Summary
Nieuwe hulpmiddelen voor het mechanobiology onderzoek nodig zijn om te begrijpen hoe mechanische spanning activeert biochemische paden en lokt biologische reacties. Hier presenteren we een nieuwe methode voor selectief mechanische stimulatie van geïmmobiliseerdet dieren met een val van de microfluidic waardoor hoge resolutie beeldvorming van cellulaire reacties.
Abstract
Een centrale doelstelling van mechanobiology is te begrijpen van de wederzijdse invloed van mechanische belasting op eiwitten en cellen. Ondanks het belang ervan, is de invloed van mechanische belasting op cellulaire functie nog slecht begrepen. Gedeeltelijk bestaat deze kenniskloof omdat enkele hulpmiddelen gelijktijdige vervorming van weefsels en cellen, beeldvorming van cellulaire activiteit in levende dieren en efficiënte beperking van de beweeglijkheid in anders zeer mobiele modelorganismen, zoals de nematode kunt Caenorhabditis elegans. De kleine grootte van C. elegans maakt ze een uitstekende match op microfluidics gebaseerde onderzoek apparaten, en oplossingen voor immobilisatie zijn aangebracht met behulp van microfluidic-apparaten. Hoewel deze apparaten toestaan voor hoge resolutie beeldvorming, is het dier volledig ingekapseld in Polydimethylsiloxaan (PDMS) en glas, het beperken van fysieke toegang voor de levering van de mechanische kracht of elektrofysiologische opnames. Onlangs, we hebben een apparaat dat integreert pneumatische aandrijvingen met een overlapping design die compatibel is met hoge-resolutie fluorescentie microscopie. Het kanaal van de bediening wordt gescheiden van de worm-overlapping kanaal door een dunne PDMS diafragma. Dit membraan wordt afgebogen in de zijkant van een worm door druk uit te oefenen vanuit een externe bron. Het apparaat kan richten op individuele mechanosensitive neuronen. De activering van deze neuronen is beeld op hoge resolutie met genetisch-gecodeerde calcium indicatoren. Dit artikel presenteert de algemene methode met behulp van C. elegans spanningen uiten calcium-gevoelige activiteitsindicator (GCaMP6s) in hun aanraking receptor neuronen (TRNs). De methode is niet beperkt tot TRNs noch tot calcium sensoren als een sonde, maar kan worden uitgebreid tot andere mechanisch-gevoelige cellen of sensoren.
Introduction
Het gevoel van aanraking biedt dieren met cruciale informatie over hun omgeving. Afhankelijk van de toegepaste kracht, wordt aanraking waargenomen als onschuldig, plezierig of pijnlijk. De vervorming van de weefsel tijdens aanraking wordt gedetecteerd door gespecialiseerde mechanoreceptor cellen ingebed in de huid die uitdrukken van receptor eiwitten, meestal ionenkanalen. De stappen die kracht perceptie koppelen tot activering van het kanaal van de ion tijdens touch en pijn zijn niet volledig begrepen. Nog minder is bekend over hoe het huidweefsel filters mechanische vervorming en of mechanoreceptors opsporing van wijzigingen in spanning of stress1,2,3. Deze kloof in begrip ontstaat, gedeeltelijk uit een gebrek aan geschikte instrumenten nauwkeurige mechanische stimulaties worden toegepast op het oppervlak van de huid van een levend dier tijdens het observeren van de reacties op cellulair niveau. Overwegende dat de atomaire kracht microscopie is uitvoerig gebruikt toe te passen en meten van krachten in geïsoleerde cellen4,5 , en ook om te activeren Piezo1 receptoren in levende cellen6, soortgelijke experimenten met behulp van levende dieren, met name C. elegans, zijn notoir uitdagend vanwege de intrinsieke mobiliteit van het onderwerp. Deze uitdaging is traditioneel omzeild door het gebruik van veterinaire - of chirurgische grade Cyanoacrylaat lijm te immobiliseren van individuele dieren op agar pads1,7,8,9. Deze aanpak is productief, maar heeft beperkingen met betrekking tot de vaardigheid die nodig is voor immobilisatie door lijmen en de oppervlakte van de zachte agar op mechanische naleving. Een microfluidics strategie is een gratis alternatief, dat enkele van de complicaties die verband houden vermijdt met het lijmen.
De nematode C. elegans is een genetisch modelorganisme met een volledig toegewezen zenuwstelsel dat, vanwege de grootte van het dier, een goed geschikt voor microfluidics technologie is. Microfluidics-gebaseerde apparaten bieden het voordeel dat het anders zeer mobiele dieren kunnen worden gefixeerd tijdens het uitvoeren van high-resolution beeldvorming en levering van relevante neuro-f stimuli. Met de hulp van microfluidic kunnen technologieën, leven dieren zonder schade10,11, waardoor controle van gedrags bedrijvigheid gedurende de gehele levensduur12,13 en met hoge resolutie worden geïmmobiliseerd Imaging van neuronale activiteit14,15,16,17. Verder veel mechanoreceptor neuronen die nodig is voor het gevoel van aanraking en pijn kan gekarakteriseerd worden op hun fysiologische1,8, mechanische4,18,19, en moleculaire niveau20,21,22.
C. elegans zintuigen zachte mechanische prikkels aan de muur van haar lichaam met behulp van zes TRNs, waarvan er drie innervate van het dier anterior (ALML/R en AVM) en drie van die innervate van het dier posterior (PLML/R en PVM). De ion kanaal moleculen die nodig zijn voor het transducing een toegepaste kracht in een biochemische signaal zijn uitvoerig bestudeerd in haar TRNs8. Dit artikel presenteert een microfluidic platform23 waarmee onderzoekers toe te passen nauwkeurige mechanische krachten op de huid van een geïmmobiliseerdet C. elegans rondworm, terwijl het uitlezen van de vervorming van zijn interne weefsels door optische beeldvorming. Naast de presentatie van welomschreven mechanische stimuli, kunnen calcium transiënten worden opgenomen in de mechanoreceptor neuronen met subcellular resolutie en gecorreleerd met morfologische en anatomische kenmerken. Het apparaat bestaat uit een centrale overlapping-kanaal dat een enkel dier houdt en presenteert haar huid naast Pneumatische bediening kanalen (Figuur 1 en Figuur 2). De zes kanalen staan langs het kanaal van de overlapping voor mechanische prikkels naar elk van de zes TRNs van de worm. Deze kanalen zijn gescheiden van de kamer van de overlapping door dunne PDMS pessarium, die kunnen worden aangedreven door een externe lucht druk bron (Figuur 1). Wij gekalibreerd de uitwijking ten opzichte van de druk en de metingen in dit artikel bieden. Elke actuator kan worden individueel gericht en gebruikt ter stimulering van een mechanoreceptor van keuze. De druk wordt geleverd met een piëzo-gedreven drukpomp maar alternatieve apparaat kan worden gebruikt. We laten zien dat de druk-protocol kan worden gebruikt om te activeren TRNs in vivo en demonstreren van huishoudelijke apparaten geschikt voor het leveren van mechanische stimuli aan volwassen C. elegans, laden van volwassen dieren in apparaten, uitvoeren van calcium imaging experimenten, en analyseren van de resultaten. Apparaat fabricage bestaat uit twee hoofdstappen: 1) fotolithografie te maken van een mal van SU-8; en 2) molding PDMS om een apparaat te maken. Ter wille van de beknoptheid en duidelijkheid, worden lezers verwezen naar eerder gepubliceerde artikelen en protocollen24,25 voor instructies over hoe de mallen en de apparaten te produceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. apparaat Fabrication
- Download het bestand van de bijgevoegde masker (aanvullende bestand 1) en genereren van een chrome-masker met een commerciële dienst of in-house faciliteit. Als de kleinste dimensie op het apparaat is 10 µm (dikte van de membraan van de bedieningssleutel), ervoor zorgen dat het masker voldoende hoge resolutie, binnen ± 0,25 µm, tot de functies betrouwbaar.
