Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Bruker en Microfluidics enhet for mekanisk stimulering og høy oppløsning Imaging C. elegans

Published: February 19, 2018 doi: 10.3791/56530
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2, 4
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University, 2Department of Mechanical Engineering, Stanford University, 3Department of Bioengineering, Stanford University, 4Group of Neurophotonics and Mechanical Systems Biology, The Institute of Photonic Sciences (ICFO)
* These authors contributed equally

Summary

Nye verktøy for mechanobiology forskning er nødvendig for å forstå hvordan mekanisk stress aktiverer biochemical pathways og utløser biologiske respons. Her presentere vi en ny metode for selektiv mekanisk stimulering av immobilisert dyr med en microfluidic-felle slik at høy-resolution tenkelig mobilnettet svar.

Abstract

Et sentralt mål av mechanobiology er å forstå den gjensidige effekten av mekanisk stress på proteiner og celler. Til tross for sin betydning, er påvirkning av mekaniske påkjenninger på cellulære funksjoner fremdeles dårlig forstått. Delvis finnes denne kunnskapen hullet fordi noen verktøy aktiverer samtidige deformasjon av vev og celler, imaging cellular aktivitet i levende dyr og effektiv begrensning av motilitet i ellers svært mobile modell organismer, som Rundormer Caenorhabditis elegans. Den lille størrelsen C. elegans gjør dem en god match for microfluidics-basert forskning enheter og løsninger for immobilisering har blitt presentert med microfluidic enheter. Selv om disse enhetene tillater høy-resolution tenkelig, er dyret fullstendig innkapslet i polydimethylsiloxane (PDMS) og glass, begrense fysisk tilgang for levering av mekanisk kraft eller elektrofysiologiske opptak. Nylig har opprettet vi en enhet som integrerer pneumatiske aktuatorer med overlapping design som er kompatibel med høy oppløsning fluorescens mikroskopi. Aktivering kanalen er separert fra ormen-fangst kanal en PDMS membran. Denne membranen er forandret retning i siden av en orm, ved å legge press fra en ekstern kilde. Enheten kan målrette individuelle mechanosensitive neurons. Aktivering av disse neurons er avbildet på høy oppløsning med genetisk kodet kalsium indikatorer. Denne artikkelen presenterer de generelle metoden bruker C. elegans stammer uttrykke kalsium-sensitive aktivitet indikator (GCaMP6s) i deres touch reseptor neurons (TRNs). Metoden er ikke begrenset til TRNs eller til kalsium sensorer som en sonde, men kan utvides til andre mekanisk-sensitive celler eller sensorer.

Introduction

Følelsen av berøring gir dyr med viktig informasjon om miljøet deres. Avhengig av brukt styrken oppfattes touch som ufarlige, behagelige eller smertefulle. Vev deformasjon under touch oppdages av spesialiserte mechanoreceptor celler i huden som uttrykker reseptor proteiner, oftest ionekanaler. Trinnene kobler force oppfatning å ion kanal aktivisering touch og smerte er ikke fullt ut forstått. Enda mindre er kjent om hvordan huden vev filtre mekanisk deformasjon og om mechanoreceptors registrere endringer i belastning eller stress1,2,3. Dette gapet i forståelse oppstår, delvis av mangel av egnet verktøy for å bruke presis mekaniske stimulations på overflaten av huden på et levende dyr mens observere svar på cellular nivået. Mens atomic force mikroskopi har vært brukt mye og måle styrker i isolerte celler4,5 og også aktivere Piezo1 reseptorer i levende celler6, lignende eksperimenter med levende dyr, spesielt C. elegans, har vært svært utfordrende på grunn av iboende mobilitet av faget. Denne utfordringen er tradisjonelt circumvented ved hjelp av veterinær - eller kirurgisk-klasse cyanoacrylate lim til nakkens enkelte dyr på agar, pads,1,,7,,8,,9. Denne tilnærmingen er produktive, men har begrensninger knyttet til ferdigheter kreves for immobilisering av lime og myke agar overflaten på mekanisk elastisitet. En microfluidics strategi er et gratis alternativ som unngår noen komplikasjoner å.

Rundormer C. elegans er en genetisk modell organisme med en helt tilordnet nervesystemet som, på grunn av dyrets størrelse, er passe godt for microfluidics teknologi. MicroFluidics-baserte enheter tilbyr fordelen at ellers svært mobile dyrene kan dempes ved utføring av høy oppløsning bilder og levering av relevante Nevro-modulatory stimuli. Med hjelp av microfluidic kan teknologi, levende dyr bli immobilisert uten skade10,11, aktivere overvåking av atferdsmessige aktivitet over livslangt12,13 og høy oppløsning bildebehandling neuronal aktivitet14,15,16,17. Videre, mange mechanoreceptor neurons trengte for følelse av berøring og smerte kan være preget på deres fysiologiske1,8, mekanisk4,18,19, og molekylære nivå20,21,22.

C. elegans sanser mild mekanisk stimuli til sin kropp vegg med seks TRNs, hvorav tre innervate dyr fremre (ALML/R og AVM) og tre som innervate dyr bakre (PLML/R og PVM). Ion kanal molekylene trengs for transducing en anvendt kraft til et biokjemiske signal har blitt grundig studert i sin TRNs8. Denne artikkelen presenterer en microfluidic plattform23 som gjør at forskerne å bruke presis mekaniske krefter til huden på en immobilisert C. elegans rundorm, mens du leser ut deformasjon av sin interne vev av optisk tenkelig. I tillegg presenterer veldefinerte mekanisk stimuli, kan kalsium transienter være registrert i mechanoreceptor neurons med subcellular oppløsning og korrelert med morfologiske og anatomisk. Enheten består av en sentral overlapping kanal som holder en single dyr og presenterer huden ved seks pneumatiske actuation kanaler (figur 1 og figur 2). Seks kanalene er plassert langs kanalen overlapping å levere mekanisk stimuli til hver av ormen seks TRNs. Disse kanalene er atskilt fra overtrykk kammer med tynne PDMS membraner, som kan være drevet av en ekstern luft trykket kilde (figur 1). Vi kalibrerte nedbøyning forhold til press og gi målinger i denne artikkelen. Hver aktuator kan adressert individuelt og brukes å stimulere en mechanoreceptor valg. Trykket er levert med en piezo-drevet trykk pumpe, men alle alternative enheter kan brukes. Vi viser at trykket protokollen kan brukes å aktivere TRNs i vivo og demonstrere drift enheter egnet for leverer mekanisk stimuli til voksen C. elegans, lasting voksen dyr til enheter, utfører kalsium bildebehandling eksperimenter, og analysere resultatene. Enheten fabrikasjon består av to hovedtrinn: 1) klima og jordsmonn lage en støpeform SU-8; og 2) molding PDMS for å gjøre en enhet. For kortfattethet og klarhet kalles lesere tidligere publiserte artikler og protokoller24,25 for instruksjoner om hvordan å produsere mugg og enheter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. enheten fabrikasjon

