Lins-gratis Video mikroskopi för dynamiskt och kvantitativ analys av fastsittande cellkultur
Summary
Lins-gratis video mikroskopi gör det möjligt för oss att övervaka cellkulturer direkt i inkubatorn. Här beskriver vi hela protokollet som används för att förvärva och analysera en 2.7 dagen lång förvärv av odlade HeLa celler, vilket leder till en datamängd 2,2 x 106 mätningar av enskilda cellmorfologi och 10584 cellcykeln spår.
Abstract
Här visar vi att linsen-gratis video mikroskopi gör det möjligt för oss att samtidigt fånga kineticsen av tusentals celler direkt inuti inkubatorn och att det är möjligt att övervaka och kvantifiera enstaka celler längs flera cell cykler. Vi beskriver hela protokollet som används för att övervaka och kvantifiera en HeLa cellkultur för 2,7 dagar. Först, cell kultur förvärv sker med lins-gratis video Mikroskop, och sedan data analyseras efter en process i fyra steg: flera våglängder holografisk återuppbyggnad, cell-tracking, cell segmentering och celldelning upptäckt algoritmer. Därför visar vi att det är möjligt att samla en datamängd med mer än 10.000 cellcykeln spår och mer än 2 x 106 cell morfologiska mätningar.
Introduction
Övervakning odlade däggdjursceller under flera cell cykler och mäta exakt Cellstorlek och cell torrvikt är en utmanande uppgift. Flera etikett-fria optiska tekniker kan utföra denna uppgift1,2: fasskiftande interferometri3, digital holografisk mikroskopi (DHM)4,5,6, 7, quadriwave laterala klippning interferometri8,9 och kvantitativa fas tomografi10,11. Dessa metoder har lett till många nya insikter i förståelsen av cellcykeln i däggdjursceller. Men de är sällan sammankopplade med automatisk cell tracking algoritmer och deras genomströmning förblir begränsad när man mäter cell massa banor1 (N < 20 respektive3,4,5 , 6). därför en ny optisk metod behövs för att mäta cell massa banor med stora statistik (N > 1000).
I detta papper visar vi kapaciteten hos lins-gratis video mikroskopi samtidigt bild tusentals celler direkt inuti inkubatorn och sedan kvantifiera enda cell mätvärden längs tusentals enskilda cellcykeln spår. Lins-fri mikroskopi är en kvantitativ fas bildteknik som gör förvärvet av fas bilden av tätt packade celler över ett mycket stort synfält (vanligtvis flera tiotals mm2, här 29,4 mm2)12,13 ,14,15. Flera mätvärden på enstaka cellnivå bestäms, t.ex., cell område, cell torrvikt, cell tjocklek, cell huvudaxeln längd och cell bildförhållande12,15, från varje bild. Sedan, genom att tillämpa en cell-spårning algoritm, dessa funktioner kan ritas för varje enskild cell som en funktion av de experiment tid14,15. Dessutom, genom att upptäcka förekomsten av celldelningar i cell spåren, är det möjligt att extrahera viktig information såsom den initiala cellen torr massa (strax efter celldelning), sista cell torrvikt (strax före celldelning) och cellen cykel längd, dvs, tiden mellan två på varandra följande divisioner15. Alla dessa mätningar kan beräknas med mycket bra statistik (N > 1000) eftersom det stora synfältet skulle vanligtvis möjliggör analys av 200 till 10.000 celler i ett enda objektiv-gratis förvärv.
För att förklara denna metod baserat på objektiv-gratis video mikroskopi, beskriver vi protokollet för att övervaka och kvantifiera en HeLa cellkultur för 2,7 dagar. Dataanalys är en process i fyra steg baserat på flera våglängder holografisk återuppbyggnad, cell-tracking, cell segmentering och celldelning algoritmer. Här är det visat att den rumsliga upplösningen och den relativt snabb bildhastighet (ett förvärv var 10 minut) erhålls med denna lins-gratis video mikroskopi setup är kompatibel med standard cell-tracking algoritmer. Den fullständiga analysen av denna dataset resulterar i mätningen av 10,584 cell spår över komplett cell cykler.
För att sammanfatta, är lins-gratis video mikroskopi ett kraftfullt verktyg automatiskt övervaka tusentals namnlösa, osynkroniserad och omodifierade celler per experiment; varje cell spåras över flera cell cykler. Våra mätningar ger därmed medelvärdet för flera cell parametrar, men ännu viktigare, mellan cell variationer över en stor population av celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta papper visar vi att linsen-gratis video mikroskopi kan användas inuti en inkubator för att fånga kineticsen av tusentals celler. För att beskriva den övergripande metoden förklarade vi hur en 2.7 dag time-lapse förvärv av HeLa celler i kultur kan analyseras med standard cell-tracking algoritmer. Resultatet är en datamängd med 2,2 x 106 cell mätningar och 10,584 cellcykeln spår. Förvärven utfördes på en kultur av Hela celler med ett relativt stort avstånd cell-till-cell (cell täthet < …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna har ingenting att erkänna.
Materials
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
References
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).
- Reed, J., et al. Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry. Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).
- Girshovitz, P., Shaked, N. T. Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization. Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).
- Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy. J Biomed Opt. 15 (3), (2010).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).
- Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy. J Biomed Opt. 17 (7), (2012).
- Aknoun, S., et al. Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).
- Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
- Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Kesavan, S. V., et al. High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy. Sci Rep. 4, 1-11 (2014).
- Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM). Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy. Sci Rep. 4, 4717 (2014).
- Allier, C., et al. Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy. Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).
- Su, T. -. W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
- Delacroix, R., et al. Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis. Sci Rep. 7, 39893 (2017).
- Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2016).
- Popescu, G. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
- Liu, P. Y., et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future. Lab Chip. 16, 634-644 (2016).
- Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters. PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).
- Al-Kofahi, O., et al. Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells. Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).
- Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells. J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).
- Zocchi, E., et al. Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells. J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).
- Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).
- Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F. Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).
- Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity. J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).
- Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075 (2015).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