-
Volg SU-8 fotolithografie standaardmethoden (bijvoorbeeldverwijst naar24,25,26) te fabriceren van de mal voor de productie van PDMS apparaten; Hieronder vindt u een overzicht van de stappen.
Opmerking: SU-8 is een lichtgevoelige materiaal, welke crosslinks bij blootstelling aan UV-licht (Maximale absorptie ~ 365 nm). Gebruik de instructies van de fabrikant als uitgangspunt voor het bepalen van de verwerkingsparameters voor de soft-bak, blootstelling (UV), en na het bakken.- SU-8-2002 storten op een silicium wafer en spin-jas het met een geschatte dikte van 2 µm, voor betere hechting van kleine structuren. Soft-bakken op een hete plaat voor 1 min bij 95 ° C, iets te veel bloot (UV) de gehele oppervlakte (~ 100 mJ/cm2), en na bakken op een hete plaat voor 2 min bij 95 ° C.
- Spin-vacht een dikke laag van de 47-µm van SU-8 2050 voor het definiëren van de functies van het apparaat. Gebruik een vrille vaart voor 500 rpm voor 15 s (130/s rpm versnelling) en dan 2.000 rpm voor 90 s (260/s rpm versnelling). Zonodig herhalen en de snelheid van de rotatie om de juiste dikte van fotoresist aanpassen.
- Soft-bakken op een hete plaat gedurende 2 minuten bij 65 ° C, en vervolgens gedurende 7 minuten bij 95 ° C. Bloot de fotoresist volgens de instructies van de fabrikant (~ 160 mJ/cm2) met behulp van een chrome-masker en long pass filter om rechte zijwanden.
- Verwijder het zegel en post bakken op een hete plaat voor 1 min bij 65 ° C en gedurende 7 minuten bij 95 ° C.
- Ontbinden onbelicht SU-8 met developer, en reinig met 2-propanol.
- Bak het zegel op een kookplaat bij 180 ° C gedurende 30 minuten (hard-bak) te stabiliseren fotoresist functies.
-
Een PDMS replica van het model van de SU-8 met behulp van standaard replica molding methoden27maken.
- Behandel de mal van de SU-8 met trichloromethylsilane (TCMS) damp te verminderen PDMS hechting (silanization).
Let op: TCMS is giftig en water-reactief.- Plaats de patroon wafer in een rack wafer binnen een exsiccator Stolp vacuüm in een zuurkast vrij van water of in water oplosbare reagentia.
- Onder de motorkap, kunt een druppelaar 1 druppel TCMS toepassen in een glazen schaal en plaats binnen de exsiccator.
- Sluit het deksel exsiccator en toestaan TCMS damp jas de wafer voor minstens 20 min.
- Ventileren en open vervolgens de exsiccator. Open het deksel van de glazen stolp en verwijder de wafer met behulp van kunststof pincet. Plaats in een petrischaal of aluminium folie boot voor PDMS replica molding. TCMS beklede materialen in de juiste gevaarlijk afval afvoeren.
- Mix PDMS (ratio 10:1) gebruik van 40 g van de basis polymeer en 4 g PDMS uithardende agent.
- Giet het mengsel over de SU-8 schimmel en ontgas het mengsel gedurende ten minste 30 min. in een vacuuemcel.
- Genezen voor ten minste 6 uur bij 70 ° C in een oven.
- Behandel de mal van de SU-8 met trichloromethylsilane (TCMS) damp te verminderen PDMS hechting (silanization).
- Til PDMS van het zegel door de wafer horizontale op een vlakke ondergrond en zorgvuldig het PDMS peeling uit. Niet knikken de wafer naar boven tijdens deze stap, als het de mal breken kan.
Opmerking: Onvolledige hechting van SU-8 op de wafer of onvolledige silanization kan leiden tot vernietiging van de SU-8-structuren tijdens deze stap. - Snijd PDMS rond de apparaten in individuele fiches, zodanig dat de apparaten op een 24 x 60 mm dekglaasje aan zal passen.
- Maak met een 1-mm biopsy punch gaten in de inlaat, twee stopcontacten en zes aandrijvingen met behulp van een 1-mm biopsy punch. Streven naar de 2 mm diameter cirkels rond de randen van het apparaat.
-
Bond PDMS spaanders aan glas cover slips.
- Beide oppervlakken 80 W zuurstof plasma bloot (30 s).
- Voorzichtig Schakel de blootgestelde oppervlak van het PDMS op het blootgestelde oppervlak van de slip van de cover voor een hoekgetrouwe seal.
- Ontharden van het apparaat op een warmhoudplaat (100 ° C, 10 min).
Opmerking: Onvoldoende hechting kan leiden tot het falen van het apparaat als gevolg van lekkage.
2. voorbereiding van de Microscoop
Opmerking: Transgene dieren: express een calcium-indicator zoals GCaMP6s28 of andere genetisch gecodeerde activiteit sonde in de neuron(s) van belang (b.v.TRN); Co express een activiteit-onafhankelijke TL proteïne die op een verschillende golflengte om te corrigeren voor de kleine laterale en out-of-focus bewegingsartefacten die ontstaan als gevolg van mechanische stimulatie. De geautomatiseerde analysesoftware tracks en compenseert verkeer-geïnduceerde veranderingen in de intensiteit van de activiteit-sonde. De worm stammen GN69223 (of AQ323629) express GCaMP6s (of GCaMP6m) en de calcium-onafhankelijke tagRFP onder de controle van mec-7 promotor. Daarnaast bevat GN692 de mutatie lite-1(ce314), die voorkomt activatie van TRNs als gevolg van de blauwe lichtsensor lite-130 tijdens de excitatie van de GCaMP6s fluorescentie23 dat.