  1. Last ned filen vedlagt maske (ekstra fil 1) og generere en chrome maske med et trykkeri eller internt anlegg. Det laveste målet på enheten er 10 µm (aktuator membran tykkelse), sikre at masken har tilstrekkelig høy oppløsning, innenfor ± 0,25 µm, pålitelig produsere funksjonene.
  2. Følger standard SU-8 klima og jordsmonn metoder (f.eksrefererer24,25,26) å dikte mold for påfølgende produksjon av PDMS enheter. et sammendrag av trinnene er oppført under.
    Merk: SU-8 er en lysfølsomme materiale, hvilke krysskoblinger ved eksponering for ultrafiolett lys (maksimal absorpsjon ~ 365 nm). Bruk produsenten instruksjoner som utgangspunkt for å bestemme behandling parameterne for myk-bake, eksponering (UV), og etter bake.
    1. Innskudd SU-8 2002 mot silisium wafer og spinn-belegge det til en omtrentlig tykkelse på 2 µm, for bedre vedheft av små strukturer. Soft-Stekes på en stekeplate for 1 min på 95 ° C, litt over-avsløre (UV) hele overflaten (~ 100 mJ/cm2), og etter stek på en varm plate i 2 minutter på 95 ° C.
    2. Spin-coat en 47-µm tykt lag med SU-8 2050 for å definere enhetsfunksjoner. Bruke en spinn hastighet på 500 rpm for 15 s (130 rpm/s akselerasjon) og deretter 2000 rpm for 90 s (260 rpm/s akselerasjon). Om nødvendig gjentar og justere spinne hastigheten for å få riktig tykkelsen på photoresist.
    3. Soft-bake på en varm plate i 2 minutter på 65 ° C, og deretter i 7 min på 95 ° C. Vise photoresist i henhold til instruksjonene fra produsenten (~ 160 mJ/cm2) bruke et chrome maske og lang-pass filter for å sikre rett vegger.
    4. Fjerne kjeks og post Stekes på en stekeplate 1 min på 65 ° C og 7 minutter til 95 ° C.
    5. Oppløse ueksponerte SU-8 med utvikler og ren med 2-propanol.
    6. Stek kjeks på en kokeplate ved 180 ° C i 30 minutter (hard-bake) til stabilisere photoresist funksjoner.
  3. Lage en PDMS replika fra SU-8 modellen bruker standard replika molding metoder27.
    1. Behandle SU-8 mold med trichloromethylsilane (TCMS) damp å redusere PDMS vedheft (silanization).
      FORSIKTIG: TCMS er giftige og vann-reaktive.
      1. Plass mønstret kjeks i en wafer rack i en bjelle krukke vakuum desiccator i avtrekksvifte vann eller vannløselige reagenser.
      2. Under panseret, kan du bruke en dropper bruke 1 dråpe TCMS et glass rett og plasser inne i desiccator.
      3. Lukk desiccator lokket og at TCMS damp til coat kjeks i minst 20 min.
      4. Vent og åpne desiccator. Åpne en bjelle krukke lokk og fjern kjeks bruker plast pinsett. Plasser i en Petriskål eller aluminium folie båt PDMS kopi molding. Kast TCMS-belagt materialer i riktig farlig avfall.
    2. Blanding PDMS (forholdet mellom 10:1) bruker 40 g base polymer og 4 g PDMS herding agent.
    3. Hell blandingen over SU-8 mold og degas blandingen for minst 30 min i et vakuum kammer.
    4. Kur for minst 6 h 70 ° C i en ovn.
  4. Løft PDMS av kjeks ved å angi kjeks vannrett på flatt underlag og forsiktig peeling av PDMS av. Unngå å bøye kjeks oppover i dette trinnet, som det kan bryte mugg.
    Merk: Ufullstendig vedheft av SU-8 wafer eller ufullstendig silanization kan føre til ødeleggelse av SU-8 strukturer i dette trinnet.
  5. Skjær PDMS rundt enhetene i individuelle sjetonger slik at enhetene får plass på en 24 x 60 mm dekkglassvæske.
  6. Bruke en 1 mm biopsi punch, lage hull i mengden, to uttak og seks aktuatorer med 1 mm biopsi sparke. Mål for 2 mm-diameter sirkler rundt kantene av enheten.
  7. Bond PDMS sjetonger glass cover slips.
    1. Utsette både flater til 80 W oksygen plasma (30 s).
    2. Forsiktig plassere utsatte PDMS overflaten til utsatte overflaten av cover slip for et conformal segl.
    3. Anneal enheten på en varm plate (100 ° C, 10 min).
      Merk: Ikke nok binding kan føre til feil på enheten på grunn av lekkasje.

2. forberedelse av mikroskopet

Merk: Transgene dyr: express en kalsium indikator som GCaMP6s28 eller andre genetisk kodet aktivitet sonde i neuron(s) av interesse (f.eksTRN); co uttrykke en aktivitet-uavhengig fluorescerende protein emitting på en annen bølgelengde korrigere små laterale og ut-av-fokus bevegelse gjenstander som oppstår på grunn av mekanisk stimulering. Automatisert analyseprogramvare spor og kompenserer for bevegelse-induserte endringer i intensiteten i aktivitet sonden. De ormen stammer GN69223 (eller AQ323629) express GCaMP6s (eller GCaMP6m) og kalsium-uavhengig tagRFP under kontroll av mec-7 promotor. GN692 viser dessuten den mutasjon lite-1(ce314), som hindrer aktivering av TRNs på grunn av det blå lyse sensor lite-130 under magnetisering av GCaMP6s fluorescens23.

