Dinamik için objektif-ücretsiz Video mikroskobu ve kantitatif analiz yapisan hücre kültürü
Summary
Objektif-ücretsiz video mikroskobu hücre kültürleri doğrudan kuluçka makinesi içinde izlemek sağlar. Burada biz almak ve kültürlü HeLa hücreleri 2,7 gün uzun edinimi çözümlemek için kullanılan tam iletişim kuralı tanımlamak, 2.2 x 10 bir veri kümesi için önde gelen6 ölçümleri tek hücre morfolojisi ve 10584 hücre döngüsü izler.
Abstract
Burada, biz o objektif-ücretsiz video göstermek mikroskobu hücreleri doğrudan kuluçka makinesi içinde binlerce Kinetik aynı anda yakalamak için bize sağlar ve birkaç hücre döngüsü boyunca tek hücreleri ölçmek ve izlemek mümkündür. Biz 2,7 gün bir HeLa hücre kültürü ölçmek ve izlemek için kullanılan tam iletişim kuralı tanımlamak. İlk olarak, hücre kültürü edinme objektif-ücretsiz video mikroskopla gerçekleştirilir ve sonra verileri bir dört adımlı süreç aşağıdaki analiz edilir: Çoklu dalga boyu holografik yeniden yapılanma, hücre-izleme, hücre segmentasyon ve hücre bölünmesi algılama algoritmalar. Sonuç olarak, bir veri kümesi 10.000 hücre döngüsü parça ve 2 x 10’dan fazla6 hücre morfolojik ölçümler daha fazla featuring toplamak mümkün olduğunu gösteriyor.
Introduction
Boyut ve hücre hücre birkaç hücre döngüsü boyunca kültürlü memeli hücreleri izleme ve doğru ölçme kuru kütlesi olduğunu zor bir görev. Birkaç etiket içermeyen optik teknikleri bu görev1,2gerçekleştirmek edebiliyoruz: faz kayması Interferometry3, dijital holografik mikroskobu (DHM)4,5,6, 7, quadriwave yanal kesme Interferometry8,9 ve nicel faz tomografi10,11. Bu yöntemler memeli hücrelerinin hücre döngüsü anlayış içine birçok yeni anlayışlar açmıştır. Ancak nadiren algoritmaları izleme otomatik hücre ile birleştiğinde ve onların üretilen iş ne zaman ölçme sınırlı kalır kitle yörüngeleri1 hücre (N < 20 sırasıyla3,4,5 , 6). dolayısıyla bir roman optik yöntemi hücre kitle yörüngeleri büyük istatistikleri ile ölçmek için gereklidir (N > 1000).
Bu yazıda, biz aynı anda hücreleri doğrudan kuluçka makinesi içinde binlerce resim ve tek hücre ölçümleri tek hücre döngüsü parça binlerce boyunca ölçmek için objektif-ücretsiz video mikroskobu yeteneğini göstermek. Objektif-Alerjik mikroskobu mi nicel bir aşama aşama görüntü yoğun paketlenmiş hücre edinimi üzerinde görüş çok büyük bir alan sağlayan teknik görüntüleme (genellikle birkaç on mm2, burada 29.4 mm2)12,13 ,14,15. Tek hücre düzeyinde çeşitli ölçümler belirlenir, örneğin, hücre alanı, cep kuru kitle, hücre kalınlığı, hücre Binbaşı eksen uzunluğu ve en boy oranı12,15, her görüntü hücre. Sonra bir hücre izleme algoritma uygulayarak, bu özellikler tek her hücre için deneme süresi14,15bir fonksiyonu olarak çizilebilir. Ayrıca, hücre bölünmeler oluşumunu hücre parça olarak algılayarak, ilk hücre kuru kitle (hemen sonra hücre bölünmesi), son hücre kuru kitle (hemen önce hücre bölünmesi) ve hücre gibi diğer önemli bilgileri ayıklamak mümkün olduğunu döngüsü süresi, Yani, iki ardışık tümen15arasındaki süre. Bu ölçümler ile çok iyi istatistikler hesaplanabilir (N > 1000) geniş görüş alanı genellikle 200-10.000 hücreleri tek bir objektif-Alerjik kazanım analizi sağlayacak bu yana.
Objektif-ücretsiz video mikroskobu dayalı bu yöntemi açıklamak için protokolü için 2,7 gün bir HeLa hücre kültürü ölçmek ve izlemek için açıklar. Veri analizi çok dalga boyu holografik yeniden yapılanma, hücre izleme, hücre segmentasyon ve hücre bölünmesi algoritmaları dayalı dört adımlı bir işlemdir. Burada Standart hücre izleme algoritmaları ile uyumlu Uzaysal çözünürlük ve bu objektif-ücretsiz video mikroskobu Kur’a elde nispeten hızlı kare hızı (bir edinme her 10 dakikada bir) gösterilir. Bu veri kümesinin tam analiz tam hücre döngüsü 10,584 hücre parça ölçüm sonuçları.
Özet olarak, objektif-ücretsiz video mikroskobu otomatik olarak etiketlenmemiş, eşitlenmemiş binlerce ve deney başına değiştirilmemiş hücre izlemek için güçlü bir araçtır; birkaç hücre döngü üzerinde izlenen her hücre. Bizim ölçümleri böylece birkaç hücre parametreleri, ama daha da önemlisi, arası hücre değişkenlik hücrelerinin büyük bir nüfus üzerinden ortalama değerini sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, bu objektif-ücretsiz video mikroskobu içinde bir kuluçka hücreleri binlerce Kinetik yakalamak için kullanılabileceğini göstermektedir. Genel yöntembilim tanımlamak için HeLa hücreleri kültür 2,7 gün hızlandırılmış edinimi Standart hücre izleme algoritmalarıyla nasıl çözümlenebilir açıkladı. 2.2 x 106 hücre ölçümleri ve 10,584 hücre döngüsü parça içeren bir veri kümesi sonucudur. Satın almalar Hela hücreleri nispeten büyük bir hücre hücre mesafe ile bir …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar kabul etmek bir şey yok.
Materials
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
References
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).
- Reed, J., et al. Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry. Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).
- Girshovitz, P., Shaked, N. T. Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization. Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).
- Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy. J Biomed Opt. 15 (3), (2010).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).
- Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy. J Biomed Opt. 17 (7), (2012).
- Aknoun, S., et al. Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).
- Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
- Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Kesavan, S. V., et al. High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy. Sci Rep. 4, 1-11 (2014).
- Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM). Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy. Sci Rep. 4, 4717 (2014).
- Allier, C., et al. Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy. Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).
- Su, T. -. W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
- Delacroix, R., et al. Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis. Sci Rep. 7, 39893 (2017).
- Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2016).
- Popescu, G. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
- Liu, P. Y., et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future. Lab Chip. 16, 634-644 (2016).
- Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters. PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).
- Al-Kofahi, O., et al. Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells. Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).
- Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells. J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).
- Zocchi, E., et al. Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells. J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).
- Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).
- Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F. Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).
- Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity. J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).
- Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075 (2015).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