-
Opzetten van een systeem van de Microscoop voor gelijktijdige excitatie van GCaMP en RFP.
- Gebruik ofwel een continue lichtbron en een dual-band excitatie filter dat alleen cyaan en geel licht uitzendt, of gebruik een lichtbron die alleen golflengten in een bepaalde bandbreedte zoals gelijktijdige cyaan stoot (0.77 mW) en gele (1.21 mW) LED excitatie bronnen voor gelijktijdige excitatie van de calcium-afhankelijke en onafhankelijke fluorescentie, respectievelijk.
- Het gebruiken van een digitale camera om opname van microscopie beelden.
Opmerking: De meeste camera's worden geleverd met een software voor Beeldacquisitie. Anderzijds zijn er vrij beschikbare software die kan worden gebruikt om controle van de camera en mogelijk ook andere delen van het systeem van de microscopie. - Excitatie-intensiteit op basis van de intensiteit van de fluorescentie te vermijden camera verzadiging aanpassen.
-
Gebruik een fluorescentie-kubus die afhankelijk van de keuze van de excitatie-bron moet worden uitgerust met een excitatie-filter.
Opmerking: Een 488-nm GFP en 580-nm mCherry excitatie filter werd hier gebruikt.- Een balk splitter toevoegen aan de kubus voor weerspiegelt cyaan en geel licht en het verzenden van groen en rood licht.
- Uitrusten van de microscoop met een 10 X doelstelling en de doelstelling van een high-vergroting (b.v., 63 X / 1,32 nb olie) te concentreren het licht op de steekproef excitatie.
- Monteer een balk splitter voor de camera voor gelijktijdige opname van de GCaMP en de calcium-onafhankelijke-signaal. Zorgen dat de balk splitter een dichroïde spiegel is (lang doorgeeft, de licht-donkerscheiding bij 570 nm) te scheiden van de groene en rode licht met behulp van een emissie filter voor groen (passband gecentreerd op 525 nm met 50 nm breedte) en één emissie filter voor rood licht (passband gecentreerd op 632 nm met 60 nm breedte).
- Project groene en rode fluorescentie op de bovenste helft (groen) en de onderste helft (rood), respectievelijk van de camera chip (Zie Figuur 3). Deze oriëntatie is een voorwaarde voor de meegeleverde analysesoftware.
3. dierlijke voorbereiding
- Bereiden van leeftijd-gesynchroniseerde jong volwassene of volwassen dag één C. elegans, zoals eerder is beschreven door Porta-de-la-Riva et al. 31
- De microfluidic-chip voor te bereiden.
- Sluit het reservoir van de stroom zwaartekracht (~ 60 cm boven de chip) bevattende gefilterd (0.2-µm polyethersulfon spuit filter) M9 buffer naar één uitlaat van de chip. Sluit de andere uitlaat aan één uitlaat van een twee-outlet afval container, dat wil zeggen, een filtreerkolf. De andere uitlaat van de afval container verbinden met een peristaltische pomp.
Opmerking: Gebruik van polyethyleen (PE) slang voor alle verbindingen en metalen pijpfittingen de PE buizen verbinden met de chip. Op deze manier alle afval oplossingen zal worden gespoeld uit de chip en verzameld in de afval container. De stroom door de uitgang-kanalen wordt gemaakt van een zachte zuigkracht die de worm knus tijdens het overvullen later houden zal. - Bereiden interconnects bestaande 50-mm lange PE buis (0.9652-mm OD, 0.5842-mm ID) met metalen buis (gauge grootte 23TW, 0.635-mm OD) aan beide uiteinden. Pers-fit deze interconnects in elk van de zes vingers van de bediening en in de inlaat van de worm (Zie Figuur 1). Laat deze interconnectoren in de chip, zoals herhaalde verwijdering leidt tot slijtage van de PDMS gaten.
- Sluit het reservoir van de stroom zwaartekracht (~ 60 cm boven de chip) bevattende gefilterd (0.2-µm polyethersulfon spuit filter) M9 buffer naar één uitlaat van de chip. Sluit de andere uitlaat aan één uitlaat van een twee-outlet afval container, dat wil zeggen, een filtreerkolf. De andere uitlaat van de afval container verbinden met een peristaltische pomp.
- Plaats de chip op de Microscoop. Pick 2 – 5 wormen in een druppel gefilterd (0.2-µm spuit filter) M9 buffer en een spuit van 1 mL te stellen ze in een PE-buis verbonden met een spuit van 1 mL door zachtjes te trekken van de zuiger (0.9652-mm OD, 0.5842-mm ID) gebruiken. De dieren houden in de PE-buis en niet in de spuit.
Opmerking: Teveel wormen of ongefilterde oplossingen in de chip kunnen leiden tot verstopping. - Sluit de PE-buis van de injectiespuit op de interconnect bij de inlaat van de worm (Figuur 1 en Figuur 2) van de chip. Activeren van de stroom van de zwaartekracht door de klep te openen en beginnen met de peristaltische pomp. Druk zachtjes op de zuiger van de spuit van de spuit om te verplaatsen van de dieren in het kanaal van de vangst met inachtneming van het kanaal onder een microscoop met een 10 X zoomlens in helderveld modus.
Opmerking: Soms verschijnen luchtbellen vormen geen probleem; ze worden meestal automatisch verplaatst naar het stopcontact. Verschillende dieren kunnen worden 'geparkeerd' in de wacht kamer en achter elkaar gebruikt.- Na het laden van het dier in het kanaal van de overlapping (Zie ook Figuur 2), haar positie aanpassen door zachtjes duwen of het trekken van de zuiger van de spuit om de positie van het hoofd van het dier in de taps toelopende vorm van de voorkant van het kanaal.
- Zorg ervoor dat de worm (volwassen dag 1) heeft de juiste grootte worden gevangen in de chip.
- Als de worm niet het gehele dwarsdoorsnede van het kanaal van de neus vult tot in de buurt van het einde van het lichaam (niet met inbegrip van het puntje van de staart) of de worm langs de as van het kanaal beweegt zonder te bewegen de plunjer van de injectiespuit , de worm verwijderen door op de plunjer van de injectiespuit te drukken totdat het verdwijnt uit het overvullen kanaal en een nieuwe te laden (zie stap 3.8).
- Overschakelen naar de modus van de fluorescentie van de Microscoop en een hogere vergroting lens (40 X of hoger) en controleer of de neurite van het neuron van belang komt te liggen in het membraan van één van de actuatoren. Als dat niet het geval is, de positie van het dier aanpassen door trekken of duwen de plunjer. Als dat niet helpt, verwijderen van de worm en laden van een nieuwe transactie.
