Summary
Microscopía lente libre de vídeo nos permite supervisar cultivos celulares directamente dentro de la incubadora. Aquí describimos el protocolo completo utilizado para adquirir y analizar una adquisición largo 2,7 días de cultivos de células HeLa, conduce a un conjunto de datos de 2.2 x 106 mediciones de morfología de la célula individual y ciclo celular 10584 pistas.
Abstract
Aquí, demostramos que video gratis lente microscopía nos permite capturar simultáneamente la cinética de miles de células directamente dentro de la incubadora y que es posible supervisar y cuantificar las células a lo largo de varios ciclos de la célula. Describimos el protocolo completo usado para monitorear y cuantificar un cultivo celular HeLa de 2,7 días. En primer lugar, se realiza adquisición de cultura de célula con un microscopio de lente-libre de vídeo, y luego los datos son analizados siguiendo un proceso de cuatro pasos: detección de segmentación y división celular de celular rastreo de celular, reconstrucción holográfica de la multi-longitud de onda, algoritmos. Como resultado, mostramos que es posible reunir un conjunto de datos cuenta con más de 10.000 pistas de ciclo celular y las mediciones de más de 2 x 106 células morfológica.
Introduction
Monitoreo de células de mamíferos cultivadas a lo largo de varios ciclos de la célula y medir con precisión la célula tamaño y célula masa seca es una tarea difícil. Varias técnicas de etiqueta-libre ópticas son capaces de realizar esta tarea1,2: desfasaje interferometría3, microscopia holográfica digital (DHM)4,5,6, 7, quadriwave lateral corte interferometría8,9 y fase cuantitativa tomografía10,11. Estos métodos han conducido a muchas nuevas perspectivas en la comprensión del ciclo celular de células de mamíferos. Sin embargo rara vez se juntan con algoritmos de seguimiento automático de la célula y su rendimiento sigue siendo limitada cuando medición de células trayectorias masa1 (N < 20 respectivamente3,4,5 , 6). por lo tanto es necesario un novedoso método óptico para medir trayectorias masa celular con estadísticas grandes (N > 1000).
En este trabajo demostramos la capacidad de microscopía lente libre de vídeo imagen simultáneamente miles de células directamente dentro de la incubadora, y luego cuantificar métricas de unicelular a lo largo de miles de pistas de cada ciclo celular. Lente libre la microscopia es una fase cuantitativa, técnica que permite la adquisición de la imagen de la fase de células densamente sobre un gran campo de visión de la proyección de imagen (normalmente varias decenas de mm2, aquí 29,4 mm2)12,13 ,14,15. Se determinan varias métricas a nivel unicelular, por ejemplo, área de la célula, celular de masa seca, espesor de célula, célula eje mayor longitud y proporción12,15, de cada imagen de la célula. Luego, mediante la aplicación de un algoritmo de seguimiento de la célula, se pueden trazar estas características para cada célula individual en función del experimento tiempo14,15. Además, mediante la detección de la ocurrencia de divisiones celulares en las pistas de la célula, es posible extraer información importante tales como la celda inicial seca masa (justo después de la división de célula), la masa seca de la célula final (justo antes de la división de célula) y la célula ciclo de duración, es decir, el tiempo entre dos divisiones consecutivas15. Todas estas mediciones se pueden computar con muy buenas estadísticas (N > 1000) ya que el gran campo de visión por lo general permitiría el análisis de 200 a 10.000 células en una sola adquisición libre de lentes.
Para explicar esta metodología basada en microscopía lente libre de vídeo, se describe el protocolo para controlar y cuantificar un cultivo celular HeLa de 2,7 días. Análisis de datos es un proceso de cuatro pasos, basado en reconstrucción holográfica de la multi-longitud de onda, seguimiento de células, segmentación de la célula y algoritmos de la división celular. Aquí se demuestra que la resolución espacial y la velocidad de fotogramas relativamente rápido (una adquisición cada 10 minutos) con esta configuración de microscopía lente libre de vídeo es compatible con estándar algoritmos de seguimiento de la célula. El análisis completo de este conjunto de resultados en la medición de 10.584 celular pistas sobre ciclos celulares completos.
Para resumir, microscopía lente libre de vídeo es una herramienta poderosa para monitorizar automáticamente miles de sincronización, sin etiqueta y sin modificar las células por experimento; cada célula rastrean varios ciclos de la célula. Nuestras mediciones ofrecen el valor medio de varios parámetros de la celda, pero más importante aún, la variabilidad inter-célula sobre una gran población de células.
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Protocol
1. célula cultura control adquisición
- Cultivar células HeLa en DMEM + glutamina (p. ej., GlutaMAX) suplementado con 10% (v/v) ternera fetal inactivado por calor del suero y el 1% penicilina y estreptomicina.
