Summary
Objektiv-freie Videomikroskopie ermöglicht es uns, Zellkulturen direkt in die Brutmaschine zu überwachen. Hier beschreiben wir die vollständige Protokoll zum erwerben und analysieren eine 2,7 Tage lang Übernahme von kultivierten HeLa-Zellen, was zu einem Dataset von 2,2 x 106 Messungen der einzelnen Zellmorphologie und 10584 Zellzyklus tracks.
Abstract
Hier zeigen wir, dass Objektiv-freie Video Mikroskopie ermöglicht es, gleichzeitig die Kinetik von Tausenden von Zellen direkt in die Brutmaschine zu erfassen und es ist möglich, zu überwachen und Einzelzellen entlang mehrere Zelle Zyklen zu quantifizieren. Wir beschreiben das vollständige Protokoll zur Überwachung und Quantifizierung einer HeLa Zellkultur für 2,7 Tage. Erstens Zelle Kultur Erwerb erfolgt mit einem Objektiv-freie video Mikroskop, und dann die Daten analysiert, nach einem vier-Stufen-Prozess: Multi-Wellenlänge holographischen Rekonstruktion, Handy-Tracking, Zelle Segmentierung und Zellteilung-Erkennung Algorithmen. Dadurch zeigen wir, dass es möglich ist, sammeln Sie ein Dataset mit mehr als 10.000 Zellzyklus-Tracks und mehr als 2 x 106 Zelle morphologischen Messungen.
Introduction
Kultivierte Säugerzellen in mehrere Zelle Zyklen Überwachung und Messung genau Zelle Größe und Zelle Trockenmasse ist eine anspruchsvolle Aufgabe. Verschiedene optische markierungsfreie Techniken sind in der Lage, diese Aufgabe1,2: Phasenverschiebung Interferometrie3, digitaler holographischer Mikroskopie (DHM)4,5,6, 7, Quadriwave laterale shearing Interferometrie8,9 und quantitativen Phase Tomographie10,11. Diese Methoden führten zu viele neue Einblicke in das Verständnis des Zellzyklus von Säugerzellen. Aber sie sind selten gepaart mit Automatikzelle tracking-Algorithmen und deren Durchsatz begrenzt, bleibt bei der Messung von Zelle Masse Bahnen1 (N < 20 bzw.3,4,5 , 6). daher eine neuartige optische Methode erforderlich ist, um die Zelle Masse Trajektorien mit großen Statistiken messen (N > 1000).
In diesem Beitrag zeigen wir die Fähigkeit der Linse-freie Videomikroskopie, gleichzeitig Tausende von Zellen direkt in die Brutmaschine Bild, und dann einzelne Zelle Metriken an Tausende von einzelnen Zelle Radwege zu quantifizieren. Objektiv-freie Mikroskopie ist eine quantitative Phase bildgebende Technik, die Phase Bildaufnahme von dicht gepackten Zellen über ein sehr großes Sehfeld ermöglicht (in der Regel mehrere zehntausend mm2, hier 29,4 mm2)12,13 ,14,15. Werden mehrere Metriken auf der Ebene der einzelnen Zelle bestimmt, z.B.Handy-Bereich, Handy-Trockenmasse, Zelle Dicke, Zelle Hauptachse Länge und Zell-Seitenverhältnis12,15, aus jedem Bild. Dann können diese Funktionen durch die Anwendung eines Handy-Tracking-Algorithmus, für jede einzelne Zelle in Abhängigkeit von dem Experiment Mal14,15geplottet werden. Durch das Auftreten von Zellteilungen in der Zelle Spuren erkennen, ist es darüber hinaus möglich, weitere wichtige Informationen zu extrahieren, wie z. B. die erste Zelle trockene Masse (kurz nach der Zellteilung), die letzte Zelle Trockenmasse (kurz vor der Zellteilung) und die Zelle Dauer, d. h., die Zeit zwischen zwei aufeinander folgenden Divisionen15-Zyklus. All diese Messungen mit sehr gute Statistiken berechnet werden können (N > 1000) da das große Sichtfeld in der Regel die Analyse von 200 bis 10.000 Zellen in eine einzelne Linse-freie Erwerb ermöglichen würde.
Um diese Methode basiert auf Objektiv-freie Videomikroskopie erklären, beschreiben wir das Protokoll zur Überwachung und zur Quantifizierung einer HeLa Zellkultur für 2,7 Tage. Die Datenanalyse ist ein vier-Stufen-Prozess basierend auf Multi-Wellenlänge holographischen Rekonstruktion, Handy-Tracking, Zelle Segmentierung und Zellteilung Algorithmen. Hier wird gezeigt, dass die räumliche Auflösung und die relativ schnelle Bildrate (ein Erwerb alle 10 Minuten) erhalten mit diesem Objektiv-freie Videomikroskopie Setup kompatibel mit standard-Handy-Tracking-Algorithmen. Die vollständige Analyse dieses Datensatzes führt die Messung der 10.584 Zelle Tracks über vollständige Zelle Zyklen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, ist Objektiv-free video-Mikroskopie ein leistungsfähiges Werkzeug automatisch Tausende von unbeschrifteten, unsynchronisiert und unveränderten Zellen pro Experiment zu überwachen; Jede Zelle, die über mehrere Zyklen der Zelle verfolgt. Unsere Messungen liefern somit den Mittelwert aus mehreren Zellen Parametern, aber noch wichtiger ist, die Inter Zelle Variabilität über eine große Population von Zellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
(1) die Überwachung Erwerb Zellkultur
- HeLa-Zellen in DMEM + Glutamin (z.B.GlutaMAX) wachsen Medium mit 10 % (V/V) Hitze-inaktivierten fetalen Kalb Serum und 1 % Penicillin und Streptomycin ergänzt.
- 6-Well unten Kultur Glasplatten mit Fibronektin (25 µg/mL) für 1 h zu beschichten. Dann Samen Sie 2 x 104 Zellen pro Bohrloch.
- Schon beim Erwerb ändern Sie des Mediums alle 3 Tage.
