van kwalitatieve output van afzonderlijk gemarkeerd laesies. Balken (wit), 1 mm. schaal Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CCM is een gemeenschappelijke vasculaire misvormingen buikvliesontsteking tot 0,5% van de personen1. CCM kan optreden in de vorm van sporadische of familiale. Patiënt prognose is vaak onduidelijk als CCM laesies onverwacht scheuren kunnen om beroerte en andere neurologische gevolgen veroorzaken. Op dit moment is de enige behandelingsoptie operatief verwijderen letsels, die vergezeld gaan van een hoog risico.
Menselijke CCM voorwaarden hebben onlangs is gereproduceerd diermodellen7,8,9,10. Deze modellen bieden waardevolle hulpmiddelen voor het onderzoek naar mechanismen die betrokken zijn in CCM ziekte. Een accurate, efficiënte en kwantitatieve analysemethode zal bijdragen tot het benutten van de volledige waarde van deze modellen.
Onlangs hebben wij een methode van micro-CT naar afbeelding CCM laesies in muismodellen osmium tetraoxide gebruiken als een contrasterende agent14ontwikkeld. In de huidige studie, hebben we vervolgens Lugoljodium jodiumoplossing gebruikt ter verbetering van het contrast van hersenweefsel te detecteren laesies. Lugoljodium jodiumoplossing is minder giftig, niet-destructief en goedkoper in vergelijking met osmium tetraoxide. Vandaar, kunnen de monsters worden hergebruikt voor andere doeleinden, zoals histologie nadat Lugoljodium jodiumoplossing is weggespoeld.
Onze methode van micro-CT kon produceren voldoende beeldkwaliteit te sporen CCM letsels in de hersenen van de muis. De bereiding van de monsters is eenvoudig en vereist geen gespecialiseerde technieken. Deze methode kan bieden met een hoge resolutie prognoses met een tijd van de scan van ongeveer een uur. Het combineren van datasets van micro-CT-scans en een 3D-analysesoftware is een krachtige manier voor het genereren van een 3D-totaalbeeld van CCM letsels in de hersenen. De kwantitatieve en kwalitatieve vertegenwoordiging van letsels ten opzichte van de anatomie van de hersenen wordt gemakkelijk bereikt. Vergeleken met 3D-reconstructie histologie gebaseerde, onze methode is zeer tijd - en goedkoop - cost-effective en produceert veel meer accurate 3D-voorstellingen.
Er zijn echter ook beperkingen en kritische stappen worden beschouwd. Ten eerste, de methode vereist een micro-CT-systeem, dat is van zeer gespecialiseerde apparatuur en mogelijk niet beschikbaar. Ten tweede, ontrafeling van de neonatale muis hersenen kunnen zijn vrij uitdagend wegens de zachtheid en de grootte van het hersenweefsel. Het is zeer belangrijk niet te beschadigen de hersenen tijdens de dissectie om verwerven van nauwkeurige metingen en visualisatie van de CCM letsels in de hersenen. Tot slot, de bereiding van de monsters voor micro-CT-scan is van cruciaal belang. Lugoljodium gekleurd hersenen moet volledig worden verpakt om te voorkomen dat weefsel krimp als gevolg van verdamping. Monsters moeten ook veilig worden geplaatst tijdens de micro-CT-scan. Elke beweging tijdens de scan doet afbreuk aan de kwaliteit van de scan en vandaar de kwantificering en visualisatie.
Wij hebben onze methode alleen in vaste neonatale muis hersenen toegepast. Echter, deze methode heeft de capaciteit moet worden gebruikt voor andere studies waarbij verschillende monsters en kan dienen als een spannende en nieuwe tool voor andere vasculaire misvormingen onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de faciliteiten en de wetenschappelijke en technische bijstand van de Sydney microscopie & Microanalyse onderzoek faciliteit (AMMRF) en de Australische centrum voor microscopie & Microanalyse (ACMM) aan de Universiteit van Sydney. Deze studies werden gesteund door de Australian National Health en medische onderzoek Raad (NHMRC) project verlenen 161558 en APP1124011 (XZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
References
- Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis. Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).
- Liquori, C. L., et al. Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).
- Laberge-le Couteulx, S., et al. Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas. Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).
- Sahoo, T., et al. Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1). Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).
- Denier, C., et al. Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).
- Bergametti, F., et al. Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).
- McDonald, D. A., et al. A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease. Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).
- Boulday, G., et al. Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice. J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).
- Chan, A. C., et al. Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice. J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).
- Zheng, X., et al. Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor. Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).
- McDonald, D. A., et al. Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease. Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Gibson, C. C., et al. Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation. Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).
- Choi, J. P., et al. Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice. PLoS One. 11 (8), 0160833 (2016).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), 61 (2006).
- Anderson, R., Maga, A. M. A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast. PLoS One. 10 (11), 0142974 (2015).
- Zheng, X., et al. Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth. Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).