  1. Definere et mikroskop system for samtidige magnetisering av GCaMP og RFP.
    1. Bruk enten en kontinuerlig lyskilde og et tobånds eksitasjon filter som overfører bare cyan og gule lys, eller bruk en lyskilde som slipper ut bare bølgelengder i en definert båndbredde som samtidig cyan (0,77 mW) og gul (1.21 mW) LED eksitasjon kilder for samtidige magnetisering av kalsium-avhengige og uavhengige fluorescens, henholdsvis.
    2. Bruke et digitalt kamera for å aktivere opptak av mikroskopi bilder.
      Merk: De fleste kameraer har en programvare for bildeopptak. Alternativt er det fritt tilgjengelig programvare som kan brukes til å styre kameraet og potensielt også andre deler av mikroskopi systemet.
    3. Justere eksitasjon intensitet basert på fluorescens intensitet å unngå kameraet metning.
  2. Bruk en fluorescens kube som avhengig av valg av excitation kilde må være utstyrt med et eksitasjon filter.
    Merk: En 488-nm GFP og 580-nm mCherry eksitasjon filteret ble brukt her.
    1. Legge til en bjelke splitter kuben for cyan og gule lyset reflekteres og overføre grønne og røde lys.
    2. Utstyre mikroskop med en 10 X mål og et mål for høy forstørrelse (f.eks63 X / 1.32 NA olje) fokusere magnetisering lys på prøven.
  3. Montere en bjelke splitter foran kameraet for samtidig opptak av GCaMP og kalsium-uavhengig signalet. Sikre at strålen splitter har en dichroic speil (lenge passerer, cut-off på 570 nm) å skille grønt og rødt lys med ett utslipp filter for grønn (passband sentrert på 525 nm med 50 nm bredde) og en utslipp filteret på rødt lys (passband sentrert i 632 nm med 60 nm bredde).
  4. Prosjektet grønne og røde fluorescens på den øvre halvdelen (grønn) og lavere halvparten (rød), henholdsvis av kameraet chip (se fig. 3). Denne retningen er en forutsetning for angitte analyseprogramvare.

3. dyr forberedelse

  1. Forberede alder-synkroniserte ung voksen eller voksen dag én C. elegans, som beskrevet tidligere av Porta-de-la-Riva et al. 31
  2. Forberede microfluidic chip.
    1. Koble gravitasjon flow reservoaret (~ 60 cm over chip nivå) som inneholder filtrert (0,2-µm polyethersulfone sprøyte) M9 filtreringsbufferen til en stikkontakt på brikken. Koble andre uttaket til en stikkontakt på en to-uttak avfallsbeholderen, i.e., en filter kolbe. Koble andre utløpet av avfallsbeholderen til en peristaltiske pumpe.
      Merk: Bruk polyetylen rør for alle tilkoblinger og metall Rørarmatur koble PE slangen til chip. Denne måten alle avfall løsninger vil tømmes ut av chip og samlet i avfallsbeholderen. Flyten gjennom uttaket kanalene skaper en skånsom som vil holde ormen tettsittende under senere fangst prosessen.
    2. Forberede sammenkoblinger består av 50 mm lang PE rør (0.9652-mm OD, 0.5842 mm ID) med metall rør (måle størrelsen 23TW, 0.635 mm OD) i begge ender. Trykk-fit disse forbindelser til hver av seks actuation fingrene og til ormen innløp (se figur 1). La disse interconnectors i chip, som gjentatte fjerning fører til slitasje på PDMS hullene.
  3. Plassere brikken på mikroskopet. Plukke 2-5 ormer i en dråpe filtrert (0,2-µm sprøyte filter) M9 bufferen og bruke en 1-mL sprøyte for å trekke dem i en PE rør (0.9652-mm OD, 0.5842 mm ID) koblet til en 1-mL sprøyte med dra stempelet ut forsiktig. Holde dyr i PE røret og ikke i sprøyten.
    Merk: For mange ormer eller ufiltrert løsninger i chip kan føre til tilstopping.
  4. Koble PE slangen av for sammenkobling ved ormen innløp (figur 1 og figur 2) av chip. Aktivere tyngdekraften strømmen ved å åpne ventilen og starte peristaltiske pumpen. Deretter trykk forsiktig sprøytestempelet av flytte dyrene i overlapping kanalen mens observere kanalen under et mikroskop med en 10 X linse i brightfield modus.
    Merk: Noen ganger vises luftbobler ikke utgjør et problem. de flyttet vanligvis automatisk i stikkontakten. Flere dyr kan "parkert" i venter kammeret og brukes sekvensielt.
    1. Etter lasting dyret i overlapping kanalen (se også figur 2), justere sin posisjon ved forsiktig skyve eller dra stempelet til sprøyten for å plassere leder av dyret i konisk form av forsiden av kanalen.