- Verwenden Sie für den Zeitraffer Erwerb der Objektiv-freie Videomikroskop (im Handel erhältlich).
Hinweis: Dieses Objektiv-freie rechnerische bildgebendes Verfahren basiert auf wie von Ozcan Et Al. beschrieben 16 die auszuführenden kontinuierliche Überwachung in einem Inkubator bei einer kontrollierten Temperatur von 37 ° C12,15geändert wurde. Freuen Sie sich auf einen komplementäre Metalloxid-Halbleiter (CMOS)-Bild-Sensor mit einem Pixelabstand von 1,67 µm und eine imaging-Bereich von 6,4 x 4,6 mm2. Mehreren Wellenlänge Beleuchtung bietet eine multichip lichtemittierende Diode (LED) Vorrichtung, die roten, grünen und blauen Beleuchtung liefert. Die Wellenlängen sind zentriert, 636, 521 und 452 nm bzw. mit einer spektralen Bandbreite von 25, 45 und 25 nm bzw.. Die rot-grün-blau (RGB) LEDs befinden sich oberhalb einer 150 µm Lochkamera in einem Abstand von ca. 5 cm aus den Zellen. Die Lichtleistung gemessen in der Nähe der LED ist so niedrig wie 10 µW bei jeder Wellenlänge und die Leuchtdauer beträgt nur eine Sekunde pro Akquisition. Daher dürften keine Phototoxizität Probleme bei Zellkulturen unter dem Objektiv-freie video Mikroskop beobachtet werden. - Stellen Sie die Zelle-Kultur-Behälter setzen Sie in Kontakt mit dem CMOS-Sensor (Abbildung 1). Verwenden Sie einen Behälter mit einem Glas Deckgläschen an der Unterseite, die wichtig für die Qualität der Linse-freie Übernahme ist. Kunststoff-Behälter verwendet werden, aber die Objektiv-freie Übernahme wird aufgrund der schlechten optischen Qualität dieser Container abgebaut werden.
- Steuern Sie die Objektiv-freie Videomikroskop mit der Datenerfassungs-Software (im Handel erhältlich), die die Zeitraffer-Akquisition und der holographischen Rekonstruktion durchführt. Die Parameter, die vom Benutzer in der Softwareoberfläche eingegeben werden müssen sind die Frame-Rate, die Dauer des Experiments und die Art der Zellkultur, d.h. adhärente Zellen oder schwimmenden Zellen.
- Legen Sie die Eingabeparameter der Datenerfassungs-Software. Legen Sie die Frame-Rate auf einen Erwerb alle 10 Minuten und Kultur Zelltyp zu "Anhänger" eingestellt.
Hinweis: Eine Bildrate von einem Erwerb alle 10 Minuten ist ein guter Kompromiss, denn es eine zuverlässige Zelle verfolgen gewährleistet, während die Größe des resultierenden Datasets zu analysierenden noch zumutbar ist. Die schnellste Frame-Rate erreichen mit diesem Objektiv-freie Mikroskopie-Setup ist ein Erwerb alle 5 Minuten. Weitere Steigerung der Framerate führt zu übermäßiger Erwärmung des CMOS-Sensors, die die Lebensfähigkeit der Zellen in Kultur beeinflussen können. - Die Time-Lapse Übernahme starten, und die holographische Rekonstruktionsalgorithmus (im Handel erhältlich) wird automatisch verarbeiten die Objektiv-freie Übernahme um die Phase Bild der Zellkultur zu erhalten. Der holographischen Rekonstruktionsalgorithmus basiert auf einer Multi-Wellenlänge Phase Retrieval Algorithmus17 und bietet ein RGB-Bild rekonstruierten Phase im Bereich von [-π, + π] für jede einzelne Zelle über ein großes Sehfeld von 29,4 mm2. Das Prinzip der Objektiv-freie Inline-Holographie ist eine dünne Probe zu beleuchten (bei Z = 0) mit einer Ebenen Welle (von Amplitude 1 nach Normalisierung) und auf einem CMOS-Sensor erkennt das anschließende Beugung Intensität Bild bei einem kurzen Abstand Z = Z, in der Regel 1 mm nach der Probe. In unserem Setup wird die Beleuchtung auf 3 Wellenlängen sequenziell geschaltet (λ1= 0.450 µm, λ2= 0.540 µm, λ3= 0.647 µm), drei Beugungsmuster der gleichen Probe zu messen.
(2) Zelle Kultur Datenanalyse
- Verwenden Sie für Handy-Tracking Trackmate Algorithmus ", ein open-Source-Fidschi-Plugin für das automatisierte Tracking Einzelkörner18". At zuerst laden die volle Zeitraffer Übernahme in Fidschi (Load-Bild-Sequenz-Befehl). Aufgrund der Größe der Datensätze, die in der Regel 400 RGB-Bilder von 29,7 Mb verfügt, ist es schneller sie in 8-Bit-Format laden. Als nächstes führt das Trackmate Fidschi-Plugin den Anwender durch mehrere Phasen des Handy-Tracking-Algorithmus, nämlich eine Erkennung-Zell-Stadium, ein Tracker-Zell-Stadium und mehrere Filter angewendet, um die Zelle Erkennungen und die berechneten Bahnen. In jeder Phase die Algorithmen zu konfigurieren und die Ergebnisse anzeigen sofort damit, falls erforderlich, eine leicht hin und her navigieren kann, passen Sie die Einstellungen. Die verschiedenen Menüs der Trackmate Schnittstelle sind mit den aktuellen Einstellungen für die HeLa-Zellen-Experiment in Abbildung 2 dargestellt.
- Legen Sie die Eingabeparameter der Datenerfassungs-Software wie folgt (siehe Abbildung 2). Der geschätzte Blob Durchmesser 15 Pixel, die Detektor-Schwelle 0,25, verbindet maximale Entfernung auf 15 Pixel, die Lücke schließen max. Entfernung auf 15 Pixel und die Anzahl der Plätze in den Spuren auf 3,5 einstellen
Hinweis: Diese Einstellungen werden offensichtlich unterscheiden sich von einem Experiment zur anderen, vor allem der "geschätzte Blob Durchmesser", das entspricht der Größe der Zellen (hier in Pixel von 1,67 µm angegeben). Die gleiche Bemerkung bezieht sich auf die "Verknüpfung max zurückgelegte" welches Konto für die maximale Entfernung von einer Zelle in zwei aufeinander folgenden Frames (hier in Pixel von 1,67 µm angegeben). Der optimale Wert würde auf Zelle Motilität, sondern auch auf Zelldichte abhängen. - Am Ende des Prozesses Handy-Tracking, generieren die Ergebnisse in Form von drei Textdateien ("Analyse" Taste, siehe Abbildung 2). Die nützlichste Datei mit dem Namen "Spots in Spuren Statistik", besteht aus einer Tabelle alle erkannte Zellen mit ihren jeweiligen (x, y) Positionen in der Akquisition, ihre Frame-Nummer und die Track-Nummer. Auf Basis dieser Daten durchzuführen Sie Zelle Segmentierung und erkennen Sie Zellteilungen mit speziellen Algorithmen (siehe ergänzende Codedateien) zu. Die beiden anderen Dateien heißen "Links in der Titel-Statistik" und "Track Statistiken" und enthalten die Ergebnisse, die der Umgang mit den Spuren, z.B. Track Dauer, Anzahl der erkannten Lücken, erste Frame usw. zu verfolgen.
- Verwenden Sie die Zelle Segmentierungsalgorithmus (siehe ergänzende Codedatei), mehrere Kennzahlen beschreiben die Zellmorphologie aus dem rekonstruierten Phase Bild automatisch zu extrahieren. Diese Metriken sind die Zelle Oberfläche (S), die Zelle Hauptachse Länge (L), die Zelle Nebenachse Länge (l) und der Zelle Aspect Ratio (L/l). Die Phase von Objektiv-freie Mikroskopie erholt ist proportional zur Dichte und Dicke der Probe wie zuvor15besprochen.
- Neben den morphologischen Eigenschaften der Zelle quantitative Zelle trockenere Massenmessungen (CDM) Auszug aus der rekonstruierten Phase13,19,20
GL. (1)
wo φ(x,y) ist das rekonstruierte Phase Shift19, λ die Wellenlänge und α = 1,8 x 10-4 m3/kg der spezifischen Brechungsindex steht die Variation der Brechungsindex Masse1, trocken 19. - Die Zelle Dicke über eine Schätzung der Differenz zwischen der Zelle Brechungsindex und derjenigen der Nährmedien zu bewerten. Das Verhältnis zwischen der Zelle Dicke h(X,y) und die gemessene Phasenverschiebung wird durch20gegeben:
GL. (2.1)
GL. (2.2)
mit Δn(X,y) = nZelle (X,y) - nMedium (X,y), der Brechungsindex Unterschied zwischen der Zelle und die Nährmedien. Im folgenden davon ausgehen einen konstanten Wert von Δn = 0,025, die Schätzungen von dem Brechungsindex gemessen in HeLa Zellkerne (n = 1.35511) und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Kultur Medien (n = 1,33). Obwohl der Wert der Zelle Dicke nur Richtwerte, da es auf der Annahme beruht, seine relative Variationen sind aussagekräftig und können genutzt werden, um teilenden Zellen zu erkennen. - Algorithmus "engagierten" verwenden (siehe ergänzende Codedatei) das Auftreten von Zellteilungen zu erkennen und dann extrahieren Zelle Spuren, die die erkannten Zellteilungen zugeordnet sind, um eine Zellteilung zu erkennen-Zellen mit einer gemessenen Dicke größer als 8 µm werden zuerst identifiziert, dann prüfen Sie ob eine neue Zelle erscheint eng in Raum und Zeit. Auf diese Weise setzt der Nachweis von Zellteilungen auf zwei robuste Kriterien. Alternative und aufwändigere Methoden zur Erkennung der Zellteilung können auf Lensfree Zeitraffer Erwerb21,22,23angewendet werden.
GL. (1)
GL. (2.1)
GL. (2.2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Für die holografische Wiederaufbauprozess Lichtfeldes anhand eines skalaren Feldes pro (wo 
der komplexen Wert von A in das Flugzeug im Abstand Z von der Probe und seitliche Position 
und Wellenlänge λ). Lichtausbreitung wird durch die Huygens-Fresnel-Theorie stellt einen Verbreiter Kernel modelliert 
. Daher die Feld-Amplitude bei der Detektor-Ebene einZ bezieht sich auf die leichten Amplitude 0 durch folgende Beziehung:
d. h.
mit 
, wo ich die komplexe Zahl ist (ich= 2-1)
Die Intensitätsmessung ist einfach modelliert, von 
. Die Rekonstruktionsalgorithmus soll ein "gutes" Feld A0, im Zusammenhang mit der beobachteten Probe, welche Beugung die gemessene Intensität entspricht zu finden ichz. Die Strategie ist zu prüfen, die Feldphase der Amplitude auf der Detektor Flugzeug φZ als unbekannt des Problems und multispektralen total Variation Kriterium des Objekts zu optimieren. Deutlicher, wenn man bedenkt die Felder
d. h.
für jede Feld φZ Phase, 
passt die Daten seit 
. So dass das Feld 
ist ein Feld von möglichen Amplitude in der Probe-Ebene, angesichts des beobachteten Intensität Ansehens. Dies ist der Grund, warum ein Kriterium auf A0 verwendet wird, um eine einzigartige Lösung zu allen Datenabgleich Möglichkeiten angeben. Das Kriterium zu minimieren wurde gewählt:
wo x und y sind die Koordinaten für das Flugzeug, d. h. 
. Ein solches Kriterium ermöglicht um zu wählen, unter allen möglichen Bereichen, ein Probe-Feld Anzeigen von scharfen Kanten an der gleichen Position für alle Wellenlängen, das ist physikalisch sinnvolle. Dieses Verfahren reduziert das Auftreten von "Twin-Bilder" im rekonstruierten Feld eine0. Das "Twin-Image" ist wichtiges Artefakt, das ergibt sich aus einem Mangel an Phaseninformationen während des Beteiligungsprozesses.
Für die praktische Berechnung die integrale sind mit einer räumlichen Sampling entspricht die Auflösung Detektor diskretisiert, die Derivate von Sobel-Betreibern und Windungen durch die Huygens-Fresnel-Verbreiter ersetzt 
erfolgen durch gehen die Fourier-Raum wo 
hat einen einfachen Ausdruck: 
. Minimierung des (realen) Kriterium ε in Bezug auf die (realen) Variablen 
angegangen wird, mithilfe der nicht-linearen konjugierten Gradienten Methode, wonach die Steigung von ε für jede Phase jedes Detektorpixel für jede zugeordnete berechnet werden Wellenlänge.
Zelle Phase des Wiederaufbaus/Auspacken
Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse der holographischen Rekonstruktion eines Frames eine Zeitraffer-Übernahme von HeLa-Zellen in Kultur. Abbildung 3a zeigt volle Sehfeld einer rohen Akquisition in den blauen Kanal auf einer Fläche von 29,4 mm2 . Basierend auf dieses Bild und die, die in den roten und grünen Kanäle erworben, produziert die holographische Rekonstruktion einer RGB-Phase Bild der Zellen wie in den Figuren 3 b und 3 cgezeigt. Das rekonstruierte Phase Bild zeigt lokal eingewickelt Phase Artefakte, Zellen, die eine Phase Shift überschreiten induzieren + π entspricht. Durchführung einer einfachen Phase Auspacken wir implementiert ein heuristisches Mittel, nämlich erkennen wir die Pixel mit dem Wert 
von mehr als 0,3 und legen Sie diese Pixel + π. Diese einfache Methode basiert auf einem Gelände von der Phasenbilder RGB rekonstruiert. In der Theorie bei jedem Pixel messen wir eine Verhältnis 
gleich 
. Aber im Falle der mitotischen Zellen tritt Phase Verpackung, diese Beziehung wird nicht mehr gepflegt im RGB rekonstruierten Phase Bild (Abbildung 3f). Die oben genannte heuristische Methode nutzt diese Eigenschaft, so dass eine einfache Schwellwerte verwendet werden kann, um die Pixel präsentiert Phase Verpackung zu erkennen. Die Ergebnisse des rekonstruierten Phase vor und nach dem Auspacken ist in Zahlen 3f und 3 g, bzw. gezeigt. Diese ausgepackt Phasenbilder sind in der Handy-Tracking-Algorithmus eingespeist. Ohne diese Auspacken würde der Handy-Tracking-Algorithmus nicht erkennen Zellen im Geschäftsbereich und Zellen von großer Stärke, was die endgültigen Ergebnisse gefährden würde. Die Auflösung des Bildes rekonstruierten Phase wurde auf etwa 5 µm15 (voll-Pitch räumliche Auflösung), werden die ist relativ grob geschätzt. Es ist dennoch möglich, Details wie Lamellipodia beobachten und Zelle Zytoplasma (Figuren 3f und 3 g). Am wichtigsten ist, das Bild durch die Linse-freie Mikroskopie zeigt einen großen Kontrast und ist befreit von Halo-Artefakten. Dies erleichtert die automatische Zelle Erkennung und Handy-Tracking.
Zelle Kultur Datenanalyse
Der Zellzyklus zu extrahieren verfolgt, die Datenanalyse stützt sich auf eine Reihe von verschiedenen Algorithmen, nämlich die Zelle tracking durchgeführt mit dem Trackmate Fidschi-Plugin, die Erkennung von Divisionen und letztlich die Gewinnung von Zelle Radwege, d. h. die Sequenz zwischen zwei Zellteilungen. Im folgenden besprechen wir die Qualität der Ergebnisse dieser Algorithmen im Vergleich zu manuellen Messungen.
Abbildung 4 zeigt verschiedene Screenshots von Handy-Tracking-Ergebnisse, die Ergebnisse der Zelle Erkennungsalgorithmus und die Ergebnisse der Handy-Tracking-Analyse. Die Erkennung von Zellen in der Objektiv-freie Erwerb (Abbildungen 4a-4 c) ist der erste Schritt des Handy-Tracking-Algorithmus. Um die Zelle Erkennungsalgorithmus zu validieren, kommentiert wir manuell einen kleinen Teil der Time-Lapse Objektiv-freie Übernahme (214 Bilder von 663 x 663 µm2). Wir manuell insgesamt 5365 Zelle Positionen ausgewählt und verglichen die Ergebnisse mit denen, die durch das Trackmate Fidschi-Plugin. Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse in Bezug auf die wahre Erkennung, falsch positive und falsch negative. Die resultierende Empfindlichkeit ist etwa 96 % und der positive prädiktive Wert so groß wie 99,7 %. Diese hohen Werte spiegeln die gute Qualität der rekonstruierten Phasenbilder mit dem Objektiv-freie Videomikroskopie Setup erhalten. Nach der Entdeckung der Zelle, eine Zelle Segmentierungsalgorithmus ermöglicht die Messung – für jede Zelle – mehrere verschiedene Messgrößen, wie z.B. den Zellbereich, der Zelle trockene Masse und die Zelle Dicke. Abbildung 6a zeigt das Prinzip der Segmentierungsalgorithmus und Abbildung 6f segmentierte Bilder in einer zeitlichen Abfolge für eine Region des Interesses von 663 x 663 µm2 (das gleiche wie in Abbildung 5). Der Algorithmus initiiert die Segmentierung durch Schnittstellenüberwachung Phase Bild (siehe Abbildung 6 b) und dann gilt es eine Aussaat Verfahren (siehe Abbildung 6 c). Nämlich sind die Pixel des Zentrums der erkannten Zellen auf den Wert des entsprechenden Titels gesetzt. Die X-Y-Positionen der Zellen und ihre entsprechenden Track-Nummer werden von der "Flecken in Spuren Statistik" Datei nach Zelle Tracking erhalten bereitgestellt. Dann wird eine iterative Füllvorganges implementiert, die die Samen an die Grenzen der Zelle (Abbildung 6 c-e) bestimmt durch die anfängliche Schwellwerte (Abb. 6 b) erstreckt sich. Dieser Füllvorgang stützt sich auf grundlegende Operationen in mathematische Morphologie, z. B. Dilation und Erosion. Aus dem Ergebnis der Segmentierung dann ist es möglich, mehrere Metriken auf die einzelne Zellenebene, d.h. morphologische Merkmale wie die Länge der Zelle, den Zellbereich und das Seitenverhältnis der Zelle zu berechnen, sondern auch, was noch wichtiger ist, die Zelle Trockenmasse je nach GL. 1. Bei der Beurteilung der Zuverlässigkeit der Objektiv-freie Mikroskopie Messung der Zelle Trockenmasse, wir haben das Objektiv frei rekonstruierten Phase Bild des festen HeLa-Zellen (Abbildung 6 g) mit der gleichen Region mittels einer digitalen holographische im Vergleich Mikroskopie mit einer 5 X Objektiv (Abbildung 6 h). 6i Abbildung zeigt die Zelle trocknen Masse gemessen bedeutet der Objektiv-freie Mikroskopie als eine Funktion der trockenen Masse gemessen mit DHM für 302 HeLa-Zellen segmentiert. Gibt es eine gute Korrelation zwischen den beiden Messungen (Koeffizient der Entschlossenheit R2 ist 0,86, Steigung = 0,9, Offset =-17 Pg). Aus Abbildung 6ischätzen wir die Genauigkeit der Zelle trockene Masse Messung mittels Mikroskopie Objektiv-frei. Die Präzision, gemessen als die mittleren quadratischen Fehler zwischen den Objektiv-freie Daten und die lineare Anpassung ist etwa 16 Pg.
Beim Kompilieren von allen Einzelzelle Messungen über den vollen Zeitraffer Erwerb kann dann Scatterplots mehrere Metriken als Funktion der Zeit zu erhalten, wie in Abbildung 7dargestellt. Diese Scatterplots geben Auskunft über die Kinetik der kultivierten Zellen über eine sehr große Bevölkerung. Die Anzahl der Zellen in das Sichtfeld erhöht sich von 2.000 bis 15.000 (Abb. 7a). Multipliziert mit der Anzahl von Zeitpunkten, dies führt zu einem großen Dataset von 2,2 x 10 erkannt6 Zellen, jede von ihnen zeichnet sich durch seine Koordinaten und morphologischen Merkmale, d.h. Zelle Trockenmasse (Abb. 7 b), Zellbereich (Abb. 7 c) , Handy-durchschnittliche Dicke (Abbildung 7 d), Länge der Hauptachse (Abbildung 7e) und Aspect Ratio (Abbildung 7f).
Vor allem die Kombination von Handy-Tracking und Zelle Segmentierung Algorithmen ermöglicht es uns, die Kinetik der Ebene der einzelnen Zelle zu messen. Als Beispiel zeigt Abbildung 8 der Analyse einer Zelle verfolgen, Dauer ca. 66 Stunden und präsentiert vier Zellteilungen bei T0 + 4,1 h, T0 + 20,5 h, T0 + 36,7 h und T0 + 53,3 h. Abbildung 8a zeigen die Ergebnisse der automatischen Zelle Segmentierungsalgorithmus ermöglicht uns, effizient die Oberfläche dieser Zelle abzugrenzen. Dann ist es möglich, mehrere Metriken als Funktion der Zeit, z.B. die Zelle Oberfläche (Abb. 8 b) zu berechnen, die Zelle trockene Masse (Abbildung 8 c), die Zelle durchschnittliche Dicke (Abbildung 8 d) und die Zelle mit der Zelle-Segmentierung, Motilität (Abbildung 8e). Aus diesen Diagrammen kann man deutlich die Kinetik dieser zelluläre Metriken zwischen Zellteilungen messen. Insbesondere kann man die Erhöhung der Zellbereich und Trockenmasse während einer Zelle Zyklus beobachten. Darüber hinaus verwenden die automatische Erkennung von Zellteilungen, drei verschiedene Radwege Zelle extrahiert werden können von dieser Strecke und der Zellzyklus-Dauer, d. h. der Zeitraum zwischen zwei Divisionen abgeschätzt werden. Auf die einzelne Zelle Track dargestellt in Abbildung 8, wir haben drei Zellzyklus Laufzeiten gemessen, nämlich 16,4 h, 16,2 h und 16,7 h. Kompilieren den Zellzyklus tracks aus der Analyse der 2,7 Tage Zeitraffer Erwerb Ergebnisse bei der Erkennung von 16725 Zellteilungen und die Beschreibung der 10.584 Zelle Radwege. Dann ist es möglich, den Mittelwert und die Variabilität der Zellzyklus Dauer mit soliden Statistiken zu messen. Wir fanden, dass die Verteilung der Zellzyklus-Dauer in der Nähe von Gauß-Verteilung (Abbildung 9a) mit einem Mittelwert von 16,5 h und eine relative Standardabweichung von 12,4 % (Standardabweichung gemessen auf dem Gaußschen Gipfel dividiert durch den Mittelwert der Verteilung ). Die durchschnittliche Verdopplungszeit von 16,5 h steht im Einklang mit den Zellzyklus Längen gemessen manuell auf der Strecke auf Abbildung 8dargestellt. Es liegt jedoch im unteren Bereich der veröffentlichten Werte für HeLa Verdoppelung der Zeit sind in der Regel zwischen 20 und 30 h24,25,26,27. Allerdings ist eine kurze Verdopplungszeit von 16,2 ± 1,7 h Referenz28, auch erwähnt. Um unsere Messungen des Zellzyklus Längen zu überprüfen und bestätigen die Zuverlässigkeit unserer Objektiv-freie Mikroskopie-Technik, haben wir eine manuelle Nachführung des 100 Zellzyklus Spuren (10.148 Zelle Positionen) durchgeführt. Auf die Zelle Radwegen erhalten manuell (N = 100) die gemessenen Zellzyklus-Länge ist 16.7±1.9 h (N = 100, Abbildung 9 b). Dies ist sehr nah an die Messung der 16.5±2.1 h (N = 10.584) mit der automatischen Zelle tracking, demonstrieren die Gültigkeit der allgemeinen Analyse erhalten. Als Vergleich das manuelle Tracking des Zellzyklus Flugbahnen, die automatisch ermittelt, wir fanden, dass 67 % der Zellzyklus Tracks erfolgreich erkannt wurden und dass die Zykluslängen automatisch gemessen sind gut korreliert mit den gemessenen manuell (Abbildung 9). Die Nachweiseffizienz der Zellzyklus Bahnen wurde in den ersten 32 Stunden des Experiments, bei einer Dichte unter 150 Zellen/mm2gemessen. Diese Erkennungsrate sinkt natürlich mit der Zeit, als die Zelle Dichte erhöht bis ~ 500 Zellen/mm2. Die Anzahl der erkannten Zellzyklus Spuren erreicht ein Plateau bei T0 + 32 h (Abbildung 9 c) während die Anzahl von Zellen immer noch steigt um den Faktor drei zwischen T0 und T0 + 32 h, 72 h (Abbildung 7a). Betrachtet man die Rate der positiven und negativen Fehlalarme, zeigt Abbildung 9 b 5 Ausreißer Punkte: 4 von ihnen sind aufgrund falsch negative Entdeckung (Zykluslänge > 25 h) und 1 auf eine falsche positive Erkennung (Zykluslänge < 10 h). Um diese Ergebnisse zu erzielen, haben wir eine hohe Schwelle auf die Dicke (8 µm) in der Zellteilung Erkennungsalgorithmus verwendet, um einer niedrige false-positive-Rate zu bevorzugen. Darüber hinaus wurden die Tracks präsentieren Inkonsistenz, d.h. Zellzyklus welche Dauer unter 6 h und verfolgt eine trockene Masse Flugbahn, die als Funktion der Zeit nicht linear ansteigt gefiltert. Sie sind nur 3 % der Gesamtzahl der Zellzyklus-Titel. Infolgedessen ist die Verteilung der Zellzyklus Länge erhalten automatisch gut angenäherten durch eine Gauß (Abbildung 9a) mit einer geringen Anzahl von kurzen Tracks (Zellzyklus Länge < 10 h, 5,1 % der Gesamtzahl der Tracks), die von falschen führen würde positiven Bereich Erkennungen. In ähnlicher Weise Spuren anzeigen eine lange Zellzyklus, die teilweise Ergebnisse von falsch negativen Bereich Erkennungen sind ebenfalls selten (Zellzyklus Länge > 25 h, 2,4 % der Gesamtzahl der Tracks). Manuelle Überwachung der Zellzyklus Bahnen diente auch das Handy-Tracking durchgeführt mit dem Plugin einzuschätzen. Wir haben auf 6693 Zellen eine Gesamtgenauigkeit Lokalisierung von 1,6 µm auf übereinstimmende Punkte innerhalb einer Pixelabstand (1,67 µm) gemessen.
Andere Parameter können wie der erste trockene Zellmasse (nur nach einer Teilung), die endgültige Trockenmasse (kurz vor einer Zellteilung), sowie die durchschnittliche Wachstumsrate während des Zellzyklus untersucht werden. Abbildung 9 d Grundstücke die erste und letzte Zelle trockene Masse als Funktion der Zeit. Es zeigt, dass beide ersten und letzten Zelle trockenen Massen mit der Zeit ab. Der mittlere Wert der ursprünglichen Zelle trockene Masse sinkt von 223 Pg bis 130 Pg und die letzte Zelle Trockenmasse von 460 Pg bis 220 Pg. Das Verhältnis zwischen den beiden bleibt während des gesamten Tests stabil bei 1,89 ± 0,12 (Abbildung 9 d-e). Schließlich Abbildung 9f zeigt die Entwicklung der Zelle trockene Masse Wachstumsrate als Funktion der Zeit über die 10.584 Zellzyklus-Schienen und wir fanden, dass der Rückgang der Wachstumsrate der Zelle ein allgemeiner Trend für den gesamten Zellpopulation in diesem besonderen Experiment ist.
Abbildung 1: Objektiv-freie Mikroskopie. (ein) schematische Darstellung der Objektiv-freie Mikroskopie Erwerb Setup. (b) Bild 6-Brunnen Objektiv-free Video-Mikroskop. Es verwendet einen CMOS-Bildsensor mit einem Pixelabstand von 1,67 µm und eine imaging-Bereich von 6,4 mm x 4,6 mm = 29,4 mm2. Beleuchtung wird durch eine mehrfarbige RGB-LEDs zusammen mit einer Lochkamera, platziert in einem Abstand von ca. 5 cm aus der Probe zur Verfügung gestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Trackmate Schnittstelle. Hauptmenüs des Plugins angezeigt mit den aktuellen Einstellungen für die HeLa-Zelle verwendet experimentieren. Geschätzte Blob Durchmesser wurde auf 15 Pixel festgelegt, die Detektor Schwelle wurde gegründet um 0,25 verbindende maximale Entfernung wurde auf 15 Pixel festgelegt, die Lücke schließender max Abstand wurde gegründet um 15 Pixel und die Anzahl der Plätze in den Spuren wurde gegründet um 3,5. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: holografische Wiederaufbauprozess. (ein) Raw Übernahme der HeLa-Zellen in der Kultur durch Objektiv-freie Mikroskopie (volles Sehfeld von 29,4 mm2). (b) Detail (a). (b) (c) Detail. (d) RGB rekonstruierten Phase Bild (volles Sehfeld von 29,4 mm2). (e) Detail (d). (f) Detail (e). (g) Phase Bild erhalten, nachdem Phase um vergleichbar mit (f) vor dem Auspacken Auspacken. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Screenshots von der Handy-Tracking-Ergebnisse durchgeführt, mit dem Trackmate Fidschi-Plugin. (ein) Ergebnisse der Zelle Erkennungsalgorithmus basiert auf einer Laplace-Operator von Gauß (LoG) Detektor. Das Bild zeigt die volle Sehfeld der Objektiv-freie Übernahme bei T0 + 16h40min in denen 2.451 Zellen erkannt werden. Letztere sind mit einem violetten Kreis umgeben. (b) Ergebnisse des Handy-Tracking-Algorithmus. Alle Zelle Tracks sind mit einem Farbcode entspricht die mittlere Geschwindigkeit über 50 Frames (ca. 8 Stunden) angezeigt. (C, d) Detaillierte Bild (a) und (b) bzw. (gelbes Rechteck). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Validierung der Erkennung Zellstadium des Handy-Tracking-Algorithmus. (ein) beschnitten Bild von HeLa Zellen in Kultur (663 x 663 µm2) wo die Zelle von hand ausgewählt sind mit blauen Kreuzen markiert und diejenigen mit der Handy-Tracking-Algorithmus erkannt sind mit roten Kreuzen gekennzeichnet. Dies ermöglicht die Bestimmung der falsch positiv Entdeckung (roter Kreis) und negative Fehlalarme (orangefarbener Kreis). (b) die Rate der wahre Erkennung (grüne Linie), falsche Positive (rote Linie) und falsch-negativ (Orange) Erkennung als eine Funktion der Zeit Experiment dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Ergebnisse der Zelle Segmentierung. (ein) rekonstruiertes Phase Bild einer Region of Interest der Zeitraffer Übernahme bei T0 + 7 h (663 x 663 µm2). (b) initiiert der Algorithmus die Segmentierung durch Schnittstellenüberwachung fängt die Phase Bild (c) die Segmentierung mit einem Ausgangswert Verfahren, d. h. sind die Pixel des Zentrums der erkannten Zellen auf den Wert des entsprechenden Titels gesetzt. (d-e) Als nächstes und iterativ ist eine Befüllung implementiert, die erstreckt sich das anfängliche seeding an die Grenzen der Zelle durch die anfängliche Schwellwerte (b) bestimmt. (f) zeigt das Ergebnis der Segmentierungsalgorithmus für eine zeitliche Abfolge auf einer 663 x 663-µm-2 -Region (gleich wie in Abbildung 5). Die Segmentierung wird eine farbige Oberfläche überlagert auf dem rekonstruierten Phase Bild gezeigt. Beachten Sie, dass das Objektiv-freie Signal vor allem aus der nuklearen Region kommt, und die segmentierten Bereiche in der Nähe des Kerns fallen. (g) rekonstruiertes Phase durch die Linse-freie Mikroskopie in festen HeLa-Zellen. Dies ist ein zugeschnittenes Bild volles Sehfeld von 29,4 mm2. (h) Phase Bild der Region gezeigt in (g) erhalten durch digitale holografischen Mikroskopie mit einer 5 X Objektiv (NA 0.12) beleuchtet mit einem Laser bei 647 nm. (ich) Plot der trockene Zelle Masse durch Objektiv-freie Mikroskopie in Abhängigkeit von der trockenen Masse gemessen mittels DHM erlangt. Das Streudiagramm kompiliert 302 Zellen Messungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Datenanalyse ein 2,7-Tag Objektiv-freie Zeitraffer Übernahme von HeLa-Zellen. (ein) insgesamt Zellen gezählt in volles Sehfeld von 29,4 mm2 als Funktion der Zeit. (b) Streudiagramm der trockene Zelle Masse als Funktion der Zeit. Auf jedes Feld entspricht einem Lagerplatz von 6 Stunden, die rote zentrale Markierung zeigt den Median und die unteren und oberen Kanten des Quaders angeben bzw. die 25. und 75. Perzentile. Die Schnurrhaare erstrecken sich auf die extremsten Datenpunkte nicht als Ausreißer. (c-f) Scatterplots der Zelle segmentiert Bereich (c), die Zelle durchschnittliche Dicke (d), die Zelle Hauptachse Länge (e) und die Zelle Seitenverhältnis (f) als Funktion der Zeit. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Datenanalyse ein 2,7 Tag Zelle Flugbahn (10 min-Frame-Intervall). (ein) Zelle Segmentierung auf die Zeitraffer-Übernahme einer Zelle Strecke dauert ca. 66 h durchgeführt. Die Zelle des Interesses wird mit einem blauen Overlay angezeigt. 53 x 53 µm2ist jedes Bild beschnitten. Die Zellteilungen werden mit gelben Kreise angezeigt. (b) Fläche des die Zelle als Funktion der Zeit. (c) zeitliche Entwicklung der Zelle trockene Masse berechnet das Integral der Phase über den segmentierten Zellbereich gemäß Gleichung (1). (d) Handlung des Durchschnitts Zelle Dicke als Funktion der Zeit gemäß Gleichung (2) berechnet. Die Dicke der Zelle zeigt scharfe Spitzen entsprechend Zellteilungen (gelbe Kreise in (a) und die rote Linien (b, c, d, e)). (e) Grundstück von der Zelle Motilität als Funktion der Zeit. (f) Segmentierung Ergebnisse entsprechend bis zum letzten Frame des Titels bei T0 + 66h20min, wenn die Zelldichte etwa 475 Zellen/mm2 ist. Das Bild ist 200 x 200 µm2 konzentrierte sich auf die Zelle von Interesse. Die weißen Flecken (rote Sternchen) entsprechen Zellenrückstand, die nach einem Tag der Zellkultur erscheinen. (g), 800 x 800 µm2 beschnitten rekonstruierten Phase Bild des letzten Frames dieser Zelle Spur. Die Zelle von Interesse ist umgeben von einem gelben Kreis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9: Zellzyklus Analyse. (ein) Verteilung der Zellzyklus-Dauer für eine 2,7-Tag-Beobachtung der kultivierten HeLa-Zellen (N = 10, 584 Zelle Zyklen). Die Verteilung der Zellzyklus-Dauer ist in der Nähe von Gauß mit einem Mittelwert von 16,5 Stunden und eine relative Standardabweichung von 12,3 % (Standardabweichung gemessen auf dem Gaußschen Gipfel dividiert durch den Mittelwert der Verteilung). (b) Vergleich zwischen der manuellen und automatischen Zelle tracking für die Bestimmung der Zellzyklus Länge. Die manuelle Nachführung verfügt über 100 Zellzyklus Trajektorien (10.148 Zelle Positionen). (c) Verteilung der ersten Zeit der automatisch erkannten Zellzyklus Bahnen. (d) Handlung des gemessenen erste Zelle trockene Masse (kurz nach der Zellteilung, schwarze Punkte) und letzte Zelle Trockenmasse (kurz vor der Zellteilung, rote Punkte) als Funktion der Zeit. Auf jedes Feld entspricht einem Lagerplatz von 6 h, die rote zentrale Markierung zeigt den Median und die unteren und oberen Kanten des Quaders angeben bzw. die 25. und 75. Perzentile. Die Schnurrhaare erstrecken sich auf die extremsten Datenpunkte nicht als Ausreißer. (e) Streudiagramm der letzten Zelle trockene Masse als Funktion der erste trockene Masse. (f) Evolution der Zelle trockene Masse Wachstumsrate als Funktion der Zeit Experiment. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Datei 1: Code'segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m'. Dieses Matlab-Code verwendet die "Trackmate" Dataset die Zelle Segmentierung der komplette Zeitraffer Übernahme durchführen von denen die rekonstruierten Phasenbilder in den Ordner "Folder_out" gespeichert werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzende Datei 2: Code 'lineage_Version_Jove.m'. Dieser Code verwendet das Array "Trackmate" mit der Zelle Segmentierungsalgorithmus (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m), um die Zellzyklus-Trajektorien zu extrahieren und bestimmen die verschiedenen Parameter von Interesse, z.B.verarbeitet., die Zelle Zyklusdauer, die erste Zelle Trockenmasse und die letzte Zelle Trockenmasse. Dieser Code besteht aus zwei Teilen, der erste Teil beschäftigt sich mit der Erkennung von teilenden Zellen und der zweite Teil mit der Analyse der Zellzyklus Bahnen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In diesem Beitrag zeigen wir, dass dieses Objektiv-freie Videomikroskopie in einer Brutmaschine verwendet werden kann, um die Kinetik von Tausenden von Zellen zu erfassen. Um zu beschreiben, der Gesamtmethodik haben wir erklärt, wie eine 2,7 Tage Zeitraffer Übernahme von HeLa-Zellen in Kultur mit standard Handy-Tracking-Algorithmen analysiert werden kann. Das Ergebnis ist ein Dataset mit 2,2 x 106 Zelle Messungen und 10.584 Zelle Radwege. Die Akquisitionen wurden durchgeführt, auf eine Kultur der Hela-Zellen mit einem relativ großen Abstand von Zelle zu Zelle (Zelle Dichte < 500 Zellen/mm2) und Zelle Morphologie, die mit einer Scheibe angenähert werden kann. Diese beiden Funktionen erleichtern die Anwendung eine automatische Handy-Tracking-Analyse macht es möglich, eine große Datenmenge zu erfassen. Anderen Zelllinien mit kleineren Abstand von Zelle zu Zelle oder mit komplexer Morphologien wäre schwieriger zu verfolgen und nachfolgende Datensätze wäre kleiner.
Wir glauben, dass dieser Ansatz interessant für viele Studien, z.B. Zellproliferation und Zelle Größe Studien ist. Letztere sind ein wichtiger Bereich der Forschung in grundlegende Biologie und viele Fragen unbeantwortet bleiben, so schön in einer Rezension von Ginzberg Et Al. diskutiert 29. das Protokoll vorgeschlagen, in diesem Werk bietet somit ein Mittel, um wichtige Metriken messen erforderlich für Zell Proliferation Studien, d. h. die Zellzyklus-Dauer, die Zelle Trockenmasse, die Zelle trocken-Masse-Verhältnis zwischen dem Ende und dem Beginn des Zyklus und die Zelle trockenen Masse Wachstumsrate. Neben der Untersuchung der Zellproliferation wird diese Methode von Interesse für das Studium der Zellwanderung, sein, da es eine große Anzahl von Titeln, jeweils mehrstündige produzieren kann. Dieses Protokoll geht über den Stand der Technik14,30 zeigen zum ersten Mal den Erwerb von Tausenden von Titeln der Zelle während mehr als 10 h.
Zusammenfassend haben wir eine einfach zu bedienende Objektiv-freie Technik entwickelt, mit dem gleichzeitig Tausende von markierungsfreie Zellen über mehrere Tage der Kultur verfolgen können.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren haben nichts zu erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
References
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).
- Reed, J., et al. Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry. Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).
- Girshovitz, P., Shaked, N. T. Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization. Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).
- Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy. J Biomed Opt. 15 (3), (2010).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).
- Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy. J Biomed Opt. 17 (7), (2012).
- Aknoun, S., et al. Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).
- Cotte, Y., et al.
- Choi, W., et al.
- Kesavan, S. V., et al. High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy. Sci Rep. 4, 1-11 (2014).
- Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM). Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy. Sci Rep. 4, 4717 (2014).
- Allier, C., et al. Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy. Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).
- Su, T. -W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
- Delacroix, R., et al. Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis. Sci Rep. 7, 39893 (2017).
- Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2016).
- Popescu, G. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
- Liu, P. Y., et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future. Lab Chip. 16, 634-644 (2016).
- Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters. PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).
- Al-Kofahi, O., et al. Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells. Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).
- Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells. J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).
- Zocchi, E., et al. Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells. J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).
- Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).
- Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F. Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).
- Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity. J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).
- Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075 (2015).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