- Capa 6-pozo cristal placas inferior con fibronectina (25 μg/mL) durante 1 hora. Entonces la semilla 2 x 104 células por pocillo.
- Durante la adquisición, cambiar el medio cada 3 días.
- Para la adquisición de Time-lapse, utilizar el microscopio lente gratis video (disponible comercialmente).
Nota: Esto se basa en la técnica de imagen Computacional libre lente descrito por Ozcan et al. 16 que fue modificado para llevar a cabo un monitoreo continuo en una incubadora a una temperatura controlada de 37 ° C12,15. Cuenta con un sensor de imagen de semiconductor (CMOS) de óxido de metal complementario con una echada del pixel de 1,67 μm y una superficie de proyección de imagen de 6.4 x 4.6 mm2. Múltiples de longitud de onda iluminación es proporcionada por un multichip luz emitiendo diodo (LED) dispositivo que proporciona iluminación de roja, verde y azul. Las longitudes de onda están centradas, en 636, 521 y 452 nm respectivamente, con un ancho de banda espectral de 25, 45 y 25 nm respectivamente. El rojo, verde y azul (RGB) LED se encuentra por encima de una 150 μm del agujero de alfiler a una distancia de aproximadamente 5 cm de las células. La potencia de luz mide cerca de lo LED es tan baja como 10 μW en cada longitud de onda y el tiempo de iluminación es sólo un segundo por adquisición. Por lo tanto, no hay problemas de toxicidad de la foto esperan cuando cultivos de células se observan bajo el microscopio lente libre de vídeo. - Poner el contenedor de la cultura de célula ponerse en contacto con el sensor CMOS (figura 1). Utilice un recipiente con un cubreobjetos de vidrio en la parte inferior, que es importante para la calidad de la adquisición gratuita de lentes. También pueden utilizar envases de plástico pero se degradará la adquisición libre de lentes debido a la mala calidad óptica de estos contenedores.
- Control de video gratis lente de microscopio con el software de adquisición (disponible comercialmente), que realiza la adquisición de Time-lapse y la reconstrucción holográfica. Los parámetros que necesitan ser introducidos por el usuario en la interfaz del software son la velocidad de fotogramas, la duración de la experiencia y el tipo de cultivo celular, células por ejemplo, adherentes o flotante.
- Establecer los parámetros de software de adquisición de la entrada. Establecer la velocidad de fotogramas establece que una adquisición cada 10 minutos y el tipo de cultivo celular en 'adherente'.
Nota: Una velocidad de adquisición de una cada 10 minutos es un buen compromiso, como asegura un celular confiable de seguimiento mientras que el tamaño del conjunto de datos resultante a analizar es todavía razonable. La velocidad de fotogramas más rápida con esta configuración de microscopía lente-libre es una adquisición cada 5 minutos. Aumentando la velocidad de fotogramas se traduce en calentamiento del sensor CMOS que puede afectar la viabilidad de las células en cultivo. - Iniciar la adquisición de Time-lapse, y el algoritmo de reconstrucción holográfica (disponible comercialmente) procesará automáticamente la adquisición gratuita de lentes para obtener la imagen de la fase de cultivo celular. El algoritmo de reconstrucción holográfica se basa en una onda fase recuperación algoritmo17 y proporciona una imagen de fase reconstruido de RGB en el rango de [-π, + π] para cada celda individual en un gran campo de visión de 29,4 mm2. El principio de la holografía en línea libre de la lente es iluminar una muestra delgada (en z = 0) con una onda de plano (de amplitud 1 después de normalización) y detectar en un sensor CMOS de la imagen de la intensidad de difracción posterior a una corta distancia z = Z, normalmente 1 mm después de la muestra. En nuestra configuración, la iluminación se conecta secuencialmente a 3 longitudes de onda (λ1= 0.450 μm, λ2= 0.540 μm, λ3= 0,647 μm) para medir tres patrones de difracción de la muestra misma.
2. célula cultura análisis de datos
- Para el rastreo de celulares, utilizan el algoritmo Trackmate, un plugin de Fiji de código abierto para el seguimiento automatizado de partículas solo18. En cargar en primer lugar, la adquisición completa de Time-lapse en Fiji (comando de secuencia de imagen de carga). Debido al gran tamaño de los conjuntos de datos, que incluye típicamente 400 marcos de RGB de 29,7 Mb, es más rápido cargar en formato de 8 bits. A continuación el plugin Trackmate Fiji guía al usuario a través de varias etapas del algoritmo de rastreo de celulares, es decir, una etapa de detección de células, una etapa de rastreador de celulares y varios filtros aplicados a las detecciones de la célula y las pistas computadas. En cada etapa, configurar los algoritmos y ver los resultados inmediatamente para que, si es necesario, uno puede fácilmente navegar hacia adelante y hacia atrás para reajustar la configuración. Los distintos menús de la interfaz Trackmate se muestran en la figura 2 con los ajustes reales utilizados para el experimento de las células HeLa.
- Establecer los parámetros de software de adquisición de la entrada como la siguiente (ver figura 2). Establece el diámetro de gota estimada en 15 píxeles, el umbral del detector a 0.25, la distancia máxima de enlace en 15 píxeles, la distancia máxima de cierre de la brecha a 15 píxeles y el número de puntos en las pistas a 3.5.
Nota: Estos valores obviamente serán diferente de un experimento a otro, especialmente el 'blob Estimado diámetro' que se corresponde con el tamaño de la celda (aquí dado en píxeles de 1,67 μm). La misma observación se aplica a la 'distancia máxima vinculación' que representan la distancia máxima recorrida por una celda de dos fotogramas consecutivos (aquí dada en píxeles de 1,67 μm). Su valor óptimo dependerá de motilidad celular sino también de la densidad celular. - Al final del proceso de seguimiento de la célula, genera los resultados en forma de tres archivos de texto ('Análisis' botón, ver figura 2). El archivo más útil, denominado estadísticas de pistas puntos, consiste en una tabla todo detectadas células con sus posiciones respectivas (x, y) en la adquisición, su número y su número de pista. Sobre la base de datos, realizar segmentación de células y detectar divisiones celulares utilizando algoritmos dedicados (ver archivos de código complementario). Los dos archivos se denominan 'Enlaces en las estadísticas de pistas' y 'Pista estadísticas' y son todos los resultados relacionados con pistas, por ejemplo, duración de la pista, número de deficiencias detectadas, pista marco inicial, etcetera.
- Utilizar el algoritmo de segmentación de la célula (véase código complementario archivo) para extraer automáticamente varias métricas que describen la morfología de la célula de la imagen de la fase de reconstrucción. Estas métricas son la superficie de la célula (S), la longitud del eje mayor de la célula (L), la longitud del eje menor de la célula (l) y la relación de aspecto de la célula (L/l). La fase de microscopía lente libre es proporcional a la densidad y el espesor de la capa de la muestra según lo discutido previamente15.
- Además de las características morfológicas de la célula, extracto seco medidas de (MDL) masa celular cuantitativa de la fase reconstruido13,19,20
Ecuación (1)
donde φ(x,y) es el cambio de fase reconstruido19, λ la longitud de onda y α = 1,8 x 10-4 m3/kg el índice de refracción específico relacionado con la variación del índice de refracción para secar la masa1, 19. - Evaluar el espesor de la célula mediante una estimación de la diferencia entre el índice de refracción de la célula y de los medios de cultivo. Se da la relación entre la célula de espesor h(x,y) y el desplazamiento de fase medido por20:
Ecuación (2.1)
Ecuación (2.2)
Δn(x,y) = nde lacelda (x,y) - medio de n (x,y), la diferencia de índice de refracción entre la célula y los medios de cultivo. En el siguiente, asume un valor constante de Δn = 0.025, que se calcula por el índice de refracción medido en los núcleos de célula HeLa (n = 1.35511) y la de medios de cultivo de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (n = 1.33). Aunque el valor de espesor de célula es sólo indicativo ya que se basa en una asunción, sus variaciones relativas son significativos y pueden ser aprovechados para detectar células divisorias. - Utilizar el algoritmo dedicado (ver código complementario archivo) para detectar la ocurrencia de divisiones celulares y luego extraer las pistas de células que se asocian a las divisiones de célula detectadas, con el fin de detectar una división de célula, las células con un espesor medido más grande que 8 μm primero se identifican a continuación, compruebe si una nueva célula aparece estrechamente en espacio y tiempo. De esta manera, la detección de las divisiones de célula se basa en dos criterios robustos. Alternativas y métodos más elaborados para la detección de la división de célula pueden aplicarse a la adquisición de Time-lapse de lensfree21,22,23.
Ecuación (1)
Ecuación (2.1)
Ecuación (2.2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para el proceso de reconstrucción holográfica, el campo de la luz se describe por un campo escalar A (donde 
es el complejo valor de A en el plano de la distancia z de la posición de la muestra y el lateral 
y en la longitud de onda λ). Propagación de la luz es modelada por la teoría de Huygens-Fresnel que proporciona un núcleo propagador 
. Por lo tanto, la amplitud del campo en el plano del detector, unz se relaciona con la amplitud de luz A0 por la siguiente relación:
es decir
con 
, donde i es el número complejo (i2=-1)
La medición de la intensidad es simplemente modelada por 
. El objetivo del algoritmo de reconstrucción es encontrar un 'bueno' campo A0, relacionadas con la muestra observada, que difracción coincidirá con la intensidad medida Iz. La estrategia es considerar a la fase de campo de amplitud en el detector plano φz como desconocida del problema y optimizar un criterio multiespectral variación total del objeto. Más explícitamente, considerando los campos
es decir
para cualquier fase campo φz, 
perfectamente con los datos desde 
. Para que el campo posterior 
es un campo de amplitud posible en el plano de la muestra, dado la imagen de la intensidad observada. Esta es la razón por qué un criterio relativo A0 se utiliza para especificar una solución única entre todas posibilidades de coincidencia de datos. El criterio para minimizar fue elegido como:
donde x e y son las coordenadas para el plano, es decir, 
. Uso de tal criterio permite seleccionar, entre todos los campos posibles, un campo de muestra mostrando bordes afilados en la misma posición para todas las longitudes de onda, que es físicamente significativo. Este método reduce la incidencia de 'twin-imágenes' en el campo reconstruido un0. La doble imagen es un importante artefacto que resulta de la falta de información de fase durante el proceso de adquisición.
Para el cálculo práctico, los integrales son discretizar con un muestreo espacial correspondiente a la resolución del detector, los derivados son substituidos por los operadores Sobel y circunvoluciones por el propagador de Huygens-Fresnel 
son realizados por va el espacio de Fourier donde 
tiene una simple expresión: 
. Minimización del ε criterio (real) con respecto a las variables (reales) set 
se aborda utilizando el método gradiente conjugado no lineal, que requiere el gradiente de ε a computar para cualquier fase asociada a cada detector de píxeles para cada uno longitud de onda.
Desenvolver la fase de reconstrucción de la célula
La figura 3 muestra los resultados de la reconstrucción holográfica de un fotograma de un time-lapse adquisición de células HeLa en cultura. Figura 3a muestra el campo de visión completo de una adquisición de crudo en el canal azul en un área de2 mm 29,4. Basado en esta imagen y los adquiridos en los canales rojo y verdes, la reconstrucción holográfica produce una imagen RGB de fase de las celdas como se muestra en las Figuras 3b y 3C. La imagen reconstruida fase exhibe artefactos de la fase local envuelto correspondientes a células que inducen un cambio de fase superior a + π. Para llevar a cabo una fase simple desenvolver, implementamos un medio heurístico, es decir, detectar los píxeles con el valor 
superior a 0.3 y configurar estos pixeles a + π. Este sencillo método se basa en una propiedad de las imágenes de fase RGB reconstruido. En teoría en cada píxel debemos medir una relación 
igual a 
. Pero en el caso de mitotic de la célula, cuando se produce el ajuste de fase, esta relación se mantiene no en la imagen de fase reconstruido RGB (figura 3f). El mencionado método heurístico aprovecha esta propiedad para que un umbral simple puede utilizarse para detectar los píxeles que presenta ajuste de fase. Los resultados de la imagen de fase reconstruido antes y después de desenvolver se muestra en las figuras 3f y 3 g, respectivamente. Estas imágenes de fase sin envolver entonces se alimentan en el algoritmo de seguimiento de la célula. Sin este paso desenvoltura, el algoritmo de rastreo de celulares no detectar células en división y en células de gran espesor, que podría comprometer los resultados finales. La resolución de la imagen de fase reconstruido era estimada para ser aproximadamente 5 μm15 (resolución espacial completo de paso), que es relativamente gruesa. Sin embargo, es posible observar detalles como lamellipodia y célula citoplasma (figura 3f y 3 g). Lo más importante, la imagen obtenida por microscopía lente libre muestra un gran contraste y está exenta de artefactos de halo. Esto facilita la detección automática de la célula y célula de seguimiento.
Análisis de datos de cultivo celular
Para extraer el ciclo celular las pistas, el análisis de datos se basa en una serie de algoritmos, es decir, la célula de seguimiento realizado con el plugin Trackmate Fiji, la detección de las divisiones y finalmente la extracción de la célula ciclo pistas, es decir, la secuencia entre dos divisiones celulares. A continuación discutimos la calidad de las salidas de estos algoritmos en comparación con mediciones manuales.
La figura 4 muestra capturas de pantalla distintos de los resultados de la célula de seguimiento, los resultados del algoritmo de detección de células y los resultados de los análisis de seguimiento de la célula. La detección de células en la adquisición de libres de lente (figuras 4a-4 c) es el primer paso del algoritmo de rastreo de celulares. Para validar el algoritmo de detección de la célula, anota manualmente una pequeña parte de la adquisición de lente-free Time-lapse (214 marcos de 663 x 663 μm2). Manualmente había seleccionado un total de 5365 celular posiciones y compararon estos resultados con los obtenidos por el plugin Trackmate Fiji. La figura 5 muestra los resultados en términos de detección de verdaderos, falsos positivos y falsos negativos. La sensibilidad resultante es aproximadamente el 96% y el valor predictivo positivo mayor que 99.7%. Estos valores altos reflejan la buena calidad de las imágenes reconstruidas de fase obtenidos con la instalación de microscopía lente libre de vídeo. Después de la detección de la célula, un algoritmo de segmentación celular permite para medir, para cada celda, varios indicadores diferentes, por ejemplo, el área de la célula, la célula seca la masa y el espesor de la célula. La Figura 6a muestra el principio del algoritmo de segmentación y figura 6f muestra imágenes segmentadas en una secuencia de tiempo para un área de interés de 663 x 663 μm2 (igual que en figura 5). El algoritmo inicia la segmentación por umbralización la imagen de fase (ver figura 6b) y luego se aplica un procedimiento de siembra (ver figura 6 c). Es decir, los píxeles del centro de las células detectadas se establecen en el valor de la pista correspondiente. Las posiciones X-Y de las células y su número de pista correspondiente son proporcionadas por el archivo de 'Puntos en las estadísticas de las pistas' obtenido después de seguimiento de la célula. Luego, se implementa un procedimiento iterativo de relleno que se extiende la semilla a los límites de la célula (figuras 6C-e) determinada por el umbral inicial (figura 6b). Este procedimiento de llenado depende de las operaciones básicas de morfología matemática, por ejemplo, la dilatación y la erosión. El resultado de la segmentación, es entonces posible calcular varios indicadores en el nivel unicelular, es decir, las características morfológicas como la longitud de la célula, el área de la célula y la relación de aspecto de la célula, pero también, más importante aún, la celda seca según Ecuación 1. Con el fin de evaluar la fiabilidad de la microscopía lente gratis medición de la celda seca, hemos comparado la imagen de fase reconstruido lente libre de células HeLa fijadas (figura 6 g) con la misma región adquirida por medio de un digital holográfico microscopio con el objetivo 5 X (figura 6 h). Muestra figura 6i la celda seca masa medido por medio de microscopía lente libre como función de la masa seca medida con DHM para 302 segmentado las células HeLa. Hay una buena correlación entre las dos medidas (coeficiente de determinación R2 es de 0.86, pendiente = 0.9, offset = pg-17). De figura 6i, podemos estimar la precisión de la medición de masa seca de celular obtenida mediante microscopía lente libre. La precisión de la medida el error cuadrático medio entre los datos libres de lente y el ajuste lineal, es cerca de 16 pg.
Al compilar todas las medidas de la célula sobre la adquisición completo Time-lapse, entonces es posible obtener diagramas de dispersión de varias métricas en función del tiempo como se muestra en la figura 7. Estos diagramas de dispersión proporcionan información sobre la cinética de las células cultivadas por una población muy grande. El número de células en el campo de visión aumenta desde 2.000 hasta 15.000 (Figura 7a). Multiplicado por el número de puntos del tiempo, esto nos lleva a una gran base de datos de 2.2 x 106 detecta células, cada uno de ellos caracterizado por sus coordenadas y características morfológicas, es decir, masa seca de la célula (figura 7b), área de celular (figura 7 c) , la célula de espesor medio (figura 7 d), longitud del eje mayor (figura 7e) y relación de aspecto (figura 7f).
Lo importante es la combinación de algoritmos de segmentación de la célula y la célula seguimiento nos permite medir la cinética a nivel unicelular. Por ejemplo, la figura 8 muestra el análisis de una célula de seguimiento a 66 horas de duración y exhibiendo cuatro divisiones de célula en T0 + h 4,1, T0 + h 20,5, T0 + h 36,7 y T0 + 53,3 h. figura 8a muestra los resultados del algoritmo de segmentación automática de la célula que permite nos para delimitar eficientemente la superficie de esta célula. Mediante la segmentación de la célula, entonces es posible calcular varias métricas en función del tiempo, por ejemplo, la superficie de la célula (figura 8b), la celda seca masa (figura 8 c), el espesor promedio de la célula (figura 8D) y la célula motilidad (figura 8e). De estas gráficas, claramente se puede medir la cinética de estas métricas celulares entre las divisiones de célula. En particular se puede observar el aumento del área celular y masa seca durante el ciclo celular. Además, usando la detección automática de las divisiones de célula, tres pistas de diferente ciclo celular se pueden extraer de esta pista y la duración del ciclo celular, es decir, el período entre dos divisiones, se puede estimar. En la pista de célula se muestra en la figura 8, que mide tres duraciones de ciclo celular, es decir, 16,4 h, h 16,2 16,7 h. compilación de todo el ciclo de la célula pistas a partir del análisis de un 2,7 días resultados adquisición de Time-lapse en la detección de las divisiones de célula 16725 y la descripción de 10.584 pistas de ciclo celular. Entonces es posible medir la media y la variabilidad de la duración del ciclo celular con sonido estadísticas. Se encontró que la distribución de la duración del ciclo celular es cerca de distribución Gausiana (Figura 9a) con una media de 16,5 h y una desviación estándar relativa de 12.4% (desviación estándar mide el pico gaussiano dividido por la media de la distribución ). El medio tiempo de 16,5 h de duplicación es consistente con las longitudes de ciclo celular medidas manualmente en la pista presentada en la figura 8. Miente sin embargo en la gama más baja de los valores publicados de HeLa duplicar tiempo que son generalmente entre 20 y 30 h24,25,26,27. Sin embargo, en la referencia28, un corto tiempo de duplicación de 16,2 ± 1,7 h también es mencionado. Para más validar nuestras mediciones de longitudes de ciclo celular y confirmar la fiabilidad de la técnica de microscopía lente libre, hemos realizado un seguimiento manual de 100 pistas de ciclo celular (10.148 posiciones de célula). En la celda ciclo pistas obtenidas manualmente (N = 100) la longitud de ciclo celular medido es de 16.7±1.9 h (N = 100, Figura 9b). Esto está muy cerca de la medida de 16.5±2.1 h (N = 10.584) obtenidos con la celda automática de seguimiento, demostrando la validez del análisis general. Cuando están bien correlacionadas a los medido comparando el seguimiento manual de célula ciclo trayectorias al que determinaron automáticamente, encontramos que el 67% de las pistas del ciclo celular se detectó con éxito y que las longitudes de ciclo medición automáticamente manualmente (Figura 9b). Se midió la eficiencia de la detección de las trayectorias del ciclo celular en las primeras 32 horas del experimento, con una densidad inferior a 150 células/mm2. Obviamente, esta tasa de detección disminuye con el tiempo, como la célula aumenta la densidad ~ 500 células/mm2. El número de ciclo celular detectado pistas alcanza una meseta en T0 + h 32 (figura 9C) mientras que el número de células aumenta aún por un factor de tres entre T0 y T0 + 32 h, 72 h (Figura 7a). Teniendo en cuenta la tasa de falsas detecciones positivas y negativas, Figura 9b presenta afloramientos de 5 puntos: 4 de ellos son debido a la detección de falsos negativa (longitud de ciclo > 25 h) y 1 para una detección positiva falsa (longitud de ciclo < 10 h). Para obtener este resultado, hemos utilizado un umbral alto espesor (8 μm) en el algoritmo de detección de la división celular, con el fin de favorecer un bajo índice de falsos positivos. Además, las pistas que presentan inconsistencia han sido filtradas hacia fuera, es decir, ciclo celular cuya duración es inferior a 6 h y pistas con una trayectoria de masa seca que no aumenta linealmente en función del tiempo. Son sólo el 3% del número total de pistas del ciclo celular. Como resultado, la distribución de la duración del ciclo celular obtenida automáticamente está bien aproximada por una gaussiana (Figura 9a) con un bajo número de pistas cortas (duración del ciclo celular < 10 h, 5.1% del número total de pistas) que sería el resultado de falsas detecciones positivas de la división. Del mismo modo, las pistas mostrando un ciclo largo de la célula, que parcialmente los resultados de las detecciones de falsos negativos división, también son raras (duración del ciclo celular > 25 h, 2,4% del número total de pistas). Manual seguimiento de las trayectorias del ciclo celular también se utilizó para evaluar aún más el seguimiento de la célula con el plugin. Hemos medido en 6693 células una precisión localización de 1,6 μm en los puntos coincidentes, que está dentro de una echada del pixel (1,67 μm).
Otros parámetros pueden ser examinados, tales como la masa seca inicial de la célula (justo después de una división), el peso final en seco (antes una división de célula), así como la tasa de crecimiento promedio durante el ciclo celular. Figura 9 d parcelas las masas seco inicial y final de la célula como una función del tiempo. Muestra que ambas masas seca inicial y final de la célula disminuyen con el tiempo. El valor mediano de la célula inicial seca masa decrece de 223 pg a pg 130 y la celda final seca de 460 pg a pg 220. La relación entre los dos permanece estable a 1.89 ± 0,12 durante el experimento entero (figura 9 d-e). Finalmente, figura 9f se muestra la evolución de la tasa de crecimiento de masa seca de la célula como una función del tiempo sobre las pistas de ciclo celular 10.584 y se encontró que la disminución en la tasa de crecimiento de la célula es una tendencia común de la población de toda la célula en este particular experimento.