    2. Kontroller at ormen (voksen dag 1) har riktig størrelse overlappes i brikken.
      1. Hvis ormen ikke fylle hele kanalen tverrsnitt av kanalen fra nesen til mot slutten av kroppen (ikke inkludert spissen av halen) eller ormen beveger seg langs aksen av kanalen uten å flytte stempelet til sprøyten , fjerne den ved å trykke stempelet til sprøyten til den forsvinner fra overtrykk kanal og laste en ny (se trinn 3.8).
    3. Bytt til fluorescens modus av mikroskopet og en høyere forstørrelse linse (40 X eller høyere) og sjekk om neurite av Nevron rundt kommer til å ligge over membranen av en av aktuatorer. Hvis ikke, justere plasseringen av dyr ved å trekke eller skyve stempelet. Hvis dette ikke hjelper, fjerne den og laste inn en ny.
  5. Fokus på celle kroppen av Nevron rundt og koble sammenkobling av aktuatoren nærmest Nevron på fremre side av celle kroppen til en programmerbar trykk pumpe bruker PE rør.
    1. Hvis forsøket krever måling avstanden mellom aktuatoren og Nevron, flytte synsfelt så begge er i synsfeltet og channelwall er parallell til øvre og nedre kanten av bildet.
  6. Definere en trykk-protokoll programmerbare press pumpen.
    Merk: Denne protokollen kan justeres til ønsket eksperimentet.
    1. Start med en konstant press for 0 kPa tid tilsvarer minst 50 bilder av bildesekvens (nødvendig for normalisering). For en tenkelig rate på 10 Hz dette tilsvarer 5 s. Legg til en ønsket stimulans bølgeform og press og definere stimulans som andre trinnet.
      Merk: For å stimulere til TRNs, en sinusformet bølgeform (dvs.75 kPa, 10 Hz) lagt med et trinn (dvs., 275 kPa) anbefales som den genererer en stor nevrale respons.
    2. Hvis forsøket krever ekstra stimuli, inkluderer en periode på minst 10 s til et konstant trykk 0 kPa mellom stimuli. Før du bytter press pumpen, kontroller at instrumentet trykket er ved konstant 0 kPa å unngå utilsiktet stimulering av ormen før det aktuelle eksperimentet.
  7. Kjøre bildebehandling og press protokollen.
    1. I image oppkjøpet programvaren på kameraet, sette opp en bildesekvens ved 10 bruker en eksponeringstid på 100 ms for varigheten av press-protokollen. Justere eksitasjon intensiteten slik at maksimal fluorescens økningen ikke mette kameraet. Lagre dem som et bildedokument bildedokument *.tif fil med minst 50 bilder før første stimulans for normalisering.
    2. Start tenkelig protokollen image oppkjøpet programvare og press-protokollen i programvaren av programmerbare pumpen. Under opptak kan du observere om Nevron rundt er den smarteste stedet i et område på 10 x 10 bildepunkter, flyttes ikke lenger enn 10 bildepunkter i sekvensielle bilder og forblir i synsfeltet under innspillingen.
      Merk: Hvis dette ikke gjøres, mislykkes analyseprogramvare. Lyspunkter (dvs. autofluorescence) rundt Nevron gjøre rent opptak av neurons vanskelig. Dette løses fjerne ormen fra fellen og laste inn en ny orm i brikken. Hvis ormen beveger seg for mye, kan du prøve et nytt opptak av samme og observere ormen bevegelse. Hvis problemet vedvarer kan ormen være for liten til å være fanget. I dette tilfellet fjerne ormen og belaste en litt større orm i fellen.
    3. Eventuelt registrerer signaler fra flere nerveceller i synsfeltet samtidig som neurons er atskilt med minst 10 bildepunkter under hele innspillingen.
    4. Undersøke habituering, utføre eksperimentet gjentagelser på et dyr.
  8. Fjerne ormen fra overtrykk kanal.
    1. Hvis det er ønskelig å holde ormen for studier, koble utløp av chip mot tyngdekraften flyten og avfallsbeholderen. Trykke stempelet til sprøyten forsiktig til hele ormen presset gjennom kanalen overlapping i flyt kanalen.
    2. Fortsett å trykke sprøytestempelet til dyret vises i et slippverktøy utenfor chip. Koble sprøyten inkludert PE slangen ormen innløp, bruke den Sug opp ormer i slippverktøyet og overføre den til en agar plate.
    3. Hvis det er ønskelig å holde ormen, fjerne ormen ved å trykke stempelet til sprøyten til hele ormen skyves gjennom kanalen overlapping i flyt kanalen. gravitasjon flow og inntaks peristaltiske pumpen vil bære dyret fra brikken og til avfallsbeholderen.

