La microscopie vidéo sans lentille pour la dynamique et l’analyse Quantitative de la Culture de cellules adhérentes
Summary
La microscopie vidéo sans lentille permet de surveiller les cultures de cellules directement à l’intérieur de l’incubateur. Ici, les auteurs décrivent le protocole complet utilisé pour acquérir et analyser une acquisition 2,7 journée des cellules HeLa cultivées, conduisant à un ensemble de données 2.2 x 106 mesures de la morphologie des cellules individuelles et 10584 cycle cellulaire titres.
Abstract
Ici, nous démontrons que la lentille-gratuit vidéo microscopie permet de capturer simultanément la cinétique de milliers de cellules directement à l’intérieur de l’incubateur et qu’il est possible de surveiller et de quantifier les cellules isolées le long de plusieurs cycles cellulaires. Les auteurs décrivent le protocole complet permettant de surveiller et de quantifier une culture de cellules HeLa pour 2,7 jours. Tout d’abord, acquisition de la culture cellulaire est réalisée avec un microscope vidéo sans lentille, et puis les données sont analysées à la suite d’un processus en quatre étapes : reconstruction holographique de longueurs d’onde multiples, cellule-tracking, segmentation et la division cellulaire détection des cellules algorithmes. Ainsi, nous montrons qu’il est possible de rassembler un ensemble de données comportant plus de 10 000 titres du cycle cellulaire et de mesures morphologiques de plus de 2 x 106 cellules.
Introduction
Suivi tout au long de plusieurs cycles cellulaires des cellules de mammifères et de mesurer avec exactitude cell taille et cell masse sèche est une tâche difficile. Plusieurs techniques d’optiques sans étiquette sont capables d’accomplir cette tâche1,2: déphaseurs interférométrie3, microscopie holographique numérique (DHM)4,5,6, 7, quadriwave8,de l’interférométrie cisaillement latéral9 et volet quantitatif tomographie10,11. Ces méthodes ont abouti à nombreuses nouvelles perspectives sur la compréhension du cycle cellulaire des cellules de mammifères. Cependant, ils sont rarement associés à cellule automatique suivi des algorithmes et leur débit reste limitée lors de la mesure cellule trajectoires masse1 (N < 20 respectivement3,,4,5 , 6). c’est pourquoi une nouvelle méthode optique est nécessaire pour mesurer les trajectoires masse cellulaire avec statistiques grand (N > 1000).
Dans cet article, nous démontrent la capacité de la microscopie vidéo sans lentille image simultanément des milliers de cellules directement à l’intérieur de l’incubateur, et ensuite quantifier métriques de cellule unique le long des milliers de pistes cyclables de cellules individuelles. La microscopie exempte d’objectif est une phase quantitative imaging technique qui permet l’acquisition d’images de cellules sur un très grand champ de vision (typiquement plusieurs dizaines de mm2, ici 29,4 mm2)12,13 ,14,15. Plusieurs mesures au niveau de la cellule sont déterminées, par exemple, zone de cellules, cellules masse sèche, épaisseur de la cellule, la longueur axe majeur des cellules et rapport l / h12,15, de chaque image de cellule. Puis, en appliquant un algorithme de suivi des cellules, ces fonctionnalités peuvent être tracées pour chaque cellule en fonction de l’expérience de temps14,15. En outre, en détectant la présence de divisions cellulaires dans les traces de la cellule, il est possible d’extraire d’autres informations importantes telles que la cellule initiale poids sec (juste après la division cellulaire), la masse sèche de cellule final (juste avant la division cellulaire) et la cellule cycle de durée, c’est-à-dire, le temps entre deux divisions consécutives15. Toutes ces mesures peuvent être calculés avec de très bonnes statistiques (N > 1000) le grand champ de vision permettant généralement l’analyse de 200 à 10 000 cellules en une seule acquisition exempt de lentille.
Pour expliquer cette méthodologie basée sur la microscopie vidéo sans lentille, les auteurs décrivent le protocole pour surveiller et mesurer une culture de cellules HeLa pour 2,7 jours. Analyse des données est un processus en quatre étapes basé sur multi-longueur d’onde reconstruction holographique, suivi des cellules, segmentation de la cellule et des algorithmes de division cellulaire. Ici, on montre que la résolution spatiale et la fréquence d’images relativement rapide (une acquisition toutes les 10 minutes) obtenus avec cette configuration de microscopie vidéo sans lentille est compatible avec des algorithmes de suivi de cellule standard. L’analyse complète de ce jeu de données entraîne la mesure de 10 584 cellule titres plus complète des cycles cellulaires.
Pour résumer, la microscopie vidéo sans objectif est un outil puissant pour surveiller automatiquement des milliers de sans étiquette, non synchronisé et des cellules non modifiés par l’expérience ; chaque cellule étant suivie pendant plusieurs cycles cellulaires. Nos mesures fournissent ainsi la valeur moyenne de plusieurs paramètres des cellules, mais plus important encore, la variabilité inter cellulaire sur une large population de cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous montrons que microscopie vidéo sans lentille peut être utilisée à l’intérieur d’un incubateur pour capturer la cinétique de milliers de cellules. Afin de décrire la méthodologie globale, nous a expliqué comment une acquisition Time-lapse 2,7 jours de culture, les cellules HeLa peut être analysée avec des algorithmes de suivi de cellule standard. Le résultat est un ensemble de données mettant en vedette 2.2 x 10 mesures de cellule de6 et 10 584 pistes du cycle cellulaire….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs n’ont rien à reconnaître.
Materials
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
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