Summary
Lente livre de microscopia nos permite monitorar culturas celulares diretamente dentro da incubadora. Aqui descrevemos o protocolo completo usado para adquirir e analisar uma aquisição de 2,7 dia longo de culturas de células de HeLa, levando a um conjunto de dados de 2,2 x 106 medições de morfologia de célula individual e 10584 ciclo celular rastreia.
Abstract
Aqui, demonstramos a lente livre vídeo microscopia nos permite capturar simultaneamente a cinética de milhares de células diretamente dentro da incubadora, e que é possível monitorar e quantificar células únicas ao longo de vários ciclos de célula. Descrevemos o protocolo completo usado para monitorar e quantificar uma cultura de célula HeLa 2,7 dias. Primeiro, aquisição de cultura de células é realizada com um microscópio lente livre de e, em seguida, os dados são analisados seguindo um processo de quatro etapas: comprimento de onda multi reconstrução holográfica, rastreamento de celular, celular segmentação e divisão celular deteção algoritmos. Como resultado, mostramos que é possível reunir um conjunto de dados apresentando mais de 10.000 faixas do ciclo celular e mais de 2 x 106 células morfológica medições.
Introduction
Células de mamíferos cultivadas ao longo de vários ciclos de célula de monitoramento e medição com precisão de pilha tamanho e célula massa seca é uma tarefa desafiadora. Várias técnicas de etiqueta livre ópticas são capazes de realizar esta tarefa1,2: fase de mudança interferometria3, microscopia holográfica digital (DHM)4,5,6, 7, quadriwave lateral corte interferometria8,9 e de10,de tomografia computadorizada quantitativa fase11. Esses métodos têm levado a muitos novos insights sobre a compreensão do ciclo celular de células de mamíferos. No entanto, eles raramente são acoplados com célula automática de algoritmos de controle e sua taxa de transferência permanece limitada, quando a medição da pilha trajetórias massa1 (N < 20 em respectivamente3,4,5 , 6). daí um método óptico romance é necessário medir trajetórias de massa celular com estatísticas grandes (N > 1000).
Neste trabalho, podemos demonstrar a capacidade da lente livre de microscopia imagem simultaneamente milhares de células diretamente dentro da incubadora, e então quantificar métricas de célula única ao longo de milhares de faixas individuais ciclo celular. Microscopia de lente-livre é uma fase quantitativa de imagem técnica que permite a aquisição de imagem da fase de células densamente em um grande campo de visão (tipicamente de várias dezenas de mm2, aqui 29,4 mm2)12,13 de14, ,15. Várias métricas no nível da célula única são determinadas, por exemplo, área de célula, massa seca, célula espessura, comprimento do eixo principal de célula de célula e12,de proporção15, de cada imagem de célula. Então, aplicando um algoritmo de rastreamento de celular, estas características podem ser plotadas para cada célula em função do tempo experimento14,15. Além disso, ao detectar a ocorrência de divisões celulares em faixas a célula, é possível extrair outras informações importantes, tais como a célula inicial secar massa (logo após a divisão celular), a massa seca celular final (antes da divisão celular) e a célula ciclo de duração, ou seja, o tempo entre duas divisões consecutivas15. Todas estas medidas podem ser computadas com muito boas estatísticas (N > 1000) desde que o grande campo de visão normalmente permitiria a análise de 200 a 10.000 células em uma única lente livre aquisição.
Para explicar esta metodologia baseada na lente livre de microscopia, descrevemos o protocolo para monitorar e quantificar uma cultura de célula HeLa 2,7 dias. Análise de dados é um processo de quatro etapas, com base em múltiplos de comprimento de onda reconstrução holográfica, rastreamento de celular, segmentação de célula e algoritmos de divisão celular. Aqui é mostrado que a resolução espacial e a taxa de quadros relativamente rápida (uma aquisição a cada 10 minutos), obtidos com esta configuração de lente livre de microscopia é compatível com algoritmos de controle de célula padrão. A análise completa deste dataset resulta na medição de 10.584 célula faixas sobre ciclos completos de célula.
Para resumir, a lente livre de microscopia é uma ferramenta poderosa para monitorar automaticamente milhares de sem rótulo, não sincronizado e células não modificadas por experiência; cada célula sendo controlada ao longo de vários ciclos de célula. Nossas medições, portanto, fornecem o valor médio dos vários parâmetros de célula, mas mais importante, a variabilidade inter celular sobre uma grande população de células.
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Protocol
1. celular cultura monitoramento aquisição
- Desenvolvem-se células HeLa em DMEM + glutamina (por exemplo, GlutaMAX) suplementado com 10% (v/v) bezerro fetal-inactivados por calor, soro e 1% penicilina e estreptomicina.