4. analyser

  1. Dataoverføre og installere den nyeste Fiji versjon32.
  2. Dataoverføre og installere den nyeste java SDK versjonen.
    Merk: Hvis nødvendig, slette eller gi mappen java i mappen Fiji for Fiji bruke nylig installert java-kompilatoren.
  3. Åpne Fiji programvare.
    1. Sjekk om programvaren kjører nylig installert java-kompilatoren ved å åpne ' Plugins | Verktøy | ImageJ | Properties.
  4. Last ned filen pokinganalyzer*.java (https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer, se utfyllende fil 2).
  5. Dra og slipp filen .java i vinduet programvare åpne den som en plugin.
  6. Kompilere og kjøre filen pokinganalyzer*.java ved å trykke Ctrl + R i Fiji; et grafisk brukergrensesnitt (Poking Analyzer) åpnes (Figur 3).
    1. Klikk på fanen "Hjelp" og lese om kravene til programvaren og hvordan du utfører analysen. For å begynne, Velg kategorien "Åpne video" Angi video filplasseringen for analysatoren: Klikk på "Åpne en Video"-knappen, Naviger til plasseringen av video, og åpne den.
      Merk: Programvaren starter med denne kategorien åpnet. Hvis det ikke er åpen når du starter en ny analyse Klikk på kategorien "Åpne video". Hvis videoen er i a.tif format, vil programmet internt åpne video og viser det første bildet i den nedre delen av grensesnittet. Hvis bildet ikke er av videoen som skal analyseres, klikk på "Åpne en video"-knappen for å åpne en annen video.
    2. For å fortsette, klikker du kategorien "Definere ROIs". I denne kategorien kan du definere plasseringen av TRN. Merk at det første bildet av åpnet videoen vises i den nedre delen av denne tab. falle i staver på "Definere TRN"-knappen, og klikk på Nevron i den øvre delen av det viste bildet som skal vise GCaMP fluorescens.
    3. Valgfritt: Hvis aktuator vises i den øvre halvdelen av bildet programmet kan automatisk spore avstanden mellom Nevron og aktuator hvis ønskelig. For dette, sjekk "Definer aktuator?" -boksen, klikk på knappen "Definere aktuator" og klikk på aktuatoren i den øvre halvdelen av bildet.
    4. Klikk på kategorien "Analyse" Definer bilde oppkjøpet hastigheten. Angi et nummer i feltet eller klikker opp eller ned-knappene til å øke eller redusere tallet. Hvis kategorien tidligere "Definer aktuator?" -boksen er avkrysset, definere cellestørrelsen kamera, forstørrelsen og binning faktoren, slik at programmet kan beregne avstand.
    5. Klikk på knappen "Start analyse".
      Merk: Programmet vil nå følge Nevron ved sin fluorescens i bildesekvens i den øvre halvdelen (kalsium avhengige) og i den nederste delen (kalsium uavhengig) av bildesekvens. Kontoen for Nevron bevegelse i flyet av programmet vil undersøke et område på 10 x 10 bildepunkter rundt plasseringen av Nevron i forrige bildet for å finne plasseringen til Nevron bildet. Det vil beregne fluorescens i begge omganger av korrigere for bakgrunnen fluorescens (Fbg) og dele fluorescens i første 50 bilder (F0):
      Equation 1
      Fluorescens endringene i grønt, aktivitet-avhengige kanalen (FCa2 +) som skyldes Nevron bevegelse av flyet av opptaket er så rettet ved bruk av fluorescens i rødt, uavhengig av aktivitet kanalen (F corr) og pre stimulans standardavvik av kalsium-avhengige (sdCa2 +) og uavhengige fluorescens (sdcorr) av:
      Equation 2
    6. Programmet viser fremdriften på statuslinjen i nedre del av grensesnittet; Når statuslinjen når 100%, klikk på kategorien "Resultater". Hvis statuslinjen stopper før 100%, vil programmet gi en feilmelding som angir grunnen til at programmet ikke kunne analysere video.
      1. Hvis signalet til støyforhold er for lav, kan ikke programmet identifisere Nevron; justere tenkelig parameterne i senere opptak.
      2. Hvis Nevron forlater synsfelt under innspillingen, programmet spore ikke det lenger, og vil stoppe. For senere opptak, plassere Nevron i synsfeltet begynnelsen av innspillingen.
      3. Hvis noen regioner i synsfelt er overeksponert, produsere automatisk analyse ugyldige resultater. For senere opptak, sikre fluorescens signalet ikke mette kameraets sensor.
    7. I kategorien 'resultater' vises resultatet øverst. Lagre en tabulatordelt txt-fil av resultattabellen ved å klikke på "Lagre resultatet Table".
      Merk: Denne tabellen består av tiden i sekunder og den normaliserte kalsium-avhengige fluorescensen (korrigert av kalsium-uavhengig fluorescens). Hvis tidligere definert, også inneholder den totale avstanden mellom TRN og aktuatoren i µm og avstanden mellom TRN og aktuator vinkelrett på kanalen veggen i µm. representant resultatene av fluorescens intensiteten øke etter stimulering versus avstanden fra celle kroppen på nærmeste aktuatoren tegnes i Figur 4.
    8. Hvis det er flere nerveceller i en innspilling (atskilt med mer enn 10 bildepunkter), klikk på kategorien "Definere ROIs" igjen og gå tilbake til trinn 4.6.2 med andre Nevron.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SU-8 litografi og Chip bånd
Litografi protokollen og PDMS molding følger standard prosedyrer. Detaljer kan finnes andre steder23,24,25,26. PDMS bør løsner kjeks uten problemer etter herding. Hvis funksjonene SU-8 plyndre under PDMS peeling, var SU-8 vedheft laget eller silanization utilstrekkelig. Hvis plasma-aktivering av glass-coverslips og PDMS chips ikke er tilstrekkelig, svake bånd kan resultere i lekkasje av overtrykk kanal eller pneumatiske aktuatorer dårligere ytelse og fravær av stimulering. Hvis væske lekkasje er tydelig, er chip ubrukelig.

Aktuator ytelse
Alle PDMS aktuatorer og slangen koble chip til air reservoaret må være ordentlig lukket for å sikre riktig pneumatiske aktivering av stråling. Gjentatte innsetting og fjerning av PE slangen (VVS) vil skade PDMS hull og føre til en reduksjon i trykk. Slikt tap press vil begrense aktuatoren deflection og kraften til huden på immobilisert dyret. Nedbøyning av membranen kan måles ved hjelp av en tom chip (ingen dyr stede) ved å utføre flere actuation sykluser med ønsket trykket og sammenligne de kvantitative verdiene med teoretisk spådommer. Nedbøyning av mellomgulvet ble ikke målt i nærvær av et dyr i overlapping kanalen, fordi grensen membran og ormen er vanskelig å visualisere. Dette gjør presisjon kalibrering med en fanget dyr ikke mulig. Tabell 1 viser forventet nedbøyning som en funksjon av press. Disse verdiene ble beregnet med elastisk plate teori og detaljer kan bli funnet i Nekimken et al. 23 dette forholdet forventes å variere med forskjeller i membran tykkelse genereres under chip støping og andre faktorer som integriteten til binding mellom brikken og glass og sel koble chip til Press kilder. Her var verdier reproduserbar med liten variasjon ikke overstiger 1 µm ved 450 kPa press. Vi har preget ytelsen til stråling for alle tre forskjellige stimulans profiler og se den interesserte leseren Nekimken et al. 23 Sammendrag, der er flere faktorer å vurdere hvis verdiene avviker fra tabell 1: 1) en lekkasje i rør eller rør kontakter, 2) på PDMS har en annen elastisitet, hvilke kanne oppstå fra en alternativ forholdet mellom base polymer og herding agent, eller 3) PDMS har alderen og fortsatte å krysskobling over tid. Det anbefales derfor bruk av brikker som er utarbeidet innen en måned fra programmet.