- Focus op de cel lichaam van het neuron van belang en de interconnectie van de bedieningssleutel dichtst bij het neuron aan de voorste kant van de cel lichaam verbinden met een programmeerbare drukpomp met behulp van PE buis.
- Als het experiment wordt vereist voor het meten van de afstand tussen de bedieningssleutel en het neuron, verplaatsen van het gezichtsveld, zodat beide in het gezichtsveld zijn en de channelwall loopt parallel aan de bovenste en onderste rand van de afbeelding.
- Definieert een protocol van de druk met behulp van de programmeerbare drukpomp.
Opmerking: Dit protocol kan worden aangepast aan de gewenste experiment.- Beginnen met een constante druk van 0 kPa voor een tijd overeenkomt met ten minste 50 afbeeldingen van de reeks afbeeldingen (nodig voor normalisatie). Voor een imaging tarief van 10 Hz dit komt overeen met 5 s. toevoegen een gewenste impuls golfvorm en druk en definiëren van de lengte van de stimulus als tweede stap.
Opmerking: Om de TRNs te stimuleren, een sinusoïdale stroom van (dat wil zeggen, 75 kPa, 10 Hz) bovenop met een stap (d.w.z., 275 kPa) wordt aanbevolen omdat het een grote neuronale reactie genereert. - Als het experiment extra prikkels vereist, opgenomen in een periode van ten minste 10 s bij een constante druk van 0 kPa tussen stimuli. Voordat de drukpomp inschakelen, door ervoor te zorgen dat de instrument druk is bij constante 0 kPa om te voorkomen dat per ongeluk stimulatie van de worm voordat het werkelijke experiment.
- Beginnen met een constante druk van 0 kPa voor een tijd overeenkomt met ten minste 50 afbeeldingen van de reeks afbeeldingen (nodig voor normalisatie). Voor een imaging tarief van 10 Hz dit komt overeen met 5 s. toevoegen een gewenste impuls golfvorm en druk en definiëren van de lengte van de stimulus als tweede stap.
- De beeldvorming en druk-protocol worden uitgevoerd.
- In de afbeelding acquisitie software van de camera, opgezet een Afbeeldingsvolgorde bij 10 Hz met behulp van een belichtingstijd van 100 ms voor de duur van de druk-protocol. Stel de excitatie-intensiteit zo in dat de verhoging van de maximale fluorescentie niet van de camera verzadigen doet. De afbeeldingen opslaan als een bestand van de *.tif met ten minste 50 afbeeldingen vóór de eerste prikkel voor normalisatie.
- Start het imaging protocol in de afbeelding acquisitie software en het protocol van de druk in de software van de programmeerbare pomp. Tijdens het opnemen, observeren of het neuron van belang de helderste plek in een gebied van 10 x 10 pixels is, niet verder dan 10 pixels in opeenvolgende beelden verplaatst, en in het gezichtsveld tijdens de opname blijft.
Opmerking: Als dit niet gebeurt, de analysesoftware mislukt. Lichtpuntjes (d.w.z. autofluorescence) rond het neuron maken schoon van opnames van de neuronen moeilijk. Om dit te corrigeren, verwijderen van de worm uit de val en laadt een nieuwe worm in de chip. Als de worm teveel beweegt, probeer een nieuwe opname van de dezelfde worm en observeren van de beweging van de worm. Als het probleem aanhoudt is de worm mogelijk te klein om te worden opgesloten. In dit geval deze worm verwijderen en laadt een lichtjes grotere worm in de val. - Indien gewenst, signalen van meerdere neuronen in het gezichtsveld tegelijk opnemen, zolang de neuronen worden gescheiden door minstens 10 pixels tijdens de hele opname.
- Voer het experiment om te onderzoeken gewenning, herhaaldelijk op een dier.
- De worm verwijderen uit het kanaal van de overlapping.
- Als het gewenst is om te houden van de worm voor latere studies, Los de verkooppunten van de chip naar de stroom van de zwaartekracht en de afval container. Druk zachtjes op de plunjer van de injectiespuit totdat de volledige worm wordt geduwd door de overlapping-kanaal in het kanaal van de stroom.
- Blijven op de plunjer van de injectiespuit te drukken tot het dier in een droplet buiten de chip wordt weergegeven. Verbreken van de spuit met inbegrip van de PE-buis van de inlaat van de worm, gebruiken om de wormen in de druppel gecombineerd en overbrengen naar een agarplaat.
- Als het niet gewenst is om te houden van de worm, de worm verwijderen door op de plunjer van de injectiespuit te drukken totdat de volledige worm wordt geduwd door het kanaal van de overlapping in het stroom kanaal; de stroom van de zwaartekracht en de zuigkracht van de peristaltische pomp zal dragen het dier uit een chip en in de afval container.
4. analyse
- Download en installeer de nieuwste versie van Fiji32.
- Download en installeer de nieuwste versie van de java SDK.
Opmerking: Indien nodig, verwijderen of hernoemen van de java-map in de map van de Fiji voor Fiji te gebruiken van de geïnstalleerde java-compiler. -
Open Fiji software.
- Controleer of de software de geïnstalleerde java-compiler is actief door te openen ' Plugins | Utilities | ImageJ | Eigenschappen.
- Download het bestand pokinganalyzer*.java (https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer, Zie aanvullende bestand 2).
- Slepen en neerzetten van het Java-bestand in het venster software te openen als een plugin.
-
Compileren en uitvoeren van het pokinganalyzer*.java-bestand door op Ctrl + R te drukken in Fiji; een grafische gebruikersinterface (prikken Analyzer) zal openen (Figuur 3).
- Klik op het tabblad "Help" en lees over de eisen van de software en het uitvoeren van de analyse. Om te beginnen, selecteer de "Open video" tab. Geef de locatie van het videobestand voor de analyzer: Klik op de knop "Open een Video", navigeer naar de locatie van de video, en open het.
Opmerking: De software begint met dit tabblad geopend. Als het niet geopend bij het starten van een nieuwe analyse Klik op het tabblad "Open video". Als de video in a.tif-indeling is, wordt intern open de video en de eerste afbeelding weergeven in het onderste deel van de interface. Als het beeld niet van de video die moet worden geanalyseerd is, klik op de knop "Open een video" te openen van een andere video. - Als u wilt doorgaan, klikt u op op het tabblad "Define ROIs". In dit tabblad bepalen de positie van de TRN. Merk op dat het eerste beeld van het geopende wordt weergegeven in het onderste gedeelte van dit tab. Klik op de knop "Define TRN", en klik op het neuron in het bovenste gedeelte van de getoonde foto, die de GCaMP-fluorescentie moet worden weergegeven.
- Optioneel: Als de bedieningssleutel zichtbaar in de bovenste helft van het beeld is het programma automatisch kunt de afstand tussen het neuron en de bedieningssleutel indien gewenst. Controleer hiervoor de "definiëren de bedieningssleutel?" -vak, klikt u op de knop "Define Actuator" en klik op de bedieningssleutel in de bovenste helft van het beeld.
- Klik op de "Analyse" tab. definiëren de beeldsnelheid van de overname. Hetzij een nummer invoert in het veld of klik de omhoog of omlaag knoppen om Verhoog of verlaag de waarde. Als in het vorige tabblad de "definiëren de bedieningssleutel?" -vakje is aangevinkt, bepalen de grootte van de cel van de camera, de vergroting en de binning factor, zodat het programma kan het berekenen van de afstand.
- Klik op de knop "Start Analysis".
Opmerking: Het programma nu houdt het neuron door haar fluorescentie in de Afbeeldingsvolgorde van de in de bovenste helft (calcium afhankelijk) en in de onderste helft (calcium onafhankelijke) van de reeks afbeeldingen. Ter verantwoording voor neuron bewegingen in het vlak van het opnemen van het programma zal het onderzoeken van een gebied van 10 x 10 pixels rond de locatie van het neuron in de vorige afbeelding te vinden van de positie van het neuron in de volgende afbeelding. Het zal berekenen de fluorescentie in beide helften door de correctie voor de achtergrond fluorescentie (Fbg) en te delen door de fluorescentie in de eerste 50 beelden (F0):
Fluorescentie veranderingen in het groen, activiteit-afhankelijke kanaal (FCa2 +) die worden veroorzaakt door neuron beweging uit het vliegtuig voor de hercodering zijn dan gecorrigeerd met behulp van de fluorescentie in het rood, activiteit-onafhankelijke kanaal (F corr) en de standaardafwijking van de pre stimulans van de calcium-afhankelijke (sdCa2 +) en onafhankelijke fluorescentie (sdcorr) door:
- De voortgang wordt weergegeven in de statusbalk in het onderste deel van de interface; Wanneer de statusbalk bereikt 100%, klik op het tabblad "Resultaten". Als de statusbalk stopt voordat 100%, zal het programma geven een foutmelding met vermelding van de reden dat het programma kan niet het analyseren van de video.
- Als het signaal / ruisverhouding te laag is, het programma niet het identificeren van het neuron; aanpassen van de imaging parameters in latere opnames.
- Als het neuron het gezichtsveld tijdens de opname verlaat, het programma kan het niet meer bijhouden en stopt. Voor latere opnamen, plaatst u het neuron in het midden van het gezichtsveld aan het begin van de opname.
- Als sommige regio's in het gezichtsveld zijn oververzadigd, kan de geautomatiseerde analyse ongeldige resultaten zal opleveren. Voor de opnames van het latere, door ervoor te zorgen dat de fluorescentie signaal doet niet verzadigen van de sensor van de camera.
- In het tabblad 'resultaten' wordt het resultaat weergegeven in het bovenste gedeelte. Een door tabs gescheiden txt-bestand van de resultaat tabel opslaan door te klikken op "The Table resultaat opslaan".
Opmerking: Deze tabel bestaat uit de tijd in seconden en de genormaliseerde calcium-afhankelijke fluorescentie (gecorrigeerd door de calcium-onafhankelijke fluorescentie). Als eerder gedefinieerd, bevat het ook de totale afstand tussen de TRN en de bedieningssleutel in µm en de afstand tussen de TRN en de bedieningssleutel loodrecht op de muur van het kanaal in µm. representatieve resultaten van de intensiteit van de fluorescentie te verhogen na stimulatie ten opzichte van de afstand van het lichaam van de cel naar de dichtstbijzijnde bedieningssleutel worden weergegeven in Figuur 4. - Als er meerdere neuronen in één opname (gescheiden door meer dan 10 pixels), klik op het tabblad "Define ROIs" opnieuw en terug te keren naar stap 4.6.2 met het tweede neuron.
- Klik op het tabblad "Help" en lees over de eisen van de software en het uitvoeren van de analyse. Om te beginnen, selecteer de "Open video" tab. Geef de locatie van het videobestand voor de analyzer: Klik op de knop "Open een Video", navigeer naar de locatie van de video, en open het.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SU-8 lithografie en Chip binding
Het protocol van de lithografie en PDMS molding Volg standaardprocedures. Details kunnen worden gevonden elders23,24,25,26. De PDMS moeten afschilferen van de wafer zonder problemen na het uitharden. Als de SU-8 functies tijdens PDMS peeling bestelen, was de SU-8 hechting laag of de silanization ontoereikend. Als plasma-activering van de coverslips van het glas en de PDMS chips niet voldoende is, zwakke binding kan resulteren in lekkage uit het overvullen kanaal of pneumatische aandrijvingen, wat resulteert in verminderde prestaties en gebrek aan stimulatie. Als vloeistof lekkage duidelijk is, is de chip niet bruikbaar.
De prestaties van de bedieningssleutel
Alle de PDMS actuators en de slang die verbinding maken met de chip naar het reservoir van de lucht moet goed worden verzegeld zodat de juiste Pneumatische bediening van het pessarium. Herhaalde inbrengen en verwijderen van de PE-buis (sanitair) zal schade PDMS gaten en leiden tot een afname van de druk. Dergelijk verlies van druk zal beperken actuator doorbuiging en de kracht toegepast op de huid van het dier geïmmobiliseerdet. Doorbuiging van het middenrif kan worden gemeten met behulp van een leeg (geen enkel dier aanwezig)-chip door uitvoeren van meerdere cycli van de bediening met de gewenste druk en de kwantitatieve waarden met theoretische voorspellingen te vergelijken. De uitwijking van het middenrif werd niet gemeten in aanwezigheid van een dier in het kanaal van overlapping, omdat de membraan en worm grens zijn moeilijk te visualiseren. Dit maakt precisie kalibratie met het gevangen dier niet mogelijk. Tabel 1 bevat de verwachte uitwijking als een functie van de druk. Deze waarden werden berekend aan de hand van de theorie van de elastisch plaat en details kunnen gevonden worden in Nekimken et al. 23 deze relatie wordt verwacht om te variëren met verschillen in diafragma dikte gegenereerd tijdens chip gieten en andere factoren, zoals de integriteit van de hechting tussen de chip en de glas- en zeehonden de chip verbinden met de bronnen van de druk. Waarden waren hier, reproduceerbare met lichte variatie niet meer dan 1 µm bij 450 kPa van druk. Wij de prestaties van het pessarium voor alle drie verschillende stimulans profielen hebben gekenmerkt en de geïnteresseerde lezer verwijzen naar Nekimken et al. 23 in samenvatting, er zijn verschillende factoren te overwegen als de waarden van tabel 1 afwijken: 1) een lek in de slang of buis connectoren, 2) de PDMS heeft een verschillende elasticiteit, die uit een alternatieve verhouding van basis polymeer en genezen agent voortvloeien kan, of 3) de PDMS heeft veroudering en bleef dwarslijn na verloop van tijd. Daarom wordt gebruik van chips die zijn opgesteld binnen een maand na hun toepassing aanbevolen.
Overlapping prestaties
Na het invoegen van de wormen in de inlaat van de chip, moet een zachte druk met de spuit plaats één enkel dier binnen het kanaal van overlapping en presenteren van haar huid naast de zes stelaandrijvingen (Figuur 1). Bovenal hoeft de neus van het dier niet noodzakelijkerwijs te uitsteken in het reservoir van de buffer. In plaats daarvan, is het belangrijker om te plaatsen het dier zodanig dat de neurite naast de dichtstbijzijnde bedieningssleutel ligt en haar cel lichaam binnen het gezichtsveld van de Microscoop is. Om te bereiken optimale neuronale activering, moet de afstand tussen de bedieningssleutel en cel lichaam worden aangepast zodat de bedieningssleutel anterior to de cel lichaam van belang ligt. In onze ervaring zullen neuronen gestimuleerd dat posterieure aan het lichaam van de cel, geen activatie vindt plaats en calcium transiënten afwezig is. Juiste immobilisatie kan worden bereikt met jonge volwassene of een - oude dag hermafrodieten (apparaten die zijn geoptimaliseerd voor deze twee leeftijden zijn beschikbaar op de dezelfde masker). Kleinere dieren zal uitglijden in de collectie reservoir of lateraal verplaatst binnen het kanaal van de overlapping. Dieren die te groot zal worden geperst in het kanaal, dat leiden voortijdige activering van de TRNs en de latere mislukking tot kan te detecteren mechanoreceptor transiënten. Ook, verwijdering van grote wormen is uitdagend, leidt tot dood van het dier en/of verstopping van het apparaat. Met dit ontwerp, niet kan het neuron PLM meestal worden geïmmobiliseerd volledig, dus het is vrij om te bewegen lateraal en verticaal. Hoewel we PLM neuronen hebt geactiveerd, is opname van calcium transiënten in deze neuronen moeilijk te wijten aan de verticale beweging van de staart. Een ander ontwerp van de overlapping is gebruikt voor het opnemen van PLM33.
Beeldvorming van Calcium Transiënten- en analyse
Eenmaal in de plaats, de dieren kunnen worden gestimuleerd met behulp van een van de zes stelaandrijvingen. De zes actuators zijn gepositioneerd om te leveren van de mechanische prikkels aan elk van de zes TRNs. Een microfluidic stroomregelaar verbonden met een 450-kPa in-house druk bron werd gebruikt om te leveren aan het dier een protocol van de stimulans die bestaat uit een 2-s 275 kPa stap, een oprit 2-s 0 – 275 kPa en een 2-s buzz (een 75 kPa, 10 Hz sinus bovenop met een stap van 275 kPa) , elk gescheiden door een wachttijd van 10 s. Het gelijktijdig opgenomen beeld-sequenties van de calcium transiënten werden geanalyseerd in Fiji, met behulp van een aangepaste-geschreven software beschikbaar op onze GitHub-account (zie hierboven en https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer). We vonden dat druk hellingen en druk stappen geactiveerd TRNs alleen als de prikkels druk boven 400 kPa bereikt. Daarentegen is een robuuste activering van alle TRNs gestimuleerd met behulp van een sinusoïdale, 10-Hz buzz bij druk < 275 kPa werd waargenomen (Figuur 4). In het algemeen, TRNs beter gereageerd op een korte sinusvormige prikkel (genaamd 'buzz'), in overeenstemming met eerdere rapporten met behulp van verschillende methoden1,9. De stimulatie met een buzz is zeer efficiënt, wat leidt tot ~ 90% van de activering in alle neuronen en proeven getest (Figuur 4). Verrassend, was er geen sterke correlatie waargenomen op of de prikkel was toegepast op de dorsale of de ventrale zijde, en onafhankelijk van de afstand tussen de cel lichaam en de positie van de stimulans op de neurite was. Toekomstige studies zal moeten onderzoeken of de vertraging van de maximale respons met de afstand van de prikkel correleert.
Figuur 1: overzicht van de chip ontwerp. (A) Schematische lay-out van de photomask en de resulterende chip met alle verbindingslijnen aangegeven. Er zijn zes bediening vingers, drie aan elke kant van het kanaal van de centrale overlapping. Schaal bar = 3 mm. (B) foto van het microfluidic-apparaat met PDMS gebonden aan het dekglaasje aan en verbonden met leidingen in de inlaat van de worm en de afzetmogelijkheden van de worm. Slechts één van de vingers van de bediening is verbonden met de bron van de druk, terwijl de andere vijf zijn niet bezet. Delen van de figuur hebben van referentie23 onder creative common licenties zijn gereproduceerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Close-up van het kanaal van de centrale overlapping en overlapping procedure. (A) Schematische tekening van de overlapping-kanaal. De pijlers aan de inlaatzijde van de worm helpen oriënteren van de worm te vergemakkelijken laden van het dieren. De bediening vingers onder druk kunnen worden en een dun membraan in het gevangen specimen streepje. Schaal bar = 200 µm. (B) vertegenwoordiger video frame van een worm verstrikt te raken in het horizontale kanaal. Het kanaal is zodanig ontworpen dat de worm komt te leggen over de zes pneumatische aandrijvingen. Staart is links, hoofd naar rechts. Locatie van persoonlijk tintje receptor neuronen (TRNs) zijn aangegeven met pijlen en met het label in de afbeelding. Schaal bar = 100 µm (in alle panelen). Delen van de figuur hebben van referentie23 onder creative common licenties zijn gereproduceerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: overzicht van de verstrekte Fiji-plugin voor het analyseren van calcium sporen verworven met dit protocol. De software begint een grafische gebruikersinterface. Het eerste tabblad ("Open video") van de gebruikersinterface ziet u de knop voor het openen van een video, toont het pad en het eerste frame van de geopende video. Het tweede tabblad ("Define ROIs") bevat de knop als u wilt definiëren een aanraking receptor neuron, een checkbox voor het activeren van de knop "Define Actuator" en de knop "Define Actuator". In het onderste gedeelte, wordt het eerste frame van de video weergegeven. In het bovenste gedeelte van het derde tabblad ("analyse"), worden instelbare parameters voor de analyse van de afbeelding weergegeven. Het middelste deel toont de "Start Analysis" knop. In het onderste deel toont een voortgangsbalk de voortgang van de huidige analyse. In het vierde tabblad "Resultaten", wordt het resultaat weergegeven als een grafiek van de intensiteit van de relatieve fluorescentie na verloop van tijd. In het onderste deel is er een knop de tabel resultaat wilt opslaan. In de vijfde tabblad "Help", wordt een help-tekst weergegeven waaruit de vereisten voor de analysesoftware en instructie op hoe het te gebruiken. Figuur aangepast van referentie23 onder creative common licenties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: individuele neuronen reageren op mechanische stimuli. (A) representatieve fluorescentie opname van GCamP6s label AVM touch receptor neuron vóór en na mechanische stimulatie met een buzz. Schaal bar = 10 µm. kleurenschaal = 1.500-3.500 grijswaarden. (B) Stimulus protocol, met inbegrip van 2 s middenrif excitatie vertegenwoordigen een 275 kPa stap, een oprit 275 kPa en een sinus (75 kPa; 10 Hz) bovenop met een stap van 275 kPa (gezoem). (C) genormaliseerd GCamP6s intensiteit trace (bedoel ± SEM als gearceerde gebied) opgenomen van AVM gestimuleerd met het profiel weergegeven in B van wild type dieren (groen, n = 14) en dieren mutant in het mechanoreceptor kanaal subeenheid mec-4 (blauw, n = 10), dat wil zeggen bekend om reacties op mechanische belasting. Dit geeft aan dat de transiënten zijn geïnduceerd door de toegepaste mechanische stimuli. Delen van de figuur hebben van referentie23 onder creative common licenties zijn gereproduceerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Druk (kPa) | Bedoel doorbuiging (µm) | SD | Verwachte doorbuiging (µm) |
| 0 | -0.01 | 0,01 | 0 |
| 50 | 0.77 | 0.26 | 0.607143 |
| 100 | 1,57 | 0,58 | 1.21429 |
| 150 | 2.32 | 0.65 | 1.82143 |
| 200 | 3.13 | 0,74 | 2.42857 |
| 250 | 3.86 | 0.79 | 3.03571 |
| 300 | 4.61 | 0.79 | 3.64286 |
| 350 | 5.3 | 0.82 | 4,25 |
| 400 | 5.92 | 0.82 | 4.85714 |
| 450 | 6,43 | 0,75 | 5.46429 |
Tabel 1: experimentele doorbuiging waarden voor toegepaste druk variërend van 0 – 450 verwacht kPa en hun theoretische voorspellingen. Gegevens afgeleid voor een stimulans van de stap. Bedoel ± SD. Deze gegevens werden verkregen met een lege overlapping kanaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol wordt een methode voor het leveren van nauwkeurige mechanische stimulatie aan de huid van een rondworm gevangen in een microfluidic chip gedemonstreerd. Het is bedoeld ter vergemakkelijking van de integratie van fysieke stimuli voor het beantwoorden van de vragen van de biologische en wil stroomlijnen mechanobiology onderzoek in biologische laboratoria. Deze methode breidt vorige tests om te beoordelen van de functie van de mechanosensory neuronen in C. elegans. Vorige kwantitatieve en semi-kwantitatieve technieken gemeten krachten1,34 en gedrag35, maar waren moeilijk te integreren met hoge resolutie beeldvorming van neuronale activiteit. Wij zijn dus van mening dat het gebruik van deze chip huidige toepassingen breidt en de prestaties is geoptimaliseerd voor stimulatie van neuronen vereist voor zachte touch. We geoptimaliseerd de uitwijking van de bedieningssleutel aan reach 5 µm, dat is een sterk genoeg stimulans tot bijna maximale neuronale reacties. Met lichte variaties, zijn wij van mening dat dit ontwerp kan worden gebruikt om harde aanraking receptoren, zoals PVD-nociceptors die het lichaam oppervlakte36innervate stimuleren.
Wijzigingen en probleemoplossing
Als geen schone kamer beschikbaar voor SU-8 lithografie is, kunnen een benchtop schoon vak of SU-8 zachte-lithografie stations uitgerust met UV-lampen, programmeerbare kookplaten, en spin coaters worden gebruikt. Een low cost alternatief voor de productie van microfluidic apparaten die vermijdt het gebruik van schone Kamerfaciliteiten kunnen ook worden gevolgd26.
In het ontwerp wij een bestaande overlapping-techniek, die ummobiliseerd van een enkel dier in een microfluidic-kanaal. Het ontwerp van de val van een apparaat dat wordt gebruikt voor het bestuderen van de olfactorische sensatie in de worm36is aangepast, maar het is niet de enige haalbare optie om te onderdrukken worm beweging. Andere strategieën hebben gemeld om te houden van wormen in microfluidic apparaten: CO2, elektroforetische, druksterkte immobilisatie11,37,38 zijn gebruikt en kunnen worden geïntegreerd in een gewijzigde ontwerp.
Wij druk aan de bediening-zenders met behulp van een verkrijgbare, piëzo-elektrische drukpomp die kunnen bepalen en leveren van maximaal 800 kPa van de bron van een externe druk geleverd. Wij verbonden de pomp met perslucht in het onderzoek opbouwen, die geschikt is voor het leveren van ~ 450 kPa. Als geen bron van samengeperste lucht beschikbaar is, kan een tank van samengeperste, inert gas (bijvoorbeeld, N2) worden gebruikt. Dit zou hebben het extra voordeel van hogere druk leveren en het genereren van grote vervormingen, maar zou ook vereisen hogedruk hulpstukken verbinden met de controller van de druk naar de chip. Fabriceren van de chip van zachtere PDMS is een alternatieve manier om druk-geïnduceerde vervormingen.
In dit experiment, is de uitlaat van de drukpomp verbonden met de PDMS chip door ontvangende openingen van 1 mm (bv, punch gaten) aangesloten met lijm-vrij en omkeerbare interconnectoren, bestaande uit een press-fit 20 G metal-buis ingevoegd in een PE buizen. Dit is aangetoond dat het weerstand bieden aan druk tot 700 kPa39. Wees voorzichtig tijdens het herhaalde inbrengen, echter, zoals de PDMS rond de gaten heeft de neiging te scheuren en dus beperken van de prestaties of onbruikbaar maken van de chip. Om deze reden was de metalen buis eenmaal ingevoegd en links aangesloten op de chip, zonder verwijderen en deze vervolgens herhaaldelijk opneemt.