- Revestimento de placas de cultura de fundo de vidro 6-poços com fibronectina (25 µ g/mL) por 1h. Então as sementes 2 x 104 células por poço.
- Durante a aquisição, mude o meio em 3 dias.
- Para a aquisição de lapso de tempo, use o vídeo livre de lente microscópio (comercialmente disponível).
Nota: Isto é baseado na técnica de imagem livre de lente computacional, conforme descrito por Ozcan et al 16 que foi modificado para realizar o monitoramento contínuo em uma incubadora a uma temperatura controlada de 37 ° C12,15. Possui um sensor de imagem complementares de óxido metálico semicondutor (CMOS) com uma densidade de pixel de 1,67 µm e uma área de imagem de 6,4 x 4,6 mm2. Iluminação múltipla do comprimento de onda é fornecida por um multichip luz emitindo diodo (LEDs) dispositivo, que proporciona iluminação vermelha, verde e azul. Os comprimentos de onda são centralizados, em 636, 521 e 452 nm respectivamente, com uma largura de banda espectral de 25, 45 e 25 nm respectivamente. Os vermelho-verde-azul (RGB) LEDs estão localizados acima um 150 µm pinhole a uma distância de aproximadamente 5 cm, a partir das células. A potência de luz medida perto o LED é tão baixa quanto 10 µW em cada comprimento de onda e o tempo de iluminação é apenas de um segundo por aquisição. Portanto, sem problemas de foto-toxicidade são esperados quando culturas de células são observadas ao microscópio lente livre de. - Colocar o recipiente de cultura celular colocar em contato com o sensor CMOS (Figura 1). Utilize um recipiente com uma lamela de vidro na parte inferior, o que é importante para a qualidade da lente-livre aquisição. Recipientes de plástico também podem ser usados, mas a lente livre aquisição será degradada devido à pobre qualidade óptica destes recipientes.
- Controle o vídeo livre de lente microscópio com o software de aquisição (comercialmente disponível), que executa tanto a lapso de tempo aquisição e reconstrução holográfica. Os parâmetros que precisam ser digitados pelo usuário na interface do software são a taxa de quadros, a duração do experimento e o tipo de cultura de células, ou seja, aderente nas células ou flutuante.
- Defina os parâmetros de entrada do software aquisição. Defina a taxa de quadro definido para a aquisição de um a cada 10 minutos e defina o tipo de cultura celular de «aderentes».
Nota: Uma taxa de quadros de uma aquisição em 10 minutos é um bom compromisso, pois garante uma célula confiável de rastreamento enquanto o tamanho do conjunto de dados resultante a ser analisado é ainda razoável. A mais rápida taxa de quadros realizável com esta configuração de lente-free microscopia é uma aquisição cada 5 minutos. Aumentando ainda mais o framerate resulta em um aquecimento excessivo do sensor CMOS que pode afetar a viabilidade das células em cultura. - Iniciar a aquisição de lapso de tempo, e o algoritmo de reconstrução holográfica (comercialmente disponível) processará automaticamente a aquisição livre de lente para obter a imagem da fase da cultura de pilha. O algoritmo de reconstrução holográfica é baseado em um comprimento de onda multi fase recuperação algoritmo17 e fornece uma imagem RGB fase reconstruído no intervalo de [-π, + π] para cada célula única ao longo de um grande campo de visão de 29,4 mm2. O princípio da holografia lente livre em linha é iluminar uma amostra fina (z = 0) com uma onda de avião (de amplitude 1 após normalização) e para detectar em um sensor CMOS a imagem de intensidade de difração subsequentes em uma curta distância z = Z, tipicamente de 1 mm após o amostra. Em nossa configuração, a iluminação é sequencialmente mudou-se para 3 comprimentos de onda (λ1= 0.450 µm, λ2= 0.540 µm, λ3= 0.647 µm) para medir três padrões de difração da mesma amostra.
2. análise de dados de cultura de célula
- Para rastreamento de celular, use o algoritmo de Trackmate, um plugin de Fiji de código aberto para o monitoramento automatizado de partículas única18. Pelo primeiro, carregar a aquisição completa lapso de tempo em Fiji (comando de sequência de imagem de carga). Devido ao grande tamanho dos conjuntos de dados, que caracteriza tipicamente 400 quadros RGB de 29,7 Mb, é mais rápido para carregá-los no formato de 8 bits. Em seguida o plugin Trackmate Fiji orienta o usuário através de vários estágios do algoritmo de rastreamento de celular, ou seja um palco de deteção de célula, um palco de rastreador de celular e vários filtros aplicados para as detecções de célula e as faixas computadas. Em cada estágio, os algoritmos de configurar e exibir os resultados imediatamente de modo que, se necessário, um pode facilmente navegar e para trás para ajustar as configurações. Os vários menus da interface do Trackmate são mostrados na Figura 2 com as configurações reais utilizadas para o experimento de células HeLa.