Overlapping ytelse
Etter setter inn ormer i mengden av chip, skal et lett trykk med sprøyten plassere en enkelt dyr inne kanalen overlapping og presentere huden sammen med seks aktuatorer (figur 1). Viktigere, trenger nesen av dyret ikke nødvendigvis å stikke i bufferen reservoaret. I stedet er det mer viktig å plassere dyret slik at neurite ligger nærmeste aktuatoren og celle kroppen er synsfelt av mikroskopet. For å oppnå optimal neuronal aktivisering, skal avstanden mellom motoren og celle kroppen justeres slik at aktuator ligger anterior celle kroppen av interesse. I vår erfaring, for neurons stimulert bakenfor celle kroppen, nei aktivisering vil finne sted og kalsium vil transienter være fraværende. Riktig immobilisering kan oppnås med unge voksne eller en - dagers gammel hermafroditter (enheter optimalisert for disse to alderen er tilgjengelige på den samme masken). Mindre dyr vil skli inn i samling reservoaret eller flytte sidelengs inne kanalen overlapping. Dyr som er for stort vil bli presset inn kanalen, som kan føre til tidlig aktivering TRNs og påfølgende feil å oppdage mechanoreceptor transienter. Også fjerning av store ormer er utfordrende, fører til døden av dyr og/eller tilstopping av enheten. Med dette motivet, kan PLM Nevron vanligvis ikke immobilized helt, så det er fri til å bevege sidelengs og loddrett. Selv om vi har aktivert PLM nerveceller, er innspilling kalsium transienter i disse neurons vanskelig på grunn av vertikal bevegelse av halen. En annen overlapping design har blitt brukt til å registrere PLM33.

Avbildning av kalsium transienter og analyse
Når på plass, kan dyr bli stimulert med en av seks aktuatorer. Seks aktuatorer er posisjonert for å levere mekanisk stimuli til hver av seks TRNs. En microfluidic vannmengdebegrenser koblet til en 450-kPa internt press kilde ble brukt til å levere til dyret en stimulans protokoll som består av et 2-s 275 kPa skritt, en 2-s 0-275 kPa rampe og en 2-s buzz (en 75 kPa, 10 Hz sinus lagt med litt 275 kPa) , hver atskilt med en 10-s ventetid. Samtidig innspilte bildesekvenser av kalsium transienter ble analysert i Fiji, benytter en tilpasset skrevet programvare tilgjengelig på vår GitHub konto (se ovenfor og https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer). Vi fant at trykket ramper og press skritt aktivert TRNs bare hvis stimuli oppnådd press over 400 kPa. Derimot ble en robust aktivering av alle TRNs stimulert bruker en sinusformet, 10-Hz buzz på press < 275 kPa observert (Figur 4). Generelt TRNs reagert bedre til en kort sinusformet stimulans (kalt "buzz"), med tidligere rapporter bruker ulike metoder1,9. Stimulering med en buzz er svært effektiv, fører til ~ 90% av aktivering i alle neurons og prøvelser testet (Figur 4). Overraskende var det ingen sterk sammenheng observert på om stimulans ble brukt i rygg eller ventral side, og var uavhengig av avstanden mellom celle kroppen og stimulans posisjon på neurite. Fremtidige studier må undersøke om forsinkelsen av maksimal svaret samsvarer med stimulans avstanden.

Figure 1
Figur 1: oversikt av chip. (A) skjematisk oppsett av photomask og resulterende chip med alle koblingene angitt. Det er seks actuation fingre, tre på hver side av den sentrale overlapping-kanalen. Skala bar = 3 mm. (B) fotografi microfluidic enheten med PDMS bundet til dekkglassvæske og koblet til rør i ormen innløp og utløp ormen. Bare én av aktivering fingrene er koblet til press kilden, mens de andre fem ikke er opptatt. Deler av figuren har blitt gjengitt fra referanse23 under kreative vanlige lisenser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: nærbilde av sentrale overlapping kanalen og overlapping prosedyren. (A) skjematisk tegning av overtrykk kanalen. Pillars at ormen innløpet side hjelpe å orientere ormen og lette lasting av dyrene. Aktivering fingrene kan settes under trykk og rykk inn en membran i fanget prøven. Skala bar = 200 µm. (B) representant videobilde av en orm blir fanget i vannrett kanalen. Kanalen er utformet slik at ormen gjelder lå over seks pneumatiske aktuatorer. Halen er til venstre, hodet til høyre. Plassering av personlige touch reseptor neurons (TRNs) er angitt med piler og merket i figuren. Skala bar = 100 µm (i alle paneler). Deler av figuren har blitt gjengitt fra referanse23 under kreative vanlige lisenser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: oversikt over angitte Fiji plugin å analysere kalsium spor kjøpt med denne protokollen. Programmet starter et grafisk brukergrensesnitt. Den første kategorien ("åpne video") av grensesnittet viser knappen for å åpne en video, viser banen og det første bildet i åpnet videoen. Den andre kategorien ("definere ROIs") inkluderer for å definere en touch reseptor Nevron, en avkrysningsrute for å aktivere knappen "Definere aktuator" og "Definere aktuator"-knappen. I den nedre delen vises den første rammen av videoen. I den øvre delen av den tredje kategorien ("analyse") vises justerbare parametrene for bildeanalyse. Den midtre delen viser knappen "Start analyse". I den nedre delen viser en fremdriftslinje fremdriften for gjeldende analyse. I den fjerde fanen, "Resultater", vises resultatet et diagram med relativ fluorescens intensiteten over tid. I den nedre delen er det en knapp for å lagre resultattabellen. I femte kategorien "Hjelp", vises en hjelpetekst viser kravene for analyseprogramvare og instruksjon om hvordan du bruker den. Figur tilpasset fra referanse23 under kreative vanlige lisenser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: individuell neurons svare på mekanisk stimuli. (A) representant fluorescens mikroskop-bilde av GCamP6s merket AVM touch reseptor Nevron før og etter mekanisk stimulering med en buzz. Skala bar = 10 µm. fargeskala = 1500-3500 gråverdier. (B) stimulans protokollen inkludert 2 s membran eksitasjon representerer et 275 kPa skritt, en 275 kPa rampe og en sinus (75 kPa, 10 Hz) lagt med litt 275 kPa (buzz). (C) normalisert GCamP6s intensitet spor (mener ± SEM som skyggelagt) innspilt fra AVM stimulert med profilen som vises i B vill type dyr (grønn, n = 14) og dyr mutant i mechanoreceptor channel delenhet mec-4 (blå, n = 10), som er kjente til rette Svar å mekanisk trykk. Dette indikerer at transienter er indusert av anvendt mekanisk stimuli. Deler av figuren har blitt gjengitt fra referanse23 under kreative vanlige lisenser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Trykk (kPa) Mener nedbøyning (µm) SD Forventet nedbøyning (µm)
0 -0.01 0,01 0
50 0.77 0.26 0.607143
100 1.57 0.58 1.21429
150 2.32 0,65 1.82143
200 3.13 0.74 2.42857
250 3.86 0,79 3.03571
300 4.61 0,79 3.64286
350 5.3 0,82 4,25
400 5.92 0,82 4.85714
450 6.43 0,75 5.46429