Kritische stappen
Stimulatie wordt geleverd door een hydrofoor bediening-kanaal, dat springt van de huid. De resulterende vervorming en mechanoreceptor neuron activering kunnen worden beeld met hoge resolutie op een optische fluorescentie Microscoop en/of confocal set-up. Verschillende factoren kunnen belemmeren de detectie van de antwoorden van de GCaMP. Eerst, C. elegans express een blauw-licht receptor30 in veel neuronen, met inbegrip van TRNs21,23, waarin cellen na verlichting met blauw activeert (488 nm) licht. Dus, C. elegans imaging met behulp van de genetisch gecodeerde calcium sensor GCaMP6s zal activeren de neuronen op verlichting, verduisterend calcium transiënten geactiveerd door mechanische stimulatie23. Werken in de lite-1 mutant achtergrond of met behulp van rood-verschoven calcium activiteit sensoren, omzeilt u dit confound. Tweede, mechanisch-geïnduceerde calcium voorbijgaande worden niet herkend als de stimulans profiel komt niet overeen met de gevoeligheid van de mechanoreceptors. Wij gefaald om te ontdekken de activering voor hoge-amplitude trappen en hellingbanen, maar extreem hoge signalen opgeroepen na stimulatie met gematigde dynamiek prikkels (b.v., 200 kPa - buzz). Tot slot TRNs koeien op een herhaalde prikkels geleverd met korte (< 60 s) interstimulus intervallen. Het is dus belangrijk om ontwerp stimulatie sequenties die minimaliseren gewenning behalve in gevallen waar de gewenning is bestudeerd.
Het is raadzaam filteren alle oplossingen, zoals vuil en stof in de buffers gemakkelijk het kleine overlapping kanaal verstoppen kunnen. Verder, de dieren moeten worden leeftijd-gesynchroniseerd en grootte-afgestemd op de chip ontwerp; dieren kleiner is dan jonge volwassenen zal glijden door middel van het apparaat of niet worden gefixeerd en grotere dieren de overlapping kanalen niet kunnen invoeren en zijn in gevaar van barsten en/of verstopping van de chip. In geval van verstopping, toepassing van overmatige druk bij de inlaat van worm of zwaartekracht stroom kan de kanalen schoon, maar kan ook leiden tot falen van de montage.
Zoals vermeld in het gedeelte ' resultaten ', kunnen verschillende factoren leiden tot een storing in de analyseprogramma. Als u problemen ondervindt in het compileren van de code, wordt controleren dat de meest recente Fiji-software wordt uitgevoerd en dat Fiji is met behulp van de nieuwste Java-compiler aanbevolen. Als het programma wordt uitgevoerd, maar er onverwachte resultaten moet u ervoor dat de opgenomen film een 50-frame buffer heeft voordat de werkelijke mechanische stimulatie wordt uitgevoerd om ervoor te zorgen een juiste schatting van de basislijn en achtergrond fluorescentie. Verder het gezichtsveld van het groen, afhankelijk van de activiteit (GCaMP6s) en de rode, activiteit-onafhankelijke (tagRFP) kanaal worden verondersteld te worden geprojecteerd op de bovenste en onderste helft van de camera chip, respectievelijk. Als de splitter optische beam de beelden op de linker en rechter helft van de sensor projecteert, schakelt de camera 90° draaien de afbeeldingsstapels in een voorbewerkend stap te verkrijgen van de gewenste afdrukstand tijdens de opname. Bovendien is het programma identificeert het neuron door haar fluorescentie en zal mislukken als de signal-to-noise verhouding of het contrast te laag is. Als u in dit geval verandert de excitatie-intensiteit en/of blootstelling tijd, kan het probleem oplossen. Het programma wordt ook beëindigd als het neuron het gezichtsveld tijdens de opname verlaat, in dat geval het neuron moet worden geplaatst in het midden van het gezichtsveld voordat u begint een nieuwe aanwinst.
Beperkingen van de techniek
Het huidige ontwerp kunt stimulatie van het lichaam muur mechanoreceptor neuronen zoals de PVD-nociceptors en de TRNs, maar niet de mechanoreceptors die van de worm hoofd regio, zoals FLP en ASH innervate. Het is beperkt tot druk < 700 kPa. Voor een grotere druk moeten verschillende pijpfittingen worden ingezet. Aangezien de levering van druk hier niet meer dan 500 kPa, was de maximumdruk mogelijk toe te passen beperkt tot 450 kPa. De calcium transiënten waargenomen hier mark de bovenste grens van het verwachte signaal. Een andere beperking voor het ontwerp van onze aandrijvingen is hun hoogte-breedteverhouding. In principe, dunner pessarium zou grotere deformaties inschakelen, maar structuren met hoge hoogte-breedteverhouding zijn moeilijk te fabriceren betrouwbaar. Als grotere deformaties essentieel zijn, zou kunnen bredere actuatoren of parallelle deformaties van beide kanten nuttig zijn, zoals gepresenteerd door Cho et al. 29
Hoewel wij middenrif vervorming controleren kunnen, is het moeilijk de krachten tijdens pneumatische stimulatie van de bediening kanalen te meten. De beperking van het beginsel is dat de contactpunten van de bedieningssleutel niet duidelijk omschreven. Dit is omdat de bedieningssleutel zelf is elastisch en vervormen tijdens bediening, die de contact straal verandert met toenemende doorbuiging. Met deze kanttekeningen in het achterhoofd, kunnen we schatten dat een 5 µm inspringen (ongeveer 300 kPa bediening druk in een lege chip) toe te passen ongeveer 3.8 µN op de worm volgens de ramingen van de stijfheid worm van Petzold et al. wordt voorspeld 34 sinds de afhankelijkheid van de kracht van de neuronale huidige varieert in wormen met verschillende stiffnesses1,34, echter inspringing monitoring als een maat voor de intensiteit van de prikkel in plaats van kracht wordt aanbevolen.
Wij hopen dat de verspreiding van dit protocol gebruikers profiteren van microfluidics voor mechanobiology onderzoek gebruik van C. elegans als een modelsysteem helpen zal, en dus het versnellen van de vooruitgang van de wetenschap op dit belangrijke onderwerp in het veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Sandra N. Manosalvas-Kjono, Purim Ladpli, Farah Memon, Divya Gopisetty en Veronica Sanchez voor ondersteuning in ontwerp en productie van mutant dieren. Dit onderzoek werd gesteund door de NIH subsidies R01EB006745 (BLP), R01NS092099 (naar MBG), K99NS089942 (aan MK), F31NS100318 (aan de ALN) en ontvangen financiering van de Europese Onderzoeksraad (EOR) onder de Horizon 2020 onderzoek en de innovatie van de Europese Unie program () subsidieovereenkomst No. 715243 aan MK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric - imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
References
- Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
- Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
- Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
- O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
- Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Li, S., Stone, H. a, Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
- Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
- Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
- Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
- Arnadóttir, J., O'Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
- Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
- Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O'hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
- Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
- Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
- Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
- Petzold, B. C., Park, S. -J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
- Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H.
- Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
- Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).