- Defina os parâmetros de entrada do software aquisição como a seguir (ver Figura 2). Defina o diâmetro estimado blob para 15 pixels, o limiar de detector de 0,25, a distância máxima vinculação de 15 pixels, a distância máxima de abertura-fechamento para 15 pixels e o número de pontos nas faixas de 3,5.
Nota: Essas configurações serão obviamente diferente de um experimento para o outro, especialmente o 'blob estimado diâmetro' que corresponde ao tamanho da célula (aqui, dado em pixels de 1,67 µm). A mesma observação aplica-se para a 'distância máxima vinculação' que representam a distância máxima percorrida por uma célula em dois quadros consecutivos (aqui, dado em pixels de 1,67 µm). Seu valor ideal depende na motilidade celular, mas também na densidade celular. - No final do processo de rastreamento de celular, gerar os resultados sob a forma de três arquivos de texto ('Análise' botão, ver Figura 2). O arquivo mais útil, chamado 'Spots nas estatísticas de faixas', consiste em uma tabela listando todos detectadas células com suas posições respectivas (x, y) na aquisição, o número do quadro e seu número da faixa. Com base neste dados, executar a segmentação da célula e detectar divisões celulares usando algoritmos dedicados (ver arquivos de código complementar). Os outros dois arquivos são nomeados 'Links estatísticas faixas' e 'Track estatísticas' e incluir todos os resultados, lidando com as faixas, por exemplo, a faixa durações, número de lacunas detectadas, rastrear o frame inicial, etc.
- Use o algoritmo de segmentação de célula (ver arquivo de código suplementar) para extrair automaticamente várias métricas, descrevendo a morfologia celular da imagem reconstruída fase. Essas métricas são a área de superfície de célula (S), o comprimento do eixo principal de célula (L), o comprimento do eixo menor célula (l) e a relação de aspecto de célula (L/l). A fase recuperada de microscopia livre de lente é proporcional a densidade e a espessura da camada de amostra, conforme discutido anteriormente,15.
- Além das características morfológicas da célula, extrair as medições do (CDM) de massa secas célula quantitativa do reconstruído fase13,19,20
EQ. (1)
onde φ(x,y) é a fase reconstruído turno19, λ o comprimento de onda e α = 1,8 x 10-4 m3/kg índice de refração específico que relaciona a variação do índice de refração para secar massa1, 19. - Avalie a espessura de célula, usando uma estimativa da diferença entre o índice de refração de célula e que os meios de cultura. A relação entre a célula de espessura h(x,y) e a mudança de fase medidos, é dado por20:
EQ. (2.1)
EQ. (2.2)
com Δn(x,y) = ncélula (x,y) - médio de n (x,y), a diferença de índice de refração entre a célula e o meio de cultura. A seguir, assumir um valor constante de Δn = 0,025, que é estimado a partir do índice de refração, medido em núcleos de células HeLa (n = 1.35511) e de meios de cultura de tampão fosfato salino (PBS) (n = 1,33). Embora o valor de espessura da célula é apenas indicativo, como é baseado em uma suposição, suas variações relativas são significativas e podem ser exploradas para detectar células divisórias. - Usar o algoritmo dedicado (ver arquivo de código complementar) para detectar a ocorrência de divisões celulares e, em seguida, extrair faixas de células que estão associadas às divisões celulares detectados, a fim de detectar uma divisão celular, células com uma espessura medida maior do que 8 µm são primeiramente identificados, em seguida, verifique se uma nova célula aparece estreitamente em espaço e tempo. Desta forma, a detecção de divisões celulares baseia-se em dois critérios robustos. Alternativa e mais elaborados métodos para detecção de divisão celular podem ser aplicados a lensfree aquisição de lapso de tempo21,22,23.
EQ. (1)
EQ. (2.1)
EQ. (2.2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para o processo de reconstrução holográfica, o campo de luz é descrito por um campo escalar um (onde 
é o valor complexo de A no avião em distância z da posição de amostra e lateral 
e no comprimento de onda λ). Propagação de luz é modelada pela teoria de Huygens-Fresnel, que fornece um kernel propagador 
. Portanto, a amplitude do campo no plano do detector, umz está relacionada com a amplitude de luz um0 pela seguinte relação:
ou seja
com 
, onde i é o número complexo (eu2=-1)
A medida da intensidade é simplesmente modelada por 
. A finalidade do algoritmo de reconstrução é encontrar um campo de 'bom' A0, relacionado com a amostra observada, qual difração corresponderia a intensidade medida euz. A estratégia é considerar a fase de campo de amplitude para o detector plano φz tão desconhecido do problema e para otimizar um critério multiespectrais variação total do objeto. Mais explicitamente, considerando os campos
ou seja
para qualquer fase campo φz, 
combina perfeitamente com os dados desde 
. Para que o campo subsequente 
é um campo de amplitude possível no plano de amostra, dado a imagem de intensidade observada. Esta é a razão por que um critério sobre A0 é usado para especificar uma solução única entre todas as possibilidades de correspondência de dados. O critério para minimizar foi escolhido como:
onde x e y são as coordenadas para o avião, ou seja, 
. Usar um critério permite selecionar, entre todas as áreas possíveis, um campo de amostra exibindo bordas afiadas na mesma posição para todos os comprimentos de onda, que é fisicamente significativo. Esse método reduz a ocorrência de 'gêmeo-imagens' no campo reconstruído um0. O 'gêmeo-imagem' é um artefato importante que resulta da falta de informação de fase durante o processo de aquisição.