Tabell 1: forventet eksperimentelle nedbøyning verdier for brukt press fra 0-450 kPa og deres teoretiske spådommer. Data Hentet fra en trinn stimulans. Mener ± SD. Disse dataene ble kjøpt med en tom overlapping kanal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen viser en metode for levering av nøyaktige mekanisk stimulering til huden på en rundorm fanget i en microfluidic chip. Det er ment å forenkle integreringen av fysiske stimuli for biologiske spørsmål og effektivisering mechanobiology forskning i biologiske laboratorier. Denne metoden utvider tidligere analyser for å vurdere funksjon mechanosensory nerveceller i C. elegans. Tidligere kvantitative og semi kvantitative teknikker målt styrker1,34 og atferd35, men var vanskelig å integrere med høy-resolution tenkelig neuronal aktivitet. Vi tror derfor at bruk av denne brikken utvider gjeldende programmer og ytelsen er optimalisert for stimulering av nevroner som kreves for utfordringen. Vi optimalisert nedbøyning av aktuatoren til nå 5 µm, som er en sterk nok stimulans nå nesten maksimal neuronal svar. Med små variasjoner tror vi at denne utformingen kan brukes å stimulere harde touch reseptorer, som PVD nociceptors som innervate kroppen overflaten36.

Endringer og feilsøking
Hvis ingen rent rom er tilgjengelig for SU-8 litografi, kan en Borstemmaskin ren eller SU-8 myk-litografi stasjoner utstyrt med UV-lamper, programmerbare kokeplater og spinn coaters brukes. Et lavpris alternativ for produksjon av microfluidic enheter som unngår bruk av rene rom kan også være fulgt26.

I design implementert vi en eksisterende overlapping teknikk, som immobilizes en enkelt dyr i en mikrovæskekanalen. Felle design er tilpasset fra en enhet som brukes til å studere olfactory sensasjon i orm-36, men det er ikke det eneste levedyktige alternativet å undertrykke ormen bevegelse. Andre strategier har blitt rapportert å holde ormer i microfluidic enheter: CO2, electrophoretic, og kompresjons immobilisering11,37,38 har blitt brukt, og kan integreres i en modifisert design.

Vi levert press til aktivering kanalene ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig, piezoelectric trykk pumpe som kan kontrollere og levere opptil 800 kPa fra en ytre press kilde. Vi koblet pumpen til komprimert luft i forskning bygning, som leverer ~ 450 kPa. Hvis ingen kilde av trykkluft er tilgjengelig, kan det brukes en tank med komprimert, inert gass (f.eks, N2). Dette ville ha fordelen av leverer høyere press og generere store deformasjoner, men vil også kreve høytrykks beslag koble til press kontrolleren til chip. Fabrikere chip fra mykere PDMS er alternativ måte å øke press-indusert deformasjoner.

I dette eksperimentet, er utløpet av press pumpen koblet til PDMS chip gjennom 1 mm mottar åpninger (f.eks, hullene) plugget med lim-fri og reversibel interconnectors bestående av en trykk-fit 20 G metall-rør inn i en PE rør. Disse har vist å motstå presset til 700 kPa39. Hensyn må tas under gjentatt innsetting, men, som PDMS rundt hullene pleier å rive og dermed begrense ytelsen eller at chip ubrukelig. Derfor var metall slangen satt en gang og venstre koblet til chip, uten å fjerne og sette den gjentatte ganger.

Avgjørende skritt
Stimulering er levert av en trykksatt actuation kanal, som rykker i huden. Den resulterende deformasjon og mechanoreceptor Nevron aktivisering kan avbildes med høy oppløsning på en optisk fluorescens mikroskop og/eller AC confocal oppsett. Flere faktorer kan hindre oppdagelsen av GCaMP svar. Først C. elegans express blå lys reseptor30 i mange neurons, inkludert TRNs21,23aktiverer celler etter belysning med blå (488 nm) lys. Dermed vil imaging C. elegans bruker genetisk kodet kalsium sensoren GCaMP6s aktivere sin neurons på belysning, skjule kalsium transienter aktivert av mekanisk stimulering23. I lite-1 mutant bakgrunnen eller bruke rød-skiftet kalsium aktivitet sensorer unngår denne confound. Andre, mekanisk-indusert kalsium forbigående blir ikke oppdaget hvis stimulans profilen ikke samsvarer følsomheten til mechanoreceptors. Vi kunne ikke finne aktivisering for høy-amplitude trinn og ramper, men vakte ekstremt høy signaler etter stimulering med moderat dynamics stimuli (f.eks, 200 - kPa buzz). Endelig TRNs venne til en gjentatt stimuli leveres med kort (< 60 s) interstimulus intervaller. Derfor er det viktig å design stimulering sekvenser som minimerer habituering unntatt i tilfeller hvor habituering blir studert.

Vi anbefaler filtrering alle løsninger, som rusk og støv i bufferne kan lett tette liten overlapping kanalen. Videre må dyr være alder-synkronisert og størrelse-tilpasset chip's design; dyr mindre enn unge voksne vil Gli gjennom innretningen eller mislykkes å dempes og større dyrene kan ikke angi overlapping kanalene og står i fare for sprengning og/eller tilstopping chip. Ved tilstopping, anvendelse av overdrevent press i orm eller gravitasjon flow innløpet kan vaske kanalene, men kan også føre til feil ved montering.

