ללא עדשה מיקרוסקופ וידאו עבור הדינמיקה וניתוח כמותי של תרבית תאים חסיד
Summary
וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ מאפשר לנו לעקוב אחר תרביות תאים ישירות בתוך החממה. כאן נתאר את פרוטוקול מלא נהגה לרכוש וניתוח של 2.7 היום רכישת בתרבית תאים הלה, שמוביל dataset של 2.2 x 10 שירים6 מדידות של תא בודד ומורפולוגיה 10584 מחזור התא.
Abstract
כאן, נדגים את הסרטון ללא עדשה מיקרוסקופ מאפשרת לנו לתפוס בו זמנית את קינטיקה של אלפי תאים ישירות בתוך החממה וכי ניתן לפקח ולכמת תאים בודדים לאורך כמה מחזורים התא. אנו מתארים פרוטוקול מלא שמשמש כדי לעקוב אחר ולכמת תרבות הלה תא ימים 2.7. ראשית, תא תרבות הרכישה מתבצע באמצעות מיקרוסקופ וידאו ללא עדשה, ולאחר מכן הנתונים זה נותחו בעקבות תהליך ארבעה שלבים: גל מרובה שיקום הולוגרפי, תא-מעקב, תא זיהוי פילוח, חלוקת התא אלגוריתמים. כתוצאה מכך, אנו מראים שאפשר לאסוף של הנתונים (dataset) הכולל יותר מ 10,000 מחזור התא מסלולים ומדידות יותר מ 2 x 106 תאים מורפולוגי.
Introduction
בתרבית של תאים בתרבית במשך כמה מחזורים תא ומדידת במדויק תא וגודל תא יבש הוא משימה מאתגרת. מספר טכניקות ללא תווית אופטי מסוגלים לבצע את המשימה1,2: שלב-shifting אינטרפרומטריה3, מיקרוסקופ דיגיטלי הולוגרפי (סוג התושבות שלהם. מופיעים)4,5,6, 7, quadriwave לרוחב הטיה אינטרפרומטריה8,9 ו כמותיים שלב טומוגרפיה10,11. שיטות אלה הובילו תובנות חדשות רבות ההבנה של מחזור התא של תאי יונקים. אולם הם נמצאים לעתים רחוקות ביחד עם תא אוטומטי מעקב אלגוריתמים התפוקה שלהם נותר מוגבל כאשר מודדים את התא מסלולים מסה1 (N < 20 בהתאמה3,4,5 , 6). לפיכך שיטה אופטי יש צורך למדוד את התא מסלולים המוני עם סטטיסטיקה גדולים (N > 1000).
בנייר זה, נדגים את היכולת של וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ בו-זמנית תמונה אלפי תאים ישירות בתוך החממה ולאחר מכן לכמת תא בודד מדדים לאורך אלפי שירים בודדים מחזור התא. ללא עדשה מיקרוסקופ הוא שלב כמותיים הדמיה טכניקה המאפשרת רכישת תמונת שלב של תאים בצפיפות מעל שדה ראייה גדול מאוד (בדרך כלל כמה עשרות של מ מ2, כאן 29.4 מ מ2)12,13 14, ,15. במספר מדדים ברמת תא בודד נקבע, למשל, תא שטח, תא בנפח גדול יבש, עובי התא, אורך ציר מרכזי תא ותא יחס גובה-רוחב12,15, של כל תמונה. לאחר מכן, על-ידי החלת אלגוריתם תא-מעקב, תכונות אלה יכולים להיות מותווים עבור כל תא ותא כפונקציה של ניסוי זמן14,15. יתר על כן, על ידי גילוי המופע של חלוקות תאים על הפסים תא, זה אפשרי לחלץ מידע חשוב אחר כגון התא הראשוני יבש בנפח גדול (רק לאחר חלוקת התא), המסה יבשות תא הסופי (ממש לפני חלוקת התא), התא מחזור משך, כלומר, הזמן בין שתי חטיבות ברציפות15. כל המדידות הללו יכול להיות מחושב עם סטטיסטיקה טובה מאוד (N > 1000) מאז שדה הראייה גדול יאפשר בדרך כלל הניתוח של 200 עד 10,000 תאים ברכישת יחידה ללא עדשה.
על מנת להסביר מתודולוגיה זו מבוסס על וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ, נתאר את פרוטוקול כדי לפקח, לכמת תרבות הלה תא ימים 2.7. ניתוח נתונים הוא תהליך ארבעה שלבים בהתבסס על שחזור הולוגרפית גל רב, תא-מעקב, פילוח תא ואלגוריתמים חלוקת התא. כאן הוא הראה כי הרזולוציה המרחבית, את קצב המסגרות מהיר יחסית (רכישה אחת כל 10 דקות) שהושג עם תוכנית התקנה זו וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ הוא תואם עם אלגוריתמים תא-מעקב רגיל. ניתוח מלא של ערכת נתונים זה תוצאות המדידה של רצועות תא 10,584 על מחזורי תא שלם.
לסיכום, וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ הוא כלי רב עוצמה כדי לפקח באופן אוטומטי אלפי ללא תווית, שאינו מסונכרן ותאים שלא שונתה לכל ניסוי; כל תא במעקב במשך כמה מחזורים התא. המידות שלנו ובכך לספק את הערך הממוצע של מספר פרמטרים תא, אבל יותר חשוב, ההשתנות הבין-תאית על אוכלוסיה גדולה של תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בנייר זה, אנו מראים שאת מיקרוסקופ וידאו ללא עדשה יכול לשמש בתוך אינקובטור כדי ללכוד את קינטיקה של אלפי תאים. על מנת לתאר את המתודולוגיה הכללית הסברנו כיצד ניתן לנתח של רכישת זמן לשגות היום 2.7 של הלה תאים בתרבות עם אלגוריתמים תא-מעקב רגיל. התוצאה היא dataset שמציעות 2.2 x 10 מדידות תא6 רצועות מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אין להכיר.
Materials
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
References
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).
- Reed, J., et al. Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry. Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).
- Girshovitz, P., Shaked, N. T. Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization. Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).
- Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy. J Biomed Opt. 15 (3), (2010).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).
- Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy. J Biomed Opt. 17 (7), (2012).
- Aknoun, S., et al. Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).
- Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
- Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Kesavan, S. V., et al. High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy. Sci Rep. 4, 1-11 (2014).
- Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM). Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy. Sci Rep. 4, 4717 (2014).
- Allier, C., et al. Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy. Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).
- Su, T. -. W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
- Delacroix, R., et al. Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis. Sci Rep. 7, 39893 (2017).
- Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2016).
- Popescu, G. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
- Liu, P. Y., et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future. Lab Chip. 16, 634-644 (2016).
- Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters. PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).
- Al-Kofahi, O., et al. Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells. Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).
- Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells. J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).
- Zocchi, E., et al. Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells. J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).
- Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).
- Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F. Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).
- Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity. J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).
- Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075 (2015).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