Para o cálculo prático, as integrais são diferenciadas com uma amostragem espacial correspondente para a resolução de detector, os derivados são substituídos pelos operadores de Sobel e circunvoluções pelo propagador de Huygens-Fresnel 
são executadas por ir no espaço de Fourier onde 
tem uma expressão simples: 
. Minimização do ε critério (real) no que diz respeito as variáveis (real) conjunto 
é resolvido usando o método do gradiente conjugado não-linear, que exige que o gradiente de ε para ser calculado para qualquer fase associado com cada pixels do detector para cada comprimento de onda.
Celular/fase de reconstrução desembrulhar
A Figura 3 mostra os resultados da reconstrução de um quadro de um lapso de tempo aquisição de células HeLa holográfico na cultura. Figura 3a mostra o completo campo de visão de uma aquisição cru no canal de azul em uma área de2 29,4 mm. Baseia essa imagem e aqueles adquiridos nos canais de vermelho e verdes, a reconstrução holográfica produz uma imagem da fase RGB das células como mostrado nas figuras 3b e 3C. A imagem reconstruída fase exibe artefatos localmente embrulhado fase correspondente a células que induzem a uma mudança de fase superior + π. Para realizar uma simples fase de desempacotamento, implementamos uma média de heurística, ou seja nós detectar os pixels com o valor 
superior a 0,3 e definir esses pixels para + π. Este método simples baseia-se em uma propriedade das imagens RGB reconstruída fase. Em teoria em cada pixel medimos uma relação 
igual a 
. Mas no caso de celular mitótica, quando ocorre envolvimento de fase, esta relação é já não mantida na imagem reconstruída fase RGB (Figura 3f). O método heurístico acima mencionado aproveita essa propriedade, para que um simples limiarização pode ser usada para detectar os pixels apresentando envolvimento de fase. Os resultados da imagem reconstruída fase antes e depois de desembrulhar é mostrada nas figuras 3f e 3G, respectivamente. Estas imagens de fase sem invólucro são alimentadas então o algoritmo de rastreamento de pilha. Sem esta etapa desembrulhando, o algoritmo de controle de célula falharia detectar células em divisão e de células de grande espessura, que poderia comprometer os resultados finais. A resolução da imagem reconstruída fase foi estimada em aproximadamente 5 µm15 (completo-passo a resolução espacial), que é relativamente grossa. No entanto é possível observar detalhes como lamellipodia e célula citoplasma (Figura 3f e 3G). O mais importante, a imagem obtida por microscopia livre de lente exibe um grande contraste e é isenta de artefatos de halo. Isto facilita a deteção de célula automática e rastreamento de pilha.
Análise de dados de cultura de células
Para extrair o ciclo celular, faixas, a análise dos dados se baseia em uma série de algoritmos diferentes, ou seja o celular rastreamento realizado com o plugin Trackmate Fiji, a detecção de divisões e, finalmente, a extração de célula ciclo faixas, ou seja, o sequência entre duas divisões celulares. A seguir, discutimos a qualidade das saídas destes algoritmos quando comparado a medição manual.
A Figura 4 mostra capturas de tela diferentes dos resultados de rastreamento de celular, os resultados do algoritmo de detecção de célula e os resultados da análise de rastreamento de pilha. A detecção de células na aquisição livre de lente (figuras 4a-4 c) é o primeiro passo do algoritmo de rastreamento de pilha. A fim de validar o algoritmo de detecção de células, nós anotados manualmente uma pequena porção de lapso de tempo livre de lente aquisição (214 quadros de 663 x 663 µm2). Nós manualmente selecionados de um total de 5365 posições de célula e comparados estes resultados com os obtidos pelo plugin Trackmate Fiji. A Figura 5 mostra os resultados em termos de deteção da verdade, falsos positivos e falsos negativos. A sensibilidade resultante é de cerca de 96% e o valor preditivo positivo tão grande quanto a 99,7%. Estes altos valores refletem a boa qualidade das imagens reconstruídas fase obtidos com a configuração de lente livre de microscopia. Após a detecção da célula, um algoritmo de segmentação de célula permite medir — para cada célula — várias métricas diferentes, por exemplo, a área da célula, a célula seca a massa e a espessura da célula. A figura 6a mostra o princípio do algoritmo de segmentação e Figura 6f mostra imagens segmentadas em uma sequência de tempo para uma região de interesse de 663 x 663 µm2 (o mesmo como na Figura 5). O algoritmo inicia a segmentação por limiarização a imagem de fase (ver Figura 6b) e em seguida aplica-se um processo de semeadura (ver Figura 6C). Ou seja, os pixels do centro das células detectados são definidos como o valor da faixa correspondente. As posições de X-Y de células e seu correspondente número de faixa são fornecidas pelo arquivo 'Spots nas estatísticas de faixas' obtido após o rastreamento de pilha. Então, um procedimento iterativo de enchimento é implementado que estende a semente para os limites da célula (figuras 6-c-e), determinada pela limiarização inicial (Figura 6b). Este procedimento de enchimento se baseia em operações básicas em morfologia matemática, por exemplo, dilatação e erosão. O resultado da segmentação, então é possível calcular várias métricas no nível de célula única, ou seja, características morfológicas, como o comprimento da célula, a área da célula e a relação de aspecto de célula, mas também, mais importante, a célula massa seco de acordo com EQ. 1. A fim de avaliar a confiabilidade da lente livre microscopia medição da célula seca massa, comparamos a imagem livre de lente fase reconstruído de células HeLa fixas (Figura 6 g) com a mesma região adquiriu por meio de um digital holográfico microscopia com um objectivo de X 5 (Figura 6 h). Figura 6i mostra a célula seca massa medida por dizer de microscopia livre de lente como uma função da massa seca medida com DHM para 302 segmentado as células HeLa. Há uma boa correlação entre as duas medidas (coeficiente de determinação R2 é 0.86, inclinação = 0,9, deslocamento = pg-17). Da Figura 6i, podemos estimar a precisão da célula seca massa medição obtida por meio de microscopia de lente-livre. A precisão, medida como o erro quadrático entre os dados da lente-livre e o ajuste linear, é cerca de 16 pg.
Durante a compilação de todas as medições de célula única sobre a aquisição completa lapso de tempo, então é possível obter scatterplots de várias métricas em função do tempo, como mostrado na Figura 7. Estes scatterplots fornecem informações sobre a cinética das células cultivadas sobre uma população muito grande. Aumenta o número de células no campo de visão de 2.000 até 15.000 (Figura 7a). Multiplicado pelo número de pontos de tempo, isso leva a um grande conjunto de dados de 2,2 x 106 detectadas células, cada uma delas caracterizada por suas coordenadas e características morfológicas, ou seja, célula massa seca (Figura 7b), área da célula (Figura 7C) , celular de espessura média (Figura 7 d), comprimento do eixo maior (Figura 7e) e relação de aspecto (Figura 7f).
Importante, a combinação de rastreamento de pilha e algoritmos de segmentação celular nos permite medir a cinética no nível da célula única. Como exemplo, a Figura 8 mostra a análise de uma célula, controlar a duração de cerca de 66 horas e exibindo quatro divisões celulares no T0 + 4,1 h, T0 + 20,5 h, T0 + 36,7 h e T0 + 53,3 h. figura 8a mostra os resultados do algoritmo de segmentação automática de celular que permite nos delinear eficientemente a superfície da célula. Usando a segmentação da célula, então é possível calcular várias métricas em função do tempo, por exemplo, a área de superfície de célula (Figura 8b), a célula seca massa (Figura 8C), a espessura média da célula (Figura 8 d) e a célula motilidade (Figura 8e). Partir destes gráficos, um pode medir claramente a cinética dessas métricas celulares entre divisões celulares. Em particular pode-se observar o aumento da área celular e massa seca durante um ciclo celular. Além disso, usando a detecção automática de divisões celulares, três faixas diferentes de ciclo celular podem ser extraídas desta pista e a duração do ciclo celular, ou seja, o período entre as duas divisões, pode ser estimado. Na pista única célula mostrada na Figura 8, medimos três durações do ciclo celular, nomeadamente h 16,4, 16,2 h e h. 16,7 compilar todo o ciclo celular faixas a partir da análise de um 2,7 dias resultados de lapso de tempo de aquisição na detecção de 16725 divisões celulares e a descrição de 10.584 faixas do ciclo celular. Então é possível medir a média e a variabilidade da duração ciclo celular com som estatísticas. Nós achamos que a distribuição da duração do ciclo celular é perto de distribuição gaussiana (Figura 9a), com uma média de 16,5 h e um desvio-padrão relativo de 12,4% (desvio padrão medido no pico dividido pela média da distribuição gaussiano ). A média de tempo de 16,5 h de duplicação é consistente com os ciclo celular comprimentos medidos manualmente na pista apresentada na Figura 8. Encontra-se no entanto no menor intervalo de valores publicados para HeLa tempo de duplicação da qual são geralmente entre 20 e 30 h24,25,26,27. No entanto, na referência28, um curto tempo duplicação de 16,2 ± 1,7 h também é mencionado. Fim de validar as nossas medições de comprimentos do ciclo celular e confirmar a confiabilidade da nossa técnica de microscopia livre de lente, efetuamos um controle manual de 100 faixas do ciclo celular (10.148 posições da célula). Na célula, ciclo faixas obtidas manualmente (N = 100) o comprimento medido ciclo celular é 16.7±1.9 h (N = 100, Figura 9b). Isto é muito próximo a medição de 16.5±2.1 h (N = 10.584) obtidos com a célula automática, rastreamento, demonstrando a validade da análise global. Quando comparando o controle manual do ciclo celular trajetórias para aquele determinado automaticamente, verificou-se que 67% das faixas ciclo celular foram detectadas com êxito e que o ciclo de comprimentos medidos automaticamente são bem correlacionados com os medidos manualmente (Figura 9b). A eficiência de deteção das trajectórias de ciclo celular foi medida nas primeiras horas 32 do experimento, com uma densidade abaixo de 150 células/mm2. Esta taxa de deteção obviamente diminui com o tempo, como a célula a densidade aumenta até ~ 500 células/mm2. O número de faixas detectado ciclo celular atinge um platô em T0 + 32H (Figura 9c) enquanto o número de células aumenta por um fator de três entre T0 e T0 + 32h, 72 h (Figura 7a). Considerando a taxa de falsas positivas e negativas detecções, Figura 9b apresenta 5 outliers pontos: 4 delas são devido à detecção de falso negativa (comprimento do ciclo > 25 h) e 1 para uma detecção de falsa positiva (comprimento do ciclo < 10 h). Para obter este resultado, nós usamos um limiar de alto espessura (8 µm) no algoritmo de detecção de divisão celular, a fim de favorecer uma baixa taxa de falsos positivos. Além disso, as faixas apresentando inconsistência tem sido filtradas, ou seja, ciclo celular qual duração é inferior a 6 h e faixas com uma trajetória de massa seca que não aumenta linearmente em função do tempo. Eles são apenas 3% do número total de faixas do ciclo celular. Como resultado, a distribuição de comprimento de ciclo celular obtido automaticamente é bem aproximada por um Gaussian (Figura 9a), com um número baixo de faixas curtas (< 10 h, 5,1% do número total de faixas de comprimento de ciclo celular) que resultaria de false detecções de divisão positiva. Da mesma forma, faixas exibindo um longo ciclo celular, que seria parcialmente resultados de detecções falsas divisão negativa, também são raras (comprimento do ciclo celular > 25 h, 2,4% do número total de faixas). Controle manual das trajectórias de ciclo celular também foi usado para avaliar o rastreamento de pilha realizado com o plugin. Medimos em 6693 células uma precisão de localização global de 1,6 µm em pontos correspondentes, que fica a um passo do pixel (1,67 µm).
Outros parâmetros podem ser examinados, tais como a massa seca inicial celular (só depois de uma divisão), a massa seca final (antes de uma divisão celular), bem como a taxa média de crescimento durante o ciclo celular. Figura 9 d plota as massas secas de célula inicial e final em função do tempo. Isso mostra que as duas massas secas célula inicial e final diminuem com o tempo. O valor mediano da célula inicial seco massa diminui de pg 223 até 130 pg e a célula final massa de 460 pg até 220 pg seco. A relação entre os dois permanece estável a 1,89 ± 0,12 durante todo o experimento (Figura 9 d-e). Finalmente, Figura 9f mostra a evolução da taxa de crescimento de massa seca de células em função do tempo sobre as 10.584 faixas do ciclo celular e descobrimos que a diminuição da taxa de crescimento celular é uma tendência comum para a população de toda a célula nesta experiência particular.
Figura 1: microscopia lente livre. (a) esquema da instalação do aquisição de microscopia livre de lente. (b), imagens do vídeo livre de lente 6-poços de microscópio. Ele usa um sensor de imagem CMOS com uma densidade de pixel de 1,67 µm e uma área de imagem de 6,4 mm x 4,6 mm = 29,4 mm2. Iluminação é fornecida por um LEDs RGB multi-coloridas juntamente com uma pinhole colocado a uma distância de aproximadamente 5 cm da amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: interface de Trackmate. Menus principais do plugin mostrada com as configurações reais usadas para a célula HeLa experimentam. O diâmetro estimado blob foi definido como de 15 pixels, o limiar do detector foi definido como 0,25, a distância máxima vinculação foi definida como de 15 pixels, a distância máxima de abertura-fechamento foi definida como de 15 pixels e o número de pontos em trilhas foi definido como 3.5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: processo de reconstrução holográfica. (um) Raw aquisição de células HeLa em cultura por meio de microscopia de lente-livre (completo campo de visão de 29,4 mm2). (b) detalhe do (a). (c) detalhe de (b). (d) RGB reconstruída a imagem da fase (completo campo de visão de 29,4 mm2). (e) detalhe de (d). (f) detalhe de (e). imagem da fase (g) obtidos após a fase de desembrulhar para ser comparado com (f), antes de retirar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: tela captura os resultados de rastreamento de celular realizada utilizando o plugin Trackmate Fiji. (um) resultados do algoritmo de detecção de celular que é baseado em um Laplaciano de detector Gaussian (LoG). A imagem mostra o completo campo de visão da lente-livre aquisição no T0 + 16h40min na qual 2.451 células são detectadas. O último é cercado com um círculo roxo. (b) os resultados do algoritmo de rastreamento de pilha. Todas as faixas de célula são mostradas mais de 50 quadros (~ 8 horas) com um código de cor correspondente à velocidade mediana. (c, d) Detalhada a imagem do (a) e (b) respectivamente (retângulo amarelo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: validação da fase de deteção de célula do algoritmo de rastreamento de celular. (uma) imagem cortadas de HeLa células em cultura (663 x 663 µm2) onde a célula selecionada à mão são marcadas com cruzes azuis e aquelas detectadas com o algoritmo de controle de célula são marcadas com cruzes vermelhas. Isto permite a determinação da detecção de falsa positivos (círculo vermelho) e falsas detecções negativas (círculo laranja). (b) a taxa da deteção verdadeira (linha verde), falsa positivo (linha vermelha) e deteção de falso negativo (laranja) são plotadas em função do tempo de experiência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: resultados da segmentação celular. (uma) imagem da fase Haten de uma região de interesse da aquisição lapso de tempo em T0 + 7 h (663 x 663 µm.2). (b) o algoritmo inicia a segmentação por limiarização que a imagem da fase (c), a segmentação começa com um processo de semeadura, ou seja, os pixels do centro das células detectados são definidos como o valor da faixa correspondente. (d-e) Em seguida e iterativamente um procedimento de enchimento é implementado que estende a semeadura inicial para os limites da célula determinada pela limiarização inicial (b). (f) o resultado do algoritmo de segmentação é mostrado para uma sequência de tempo em uma região de2 µm 663 x 663 (mesmo como na Figura 5). A segmentação é mostrada como uma superfície colorida sobreposta em cima da imagem reconstruída fase. Note que o sinal livre de lente é principalmente proveniente da região nuclear, e as áreas segmentadas cair perto do núcleo. (g), Haten fase obtida por microscopia livre de lente em fixa as células HeLa. Esta é uma imagem recortada de todo campo de visão de 29,4 mm2. imagem do (h), fase da região mostrada na (g) obtidas por microscopia holográfica digital com um objectivo de X 5 (NA 0,12) iluminada com um laser em 647 nm. (eu) enredo da célula seca massa obtido por meio de microscopia de lente-livre como uma função da massa seca medida por meio de DHM. O gráfico de dispersão compila 302 medições de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: análise de dados de uma aquisição de lapso de tempo livre de lente 2,7-dia das células HeLa. (um) Total número de células contadas em todo campo de visão de 29,4 mm2 como uma função do tempo. (b) gráfico de dispersão da célula seca massa em função do tempo. Em cada caixa, correspondente a uma caixa de 6 horas, a marca vermelha central indica a mediana, e as bordas inferior e superior da caixa indicam os percentis 25 e 75, respectivamente. Os bigodes estendem-se aos pontos mais extremos de dados não considerados outliers. (c-f) Scatterplots da célula segmentado de área (c), a espessura média da célula (d), o comprimento do eixo principal de célula (e) e a relação de aspecto de célula (f) em função do tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: análise de dados de uma trajetória de célula de 2,7 dias (intervalo de quadro de 10 min). (uma) célula segmentação realizada na aquisição de uma faixa de célula durando cerca de 66 h lapso de tempo. A célula de interesse é mostrada com uma sobreposição de azul. Cada imagem recortada é 53 x 53 µm2. As divisões celulares são mostrados com círculos amarelos. (b) parcela da área de célula em função do tempo. (c) evolução temporal da célula seca massa calculada a partir da integral da fase sobre a área de célula segmentada de acordo com a EQ. (1). espessura de célula (d), enredo da média calculada em função do tempo de acordo com a EQ. (2). A espessura da célula exibe afiados picos correspondentes a divisões celulares (amarelo círculos linhas em (a) e vermelhas na alínea b-c-d-e). (e) parcela da motilidade celular em função do tempo. (f) segmentação resultados correspondente para o último quadro da faixa no T0 + 66h20min quando a densidade celular é de cerca de 475 células/mm2. A imagem é de 200 x 200 µm2 centrado na célula de interesse. As manchas brancas (asteriscos vermelhos) correspondem aos restos de células que aparecem depois de um dia de cultura de células. (g) 800 x 800 µm2 cortada imagem reconstruída fase do último quadro desta faixa de célula. A célula de interesse é cercada por um círculo amarelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: análise de ciclo celular. (a) distribuição da duração do ciclo celular de uma observação de 2,7-dia de culto HeLa células (N = 10, 584 célula ciclos). A distribuição da duração do ciclo celular está perto de uma gaussiana com média de 16,5 horas e um desvio-padrão relativo de 12,3% (desvio padrão medido no pico dividido pela média da distribuição gaussiano). (b) comparação entre o manual e automático célula de rastreamento para a determinação do comprimento do ciclo celular. O controle manual apresenta 100 trajetórias do ciclo celular (10.148 posições da célula). (c) distribuição do ponto de partida a tempo das trajectórias automaticamente detectado ciclo celular. (d), enredo da célula inicial medido seco massa (logo após a divisão celular, preto pontos) e célula final massa seca (antes pontos de divisão celular, vermelho) em função do tempo. Em cada caixa, correspondente a uma caixa de 6 h, a marca vermelha central indica a mediana, e as bordas inferior e superior da caixa indicam os percentis 25 e 75, respectivamente. Os bigodes estendem-se aos pontos mais extremos de dados não considerados outliers. (e) gráfico de dispersão da célula final seco massa em função da massa seca inicial. (f) a evolução da taxa de crescimento de massa seca de célula em função do tempo de experiência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: código 'segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m'. Esse código Matlab usa o conjunto de dados 'trackmate' para executar a segmentação da célula da aquisição completa lapso de tempo de que as imagens reconstruídas fase são salvos na pasta 'folder_out'. Clique aqui para baixar este arquivo.
2 de arquivo suplementar: código 'lineage_Version_Jove.m'. Esse código usa a matriz 'trackmate' processado com o algoritmo de segmentação de célula (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m), para extrair as trajetórias do ciclo celular e determinar os diferentes parâmetros de interesse, por exemplo., a célula duração do ciclo, a célula inicial massa seco e a célula final massa seco. Esse código é em duas partes, a primeira parte lida com a detecção de células a divisória e a segunda parte com a análise das trajectórias de ciclo celular. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Neste trabalho, mostramos que essa lente livre de microscopia pode ser usada dentro de uma incubadora para capturar a cinética de milhares de células. A fim de descrever a metodologia global, que nós explicamos como uma aquisição de lapso de tempo dia 2,7 de células HeLa em cultura pode ser analisada com algoritmos de controle de célula padrão. O resultado é um conjunto de dados com 2,2 x 106 medidas de célula e 10.584 faixas do ciclo celular. As aquisições foram realizadas sobre uma cultura de células Hela com uma distância relativamente grande de célula para célula (célula densidade < 500 células/mm2) e morfologia que pode ser aproximada com um disco de células. Estas duas características facilitam a aplicação de uma análise automática do rastreamento de pilha que torna possível reunir um grande conjunto de dados. Outras linhas de células com menor distância de célula para célula ou com morfologias mais complexas seria mais difícil de rastrear e conjuntos de dados subsequentes seria menores.
Acreditamos que esta abordagem é interessante para muitos estudos, por exemplo para estudos de tamanho de célula e proliferação celular. Estes últimos são uma importante área de pesquisa em biologia fundamental e muitas perguntas continuam sem resposta tão bem discutido em uma revisão por Ginzberg et al 29. o protocolo proposto neste trabalho, portanto, fornece um meio para medir métricas importantes necessárias para estudos de proliferação celular, ou seja, a duração do ciclo celular, a massa seca de células, a relação de massa seca celular entre o fim e o início do ciclo e a célula taxa de crescimento de massa seca. Além do estudo da proliferação celular, esse método será de interesse para o estudo da migração celular, já que pode produzir um grande número de faixas, cada uma dura várias horas. O presente protocolo ultrapassa o estado da arte de14,30 , demonstrando, pela primeira vez, a aquisição de milhares de faixas de células durante mais de 10 h.
Em conclusão, temos desenvolvido uma técnica livre de lente fácil de usar que permite controlar simultaneamente milhares de células rótulo livre ao longo de vários dias de cultura.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores não têm nada de reconhecer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
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