Som nevnt i resultatinndelingen, kan flere faktorer føre til feil i analyseprogram. Hvis det oppstår problemer i kompilere koden, anbefales kontrollerer at siste Fiji kjører og at Fiji bruker den nyeste Java-kompilatoren. Hvis programmet kjører, men det er uventede kontroller resultater at den innspilte filmen har en 50-ramme-buffer før den faktiske mekaniske stimulering utføres for å sikre et riktig estimering av den planlagte og bakgrunn fluorescensen. Videre synsfelt av grønne, aktivitet-avhengige (GCaMP6s) og røde, aktivitet-uavhengig (tagRFP) kanal antas å bli projisert på den øvre og nedre delen av kameraet chip, henholdsvis. Hvis den optiske stråle splitteren prosjekter bildene på den venstre og høyre halvdelen av sensoren, slå kameraet 90° for å få ønsket orientering under innspillingen eller rotere bildestakker på en pre-prosessering. Videre programmet identifiserer Nevron ved sin fluorescens og mislykkes hvis signal-til-støy forholdet eller kontrast er for lavt. I dette tilfellet, kan endrer eksitasjon intensitet og/eller tiden løse problemet. Programmet stopper også hvis Nevron forlater synsfelt under innspillingen, som tilfellet Nevron skal plasseres midt i synsfeltet før du starter en ny anskaffelse.

Begrensninger av teknikken
Den nåværende konstruksjonen gjør stimulering av kroppen veggen mechanoreceptor neurons som PVD-nociceptors og TRNs, men ikke mechanoreceptors som innervate ormen hodet regionen, slik som FLP og aske. Det er begrenset til press < 700 kPa. For større press må ulike Rørarmatur være ansatt. Siden press tilførselen her ikke overstiger 500 kPa, var maksimalt trykk bruke begrenset til 450 kPa. Kalsium transienter observert her merke den øvre grensen av forventet. En annen begrensning for design av våre aktuatorer er deres størrelsesforhold. I prinsippet tynnere membraner vil gi større deformasjoner, men strukturer med høy størrelsesforholdet er vanskelig å dikte pålitelig. Hvis større deformasjoner er viktig, kan bredere aktuatorer eller parallell deformasjoner fra begge sider være nyttig, som presenteres av Cho et al. 29

Selv om vi kan overvåke membran deformasjon, er det vanskelig å måle styrkene brukes under pneumatiske stimulering av aktivering kanalene. Prinsippet begrensningen er at kontakt området aktuatoren ikke er godt definert. Dette er fordi aktuator selv er elastisk og deformeres under aktivering, som endrer kontakt radius med økende nedbøyning. Med disse advarsler i tankene, kan vi anslår at en 5 µm innrykk (rundt 300 kPa betjening Trykk i en tom chip) er spådd for å bruke ca 3,8 µN ormen ifølge ormen stivhet anslag over Petzold et al. 34 siden force avhengigheten av neuronal gjeldende varierer i worms med forskjellige stiffnesses1,34, men overvåking innrykk som et mål på stimulans intensiteten i stedet for force anbefales.

Vi håper at formidling av denne protokollen vil hjelpe brukerne dra nytte av microfluidics for mechanobiology forskning ved hjelp av C. elegans som modellsystem og dermed akselerere fremme av vitenskap på dette viktige emnet i feltet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Sandra N. Manosalvas-Kjono, Purim Ladpli, Farah Memon, Divya Gopisetty og Veronica Sanchez for støtte i konstruksjon og generasjon mutant dyr. Denne forskningen ble støttet av NIH tilskudd R01EB006745 (til anbefalte), R01NS092099 (til MBG), K99NS089942 (å MK), F31NS100318 (å ALN) og mottatt finansiering fra europeiske Research Council (ERC) under EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon program () gi avtalen nr. 715243 til MK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chrome mask Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chrome mask Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chrome mask Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
4'' Silicon wafer (B-test) Stanford Nanofabrication Facility
SU-8 2002 MicroChem
SU-8 2050 MicroChem
Spin-coater Laurell Technologies WS-400BZ-6NPP/LITE
Exposure timer Optical Associates, Inc OAI 150
Illumination controller Optical Associates, Inc 2105C2
SU-8 developer MicroChem
2-Propanol Fisher Scientific A426F-1GAL
Acetone Fisher Scientific A18-4
Trichloromethylsilane (TCMS) Sigma-Aldrich 92361-500ML Caution: TCMS is toxic and water-reactive
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS prepolymer
Biopsy punch, 1 mm VWR 95039-090
Oxygen Plasma Asher Branson/IPC
Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW New England Small Tube Corporation NE-1300-01
Nalgene syringe filter, 0.22 μm Thermo Scientific 725-2520 to filter all solution, small particles would clog the chip
Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID Solomon Scientific BPE-T50
Syringe, 1 ml BD Scientific 309628 for worm trapping and release
Syringe, 20 ml BD Scientific 309661 for gravity-based flow
Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump Gilson to suck solutions and worms out of the chip
Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel Elveflow OB1 MK3 pressure delivery
Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD McMaster-Carr 5195 T52 connection from house air to pressure pump
Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD McMaster-Carr 5195 T51 connect pressure pump to small tubng
Push-to-Connect Tube Fitting for Air McMaster-Carr 5111K468 metric - imperial converter
Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD McMaster-Carr 5779 K258
Leica DMI 4000 B microscopy system Leica
63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective Leica 506081
Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera Hamamatsu C11440-42U
Lumencor Spectra X light engine Lumencor With cyan and green/yellow light source
Excitation beam splitter Chroma 59022bs in the microscope
Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics Hamamatsu A12801-01 to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip
Emission beam splitter Chroma T570lpxr in the image splitter
Emission filters GCamp6s Chroma ET525/50m in the image splitter
Emission filters mCherry Chroma ET632/60m in the image splitter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
  2. Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
  3. Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
  4. Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
  5. Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
  6. Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
  7. Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
  8. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
  9. Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
  10. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
  12. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  13. Li, S., Stone, H. a, Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
  14. Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
  15. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
  16. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  17. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
  18. Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
  19. Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
  20. Arnadóttir, J., O'Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
  21. Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
  22. Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O'hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
  23. Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
  24. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
  25. Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
  26. Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
  27. Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
  28. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  29. Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
  30. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
  31. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
  34. Petzold, B. C., Park, S. -J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
  35. Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
  36. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  37. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  38. Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).
  39. Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
  40. Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).

Tags

Nevrovitenskap problemet 132 Microfluidics soft-litografi C. elegans mechanobiology mechanosensation kalsium dynamics
Bruker en Microfluidics enhet for mekanisk stimulering og høy oppløsning Imaging <em>C.</em> elegans
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim,… More

Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans. J. Vis. Exp. (132), e56530, doi:10.3791/56530 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter