レンズ無料のビデオ顕微鏡、付着性細胞培養の定量的解析
Summary
レンズ無料ビデオ顕微鏡は、インキュベーターの中に直接培養細胞を監視することが出来ます。ここで集録し、解析を培養 HeLa 細胞の 2.7 日間の長い取得するために使用完全なプロトコルについて述べる、2.2 x 10 のデータセットにつながる個々 の細胞の形態や 10584 細胞周期の6測定を追跡します。
Abstract
レンズ無料ビデオを紹介ここでは、顕微鏡により直接インキュベーター内の細胞の何千もの速度を同時にキャプチャおよび監視し、いくつかの細胞周期に沿って単一セルを定量化することが可能であります。完全な監視し、2.7 日間の HeLa 細胞培養を定量化に使用プロトコルについて述べる。まず、レンズ無料ビデオ顕微鏡、細胞文化獲得して実行され、次の 4 段階のプロセス データを分析し、: 多波長ホログラフィック再構成、細胞追跡、セル分割と細胞分裂検出アルゴリズム。その結果、以上 10,000 の細胞周期トラックと 2 x 10 以上6細胞形態計測のデータセットの特徴を収集することが可能だと紹介します。
Introduction
いくつかの細胞周期を通じて培養細胞を監視し、正確に測定セルのサイズとセルの乾燥質量はやりがいのある仕事です。いくつかラベル無料光技術がこのタスク1,2を実行することができる: 位相シフト干渉法3、デジタル ホログラフィー顕微鏡法 (DHM)4,5,6,7quadriwave 横方向せん断干渉8,9定量位相トモグラフィ10,11。これらのメソッドは、哺乳動物細胞の細胞周期の理解に多くの新しい洞察力につながっています。しかし、彼らは、ほとんど追尾法自動セルと結合し、そのスループットは制限を測定するときセル大容量の軌跡1 (N < それぞれ3,4、5の 20,6). 光学手法は大規模な統計と細胞質量軌跡の測定に必要なため (N > 1000)。
本稿では、同時に数千、インキュベーターの中に直接細胞のイメージを作成し、単一のセル数千もの個々 の細胞周期トラックに沿って指標を定量化しレンズ無料ビデオ顕微鏡の機能を示します。顕微鏡のレンズ無料は定量位相イメージング技術の非常に広い視野で密集細胞の位相画像の取得を可能にする (通常数十 mm2、ここの 29.4 mm2)12,13 ,14,15。単一セルのレベルでいくつかのメトリックが決定されます、例えば領域をセル、携帯の乾燥質量、セル厚、セルの長軸の長さとセルの縦横比12,15, それぞれのイメージから。その後、細胞追跡アルゴリズムを適用すると、これらの機能をプロットできますすべての単一セルの実験時間14,15の関数として。さらに、セルのトラックで細胞分裂の発生を検出することにより初期の細胞乾燥質量 (細胞分裂) の直後に、(細胞分裂) の直前に最後のセルの乾燥質量とセルの他の重要な情報を抽出することが可能です。期間、すなわち、2 つの連続した分割15間の時間を周期します。これらのすべての測定値を計算する非常によい統計量 (N > 1000) 以来、ビューの大きなフィールドが通常単一レンズ無料取得 200 に 10,000 細胞の解析を許可。
レンズ無料ビデオ顕微鏡検査に基づいたこの方法を説明するために監視および 2.7 日間の HeLa 細胞培養を定量化するプロトコルについて述べる。データ解析、多波長ホログラフィック再構成、細胞追跡、セル分割と細胞分裂のアルゴリズムに基づいた 4 つのステップ プロセスです。ここで空間分解能とこのレンズ無料ビデオ顕微鏡のセットアップで得られた比較的高速なフレーム レート (10 分ごと 1 つ取得) の標準的な細胞追跡アルゴリズムと互換性があることを示します。このデータセットの完全な分析は完全な細胞周期上 10,584 セル トラックの測定結果します。
要約すれば、レンズ無料ビデオ顕微鏡は何千ものラベル、同期されていないと実験; ごとそのままセルを自動的に監視する強力なツール各セルは、いくつかの細胞周期を追跡されています。我々 の測定はこのように細胞の大規模な人口でセル間変動より重要なことは、しかし、いくつかのセルのパラメーターの平均値を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿ではそのレンズ無料ビデオ顕微鏡は、細胞の何千もの速度をキャプチャするインキュベーター内使用ことができますを示す.全体的な方法論を記述するために、標準細胞追跡アルゴリズムの 2.7 日コマ撮りによる培養 HeLa 細胞の分析方法を説明しました。結果は、2.2 × 106セル測定と 10,584 細胞周期トラックを備えデータセットです。買収を行った比較的大規模な細胞間距離と Hela ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者が認めることを何もありません。
Materials
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
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