Objektiv-kostenlose Videomikroskopie für die Dynamik und Quantitative Analyse der adhärente Zellkultur
Summary
Objektiv-freie Videomikroskopie ermöglicht es uns, Zellkulturen direkt in die Brutmaschine zu überwachen. Hier beschreiben wir die vollständige Protokoll zum erwerben und analysieren eine 2,7 Tage lang Übernahme von kultivierten HeLa-Zellen, was zu einem Dataset von 2,2 x 106 Messungen der einzelnen Zellmorphologie und 10584 Zellzyklus tracks.
Abstract
Hier zeigen wir, dass Objektiv-freie Video Mikroskopie ermöglicht es, gleichzeitig die Kinetik von Tausenden von Zellen direkt in die Brutmaschine zu erfassen und es ist möglich, zu überwachen und Einzelzellen entlang mehrere Zelle Zyklen zu quantifizieren. Wir beschreiben das vollständige Protokoll zur Überwachung und Quantifizierung einer HeLa Zellkultur für 2,7 Tage. Erstens Zelle Kultur Erwerb erfolgt mit einem Objektiv-freie video Mikroskop, und dann die Daten analysiert, nach einem vier-Stufen-Prozess: Multi-Wellenlänge holographischen Rekonstruktion, Handy-Tracking, Zelle Segmentierung und Zellteilung-Erkennung Algorithmen. Dadurch zeigen wir, dass es möglich ist, sammeln Sie ein Dataset mit mehr als 10.000 Zellzyklus-Tracks und mehr als 2 x 106 Zelle morphologischen Messungen.
Introduction
Kultivierte Säugerzellen in mehrere Zelle Zyklen Überwachung und Messung genau Zelle Größe und Zelle Trockenmasse ist eine anspruchsvolle Aufgabe. Verschiedene optische markierungsfreie Techniken sind in der Lage, diese Aufgabe1,2: Phasenverschiebung Interferometrie3, digitaler holographischer Mikroskopie (DHM)4,5,6, 7, Quadriwave laterale shearing Interferometrie8,9 und quantitativen Phase Tomographie10,11. Diese Methoden führten zu viele neue Einblicke in das Verständnis des Zellzyklus von Säugerzellen. Aber sie sind selten gepaart mit Automatikzelle tracking-Algorithmen und deren Durchsatz begrenzt, bleibt bei der Messung von Zelle Masse Bahnen1 (N < 20 bzw.3,4,5 , 6). daher eine neuartige optische Methode erforderlich ist, um die Zelle Masse Trajektorien mit großen Statistiken messen (N > 1000).
In diesem Beitrag zeigen wir die Fähigkeit der Linse-freie Videomikroskopie, gleichzeitig Tausende von Zellen direkt in die Brutmaschine Bild, und dann einzelne Zelle Metriken an Tausende von einzelnen Zelle Radwege zu quantifizieren. Objektiv-freie Mikroskopie ist eine quantitative Phase bildgebende Technik, die Phase Bildaufnahme von dicht gepackten Zellen über ein sehr großes Sehfeld ermöglicht (in der Regel mehrere zehntausend mm2, hier 29,4 mm2)12,13 ,14,15. Werden mehrere Metriken auf der Ebene der einzelnen Zelle bestimmt, z.B.Handy-Bereich, Handy-Trockenmasse, Zelle Dicke, Zelle Hauptachse Länge und Zell-Seitenverhältnis12,15, aus jedem Bild. Dann können diese Funktionen durch die Anwendung eines Handy-Tracking-Algorithmus, für jede einzelne Zelle in Abhängigkeit von dem Experiment Mal14,15geplottet werden. Durch das Auftreten von Zellteilungen in der Zelle Spuren erkennen, ist es darüber hinaus möglich, weitere wichtige Informationen zu extrahieren, wie z. B. die erste Zelle trockene Masse (kurz nach der Zellteilung), die letzte Zelle Trockenmasse (kurz vor der Zellteilung) und die Zelle Dauer, d. h., die Zeit zwischen zwei aufeinander folgenden Divisionen15-Zyklus. All diese Messungen mit sehr gute Statistiken berechnet werden können (N > 1000) da das große Sichtfeld in der Regel die Analyse von 200 bis 10.000 Zellen in eine einzelne Linse-freie Erwerb ermöglichen würde.
Um diese Methode basiert auf Objektiv-freie Videomikroskopie erklären, beschreiben wir das Protokoll zur Überwachung und zur Quantifizierung einer HeLa Zellkultur für 2,7 Tage. Die Datenanalyse ist ein vier-Stufen-Prozess basierend auf Multi-Wellenlänge holographischen Rekonstruktion, Handy-Tracking, Zelle Segmentierung und Zellteilung Algorithmen. Hier wird gezeigt, dass die räumliche Auflösung und die relativ schnelle Bildrate (ein Erwerb alle 10 Minuten) erhalten mit diesem Objektiv-freie Videomikroskopie Setup kompatibel mit standard-Handy-Tracking-Algorithmen. Die vollständige Analyse dieses Datensatzes führt die Messung der 10.584 Zelle Tracks über vollständige Zelle Zyklen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, ist Objektiv-free video-Mikroskopie ein leistungsfähiges Werkzeug automatisch Tausende von unbeschrifteten, unsynchronisiert und unveränderten Zellen pro Experiment zu überwachen; Jede Zelle, die über mehrere Zyklen der Zelle verfolgt. Unsere Messungen liefern somit den Mittelwert aus mehreren Zellen Parametern, aber noch wichtiger ist, die Inter Zelle Variabilität über eine große Population von Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Beitrag zeigen wir, dass dieses Objektiv-freie Videomikroskopie in einer Brutmaschine verwendet werden kann, um die Kinetik von Tausenden von Zellen zu erfassen. Um zu beschreiben, der Gesamtmethodik haben wir erklärt, wie eine 2,7 Tage Zeitraffer Übernahme von HeLa-Zellen in Kultur mit standard Handy-Tracking-Algorithmen analysiert werden kann. Das Ergebnis ist ein Dataset mit 2,2 x 106 Zelle Messungen und 10.584 Zelle Radwege. Die Akquisitionen wurden durchgeführt, auf eine Kultur der Hela-Zelle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren haben nichts zu erkennen.
Materials
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
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