Figura 1: microscopía lente gratis. (a) esquema de la configuración de la adquisición de microscopía lente-libre. microscopio (b) imagen del vídeo de lente libre de 6 pozos. Utiliza un sensor de imagen CMOS con una echada del pixel de 1,67 μm y una superficie de proyección de imagen de 6.4 mm x 4,6 mm = 29,4 mm2. La iluminación es proporcionada por un LED RGB multicolor junto con un pequeño agujero a una distancia de aproximadamente 5 cm de la muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: interfaz Trackmate. Experimentan de menús principales del plugin que se muestra con la configuración real utilizada para la célula HeLa. El diámetro estimado blob se estableció en 15 píxeles, se estableció el umbral del detector a 0.25, la distancia máxima de enlace se establece en 15 píxeles, la distancia máxima de cierre de brecha se estableció en 15 píxeles y el número de puntos de tracks se estableció en 3.5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: proceso de reconstrucción holográfica. (a) adquisición de materia prima de células HeLa en cultura mediante microscopía lente libre (campo de visión de 29,4 mm2). (b) detalle de (a). (c) detalle de (b). (d) RGB imagen de fase reconstruido (campo de visión de 29,4 mm2). (e) detalle de (d). (f) detalle de (e). (g) fase imagen obtenida después de la fase de desenvolver para compararse con (f), antes de retirar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: capturas de pantalla de los resultados de seguimiento de la célula realizados usando el plugin de Trackmate Fiji. (a) resultados del algoritmo de detección de células que se basa en un Laplaciano de detector de Gauss (LoG). La imagen muestra todo el campo de visión de la adquisición de lentes gratis en T0 + 16h40min en el cual se detectan 2.451 células. Estos últimos están rodeados con un círculo morado. (b) los resultados del algoritmo de rastreo de celulares. Todas las pistas de la celda se muestran más de 50 marcos (8 horas) con un código de color correspondiente a la velocidad media. (c, d) Detallada imagen de (a) y (b) respectivamente (rectángulo amarillo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: validación de la etapa de detección de células del algoritmo de rastreo celular. (una) imagen recortada de HeLa células en cultivo (663 x 663 μm2) donde la celda seleccionada a mano están marcados con cruces azules y las detecta con el algoritmo de seguimiento de la célula están marcadas con cruces rojas. Esto permite la determinación de las detecciones positivas falsas (círculo rojo) y falsas detecciones negativas (círculo naranja). (b) la tasa de detección true (línea verde), falsos positivos (línea roja) y la detección de falsos negativos (naranja) se trazan en función de la hora del experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: resultados de la segmentación celular. (un) reconstruyó fase imagen de una región de interés de la adquisición de Time-lapse en T0 + 7 h (663 x 663 μm2). (b) el algoritmo inicia la segmentación por umbralización que la imagen de la fase (c) la segmentación se inicia con un procedimiento de siembra, es decir, los píxeles del centro de las células detectadas se establecen en el valor de la pista correspondiente. (d-e) Luego iterativamente un procedimiento de llenado es implementado y que se extiende la siembra inicial a los límites de la celda determinada por el umbral inicial (b). (f) se muestra el resultado del algoritmo de segmentación para una secuencia de tiempo en una región de2 μm de 663 x 663 (igual que en figura 5). La segmentación se muestra como una superficie coloreada overlaid encima de la imagen de la fase de reconstrucción. Tenga en cuenta que la señal libre de lente proviene principalmente de la región nuclear, y las áreas segmentadas caen cerca del núcleo. (g) reconstruyó fase obtenida por microscopía lente libre en fija las células HeLa. Esta es una imagen recortada de todo el campo de visión de 29,4 mm2. imagen de (h) fase de la región se muestra en (g) obtenida por microscopia holográfica digital con el objetivo 5 X (NA 0,12) iluminada con un láser en 647 nm. () trama de la celda seca masa obtenida mediante microscopía lente libre en función de la masa seca, medida por medio de DHM. El diagrama de dispersión compila 302 medidas de las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Análisis de los datos de una adquisición de lente-free Time-lapse de 2,7 días de células HeLa. (a) Total número de células contadas en el campo de visión completo de 29,4 mm2 como función del tiempo. (b) diagrama de dispersión de la celda seca masa en función del tiempo. En cada caja, correspondiente a un cubo de 6 horas, la central marca roja indica que la mediana, y los bordes inferior y superior de la caja indican los percentiles 25 y 75, respectivamente. Los bigotes se extienden a los más extremos puntos de datos no considerados outliers. (c-f) Diagramas de dispersión de la célula segmentada zona (c), el espesor medio de la celda (d), la longitud del eje mayor de la célula (e) y la relación de aspecto de la célula (f) como función del tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Análisis de los datos de una trayectoria de célula de 2,7 días (intervalo de 10 minutos marco). (un) celular segmentación realizada en la adquisición de Time-lapse de una pista de celular dura aproximadamente 66 h. La célula de interés se muestra con un recubrimiento azul. Cada imagen recortada es de 53 x 53 μm2. Las divisiones de célula se muestran con círculos amarillos. (b) parcela de la zona de la célula como una función del tiempo. (c) tiempo de evolución de la célula seca masa calculada a partir de la integral de la fase sobre el área