Linse-gratis video mikroskopi gør det muligt for os at overvåge cellekulturer direkte inde i rugemaskinen. Her beskriver vi de fulde protokol, der bruges til at erhverve og analysere en 2,7 dagen lang erhvervelse af kulturperler HeLa celler, fører til et datasæt på 2.2 x 106 målinger af individuelle celle morfologi og 10584 cellecyklus spor.
Her, vi viser, at linsen-gratis video mikroskopi gør det muligt for os at samtidig indfange kinetik af tusindvis af celler direkte inde i rugemaskinen, og at det er muligt at overvåge og kvantificere enkelt celler langs flere celle cyklusser. Vi beskriver den fulde protokol, der bruges til at overvåge og kvantificere en HeLa cellekultur 2,7 dage. Første celle kultur erhvervelse er udført med en linse-gratis video mikroskop, og derefter dataene analyseres efter en fire-trins proces: multi bølgelængde holografisk genopbygning, celle-inddeling, celle segmentering og celledeling afsløring algoritmer. Som et resultat, viser vi, at det er muligt at samle en datasæt med mere end 10.000 cellecyklus spor og mere end 2 x 106 celle morfologiske målinger.
Overvågning kulturperler pattedyrceller hele flere celle cyklusser og måle præcist Cellestørrelse og celle tør masse er en udfordrende opgave. Flere etiket-frie optiske teknikker er i stand til at udføre denne opgave1,2: fase-shifting interferometri3, digitale holografiske mikroskopi (DHM)4,5,6, 7, quadriwave lateral klipning interferometri8,9 og kvantitative fase tomografi10,11. Disse metoder har ført til mange ny indsigt i forståelsen af cellecyklus i pattedyrsceller. Men de er sjældent kombineret med automatisk celle tracking algoritmer og deres gennemløb er stadig begrænset, når måling celle masse baner1 (N < 20 i henholdsvis3,4,5 , 6). derfor en roman optisk metode er nødvendige for at måle celle masse baner med store statistik (N > 1000).
I dette papir vise vi evne til linse-gratis video mikroskopi til samtidigt billede tusindvis af celler direkte inde i rugemaskinen, og derefter kvantificere enkelt celle metrics langs tusindvis af individuelle cellecyklus spor. Linse-gratis mikroskopi er en kvantitativ fase imaging teknik, som giver mulighed for erhvervelse af fase billede af tætpakkede celler over et meget stort synsfelt (typisk flere snese mm2, her 29.4 mm2)12,13 ,14,15. Flere målinger på det enkelte celle niveau bestemmes, fxcelle område, celle tør masse, celle tykkelse, celle største akse længde og celle skærmformat12,15, fra hvert billede. Derefter, ved at anvende en celle-tracking algoritme, disse funktioner kan afbildes for hver enkelt celle som funktion af eksperiment tid14,15. Derudover ved at registrere forekomsten af celledelinger i celle spor, er det muligt at udvinde andre vigtige oplysninger, som den oprindelige celle tør masse (lige efter celledeling), den endelige tør cellemasse (lige før celledeling) og cellen cyklus varighed, dvs., tiden mellem to på hinanden følgende divisioner15. Alle disse målinger kan beregnes med meget god statistik (N > 1000) da den store synsfelt vil typisk give analyse af 200 til 10.000 celler i en enkelt linse-fri erhvervelse.
For at forklare denne metode baseret på linse-gratis video mikroskopi, beskriver vi protokol for at overvåge og kvantificere en HeLa cellekultur 2,7 dage. Dataanalyse er en fire-trins proces baseret på flere bølgelængde holografisk genopbygning, celle-inddeling, celle segmentering og celledeling algoritmer. Her er det vist at den rumlige opløsning og relativt hurtig framerate (en erhvervelse hvert 10 minut) opnået med denne linse-gratis video mikroskopi opsætning er kompatibel med standard algoritmer, celle-tracking. Den fulde analyse af dette datasæt resulterer i måling af 10,584 celle spor over komplet celle cyklusser.
For at opsummere, er linse-gratis video mikroskopi et kraftfuldt værktøj til automatisk overvåge tusindvis af umærkede, ikke-synkroniserede og umodificerede celler pr. eksperiment; hver celle spores over flere celle cyklusser. Vores målinger giver således gennemsnitsværdien af adskillige celle parametre, men endnu vigtigere, den inter celle variation over en stor population af celler.
I dette papir viser vi, at linsen-gratis video mikroskopi kan bruges inde i en inkubator til at fange kinetik af tusindvis af celler. For at beskrive den overordnede metode forklarede vi, hvordan en 2,7 dag time-lapse erhvervelse af HeLa celler i kultur kan analyseres med standard algoritmer, celle-tracking. Resultatet er et datasæt byder 2.2 x 106 celle målinger og 10,584 celle cykelstier. Opkøb blev udført på en kultur af Hela celler med en relativt stor afstand, celle-til-celle (celle tæthed < 500 cel…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne har intet at anerkende.
Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
Horus acquisition software | Iprasense | ||
6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
penicillin and streptomycin | Gibco | ||
Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
Matlab, image processing toolbox | Mathworks |