de celulares segmentados según la ecuación (1). espesor de célula (d) diagrama de la media calculada en función del tiempo según la ecuación (2). El grueso de la célula exhibe picos agudos correspondientes a las divisiones de célula (amarillo círculos líneas en (a) y rojo (b-c-d-e)). (e) parcela de la motilidad celular en función del tiempo. (f) segmentación de resultados correspondientes a la última estructura de la pista en T0 + 66h20min cuando la densidad celular es aproximadamente 475 células/mm2. La imagen es 200 x 200 μm2 centrado en la celda de interés. Las manchas blancas (asteriscos rojos) corresponden a restos celulares que aparecen después de un día de cultivo celular. (g) 800 x 800 μm2 había recortada imagen reconstruida de la fase del último fotograma de esta pista de la célula. La célula de interés está rodeada por un círculo amarillo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Análisis de ciclo celular. (a) distribución de la duración del ciclo celular para una observación de 2,7 días de cultivadas HeLa células (N = 10, ciclos celulares 584). La distribución de la duración del ciclo celular está cerca de una gaussiana con una media de 16,5 horas y una desviación estándar relativa de 12,3% (desviación estándar mide el pico gaussiano dividido por la media de la distribución). célula (b) comparación entre el manual y automático de seguimiento para la determinación de la duración del ciclo celular. El seguimiento manual cuenta con 100 trayectorias del ciclo celular (10.148 posiciones de célula). tiempo (c) distribución a partir de las trayectorias del ciclo celular automáticamente detectado. (d) diagrama de la célula inicial medida seco masa (justo después de la división celular, negro puntos) y masa seca celular final (justo antes de la división celular, rojo puntos) como una función del tiempo. En cada caja, correspondiente a un cubo de 6 h, la red central indica la mediana, y los bordes inferior y superior de la caja indican los percentiles 25 y 75, respectivamente. Los bigotes se extienden a los más extremos puntos de datos no considerados outliers. (e) diagrama de dispersión de la célula final seco de masa en función de la masa seca inicial. (f) evolución de la tasa de crecimiento de masa seca de la célula en función de la hora del experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1 archivo suplementario: código 'segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m'. Este código Matlab utiliza el dataset 'trackmate' para realizar la segmentación de la célula de la completa adquisición de Time-lapse de las cuales las fase reconstruido las imágenes se guardan en la carpeta 'folder_out'. Haga clic aquí para descargar este archivo.
2 archivo suplementario: código 'lineage_Version_Jove.m'. Este código utiliza la matriz 'trackmate' procesada con el algoritmo de segmentación de la célula (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m), para extraer las trayectorias del ciclo celular y determinar los diferentes parámetros de interés, por ejemplo., la célula duración del ciclo, la célula inicial seca y seca la celda final. Este código es en dos partes, la primera parte se aborda la detección de las células en división y la segunda parte con el análisis de las trayectorias del ciclo celular. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En este trabajo, mostramos que microscopía lente libre de vídeo puede utilizarse dentro de una incubadora para capturar la cinética de miles de células. Para describir la metodología global nos explicó cómo una adquisición de Time-lapse de 2,7 días de células HeLa en cultura puede ser analizada con algoritmos estándar de seguimiento de la célula. El resultado es un conjunto de datos con 2,2 x 106 células medidas y 10.584 pistas de ciclo celular. Las adquisiciones se realizaron en un cultivo de células Hela con una distancia relativamente grande de célula a célula (célula densidad < 500 células/mm2) y morfología que puede ser aproximada con un disco de la célula. Estas dos características facilitan la aplicación de un análisis automático de la célula de seguimiento que permite reunir un conjunto de datos grande. Otras líneas celulares con menor distancia de célula a célula o con morfologías más complejas sería más difíciles de seguir y conjuntos de datos posterior sería menor.
Creemos que este enfoque es interesante para muchos estudios, por ejemplo estudios de tamaño celular y proliferación celular. Estos últimos son un área importante de investigación en biología fundamental y muchas preguntas siguen sin respuesta como bien discutidos en una revisión por Ginzberg et al. 29. el protocolo propuesto en este trabajo proporciona así un medio para medir métricas importantes necesarios para estudios de proliferación celular, es decir, la duración del ciclo celular, la masa seca de la célula, la célula seca relación entre la masa entre el fin y el comienzo del ciclo y la célula tasa de crecimiento de masa seca. Además el estudio de la proliferación celular, este método será de interés para el estudio de la migración de la célula, ya que puede producir un gran número de pistas, cada uno dura varias horas. El presente Protocolo va más allá del estado del arte14,30 al demostrar por primera vez la adquisición de miles de pistas de la célula durante más de 10 h.
En conclusión, hemos desarrollado una técnica de lente libre fácil de usar que permite rastrear simultáneamente miles de células de etiqueta-libre durante varios días de la cultura.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores no tienen nada que agradecer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
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