लेंस-अनुयाई सेल संस्कृति के गतिशील और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए नि: शुल्क वीडियो माइक्रोस्कोपी
Summary
लेंस मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी हमें सीधे मशीन के अंदर सेल संस्कृतियों पर नजर रखने के लिए सक्षम बनाता है । यहाँ हम पूर्ण प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए प्राप्त करते हैं और एक २.७ दिन लंबे समय के अधिग्रहण का विश्लेषण करने के लिए प्रसंस्कृत हेला कोशिकाओं, एक डेटासेट के लिए अग्रणी २.२ x 106 माप के व्यक्तिगत कक्ष आकृति विज्ञान और १०५८४ सेल चक्र पटरियों.
Abstract
यहां, हम प्रदर्शन है कि लेंस मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी हमें सक्षम बनाता है एक साथ सीधे मशीन के अंदर की कोशिकाओं के हजारों के कैनेटीक्स पर कब्जा करने और यह है कि निगरानी और कई कोशिका चक्र के साथ एक कोशिकाओं को यों तो संभव है । हम पूरी निगरानी और २.७ दिनों के लिए एक हेला सेल संस्कृति यों तो इस्तेमाल प्रोटोकॉल का वर्णन । पहले, सेल संस्कृति अधिग्रहण एक लेंस मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोप के साथ प्रदर्शन किया है, और फिर डेटा एक चार कदम प्रक्रिया के बाद विश्लेषण है: बहु तरंग दैर्ध्य होलोग्राम पुनर्निर्माण, सेल ट्रैकिंग, सेल विभाजन और सेल डिवीजन का पता लगाने एल्गोरिदम. परिणामस्वरूप, हम बताते है कि यह एक १०,००० से अधिक सेल साइकिल पटरियों और अधिक से अधिक 2 x 106 सेल रूपात्मक माप की विशेषता डेटासेट इकट्ठा करने के लिए संभव है ।
Introduction
कई सेल चक्र भर में प्रसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं की निगरानी और सही सेल आकार और कोशिका सूखी द्रव्यमान को मापने के लिए एक चुनौतीपूर्ण काम है । कई लेबल मुक्त ऑप्टिकल तकनीक इस कार्य को करने में सक्षम है1,2: चरण-स्थानांतरण interferometry3, डिजिटल होलोग्राम माइक्रोस्कोप (DHM)4,5,6, 7, quadriwave पार्श्व कतरनी interferometry8,9 और मात्रात्मक चरण टोमोग्राफी10,11. इन पद्धतियों स्तनधारी कोशिकाओं के सेल चक्र की समझ में कई नए अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व किया है । हालांकि वे शायद ही कभी स्वचालित सेल ट्रैकिंग एल्गोरिदम के साथ युग्मित होते है और उनका प्रवाह सीमित रहता है जब सेल जन पथ1 (N < 20 में क्रमशः3,4,5 को मापने , 6). इसलिए एक उपंयास ऑप्टिकल विधि के लिए बड़े आंकड़े (एन > 1000) के साथ सेल जन पथ उपाय की जरूरत है ।
इस पत्र में, हम लेंस की क्षमता का प्रदर्शन मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी करने के लिए एक साथ सीधे कोशिकाओं की छवि हजारों मशीन के अंदर, और फिर व्यक्तिगत सेल चक्र पटरियों के हजारों के साथ एक सेल मीट्रिक यों तो । लेंस से मुक्त माइक्रोस्कोपी एक मात्रात्मक चरण इमेजिंग तकनीक है जो देखने का एक बहुत बड़ा क्षेत्र पर घनी पैक कोशिकाओं के चरण छवि के अधिग्रहण (आमतौर पर मिमी2के कई दसियों, यहां २९.४ mm2)12,13 ,14,15. एकल कक्ष स्तर पर कई मीट्रिक निर्धारित होते हैं, उदा, कक्ष क्षेत्र, सेल ड्राई मास, सेल मोटाई, सेल प्रमुख अक्ष लंबाई और सेल पहलू अनुपात12,15, प्रत्येक छवि से । फिर, एक सेल ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म लागू करके, इन सुविधाओं के प्रयोग के एक समारोह के रूप में हर एक सेल के लिए प्लॉट किया जा सकता है समय14,15। इसके अलावा, सेल पटरियों में सेल डिवीजनों की घटना का पता लगाने के द्वारा, यह ऐसे प्रारंभिक कोशिका शुष्क द्रव्यमान के रूप में अन्य महत्वपूर्ण जानकारी निकालने के लिए संभव है (बस के बाद सेल विभाजन), अंतिम सेल ड्राई मास (बस सेल विभाजन से पहले) और सेल चक्र अवधि, यानी, दो लगातार डिवीजनों के बीच समय15। इन सभी माप बहुत अच्छे आंकड़ों के साथ गणना की जा सकती है (एन > 1000) के बाद से देखने के बड़े क्षेत्र में आम तौर पर एक एकल लेंस मुक्त अधिग्रहण में २०० १०,००० कोशिकाओं के विश्लेषण की अनुमति होगी ।
आदेश में इस पद्धति को समझाने के लेंस के आधार पर मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी, हम प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए निगरानी और २.७ दिनों के लिए एक हेला सेल संस्कृति यों तो । डेटा विश्लेषण बहु-तरंग होलोग्राम पुनर्निर्माण, सेल ट्रैकिंग, सेल विभाजन और सेल डिवीजन एल्गोरिदम के आधार पर एक चार कदम प्रक्रिया है । यहाँ यह दिखाया गया है कि स्थानिक संकल्प और अपेक्षाकृत तेजी से फ्रेम दर (एक अधिग्रहण हर 10 मिनट) इस लेंस के साथ प्राप्त मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी सेटअप मानक सेल ट्रैकिंग एल्गोरिदम के साथ संगत है. इस डेटासेट का पूरा विश्लेषण पूरे सेल चक्र पर १०,५८४ सेल ट्रैक के माप में परिणाम है ।
संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, लेंस मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली उपकरण के लिए स्वचालित रूप से unलेबल्ड, unसिंक्रनाइज़्ड, और unसंशोधित कोशिकाओं के प्रति प्रयोग के हजारों की निगरानी है; प्रत्येक कोशिका कई सेल चक्र पर नज़र रखी जा रही है । हमारे माप इस प्रकार कई सेल मापदंडों का मतलब मूल्य प्रदान करते हैं, लेकिन अधिक महत्वपूर्ण बात, कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी पर अंतर सेल परिवर्तनशीलता.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र में, हम बताते है कि लेंस मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी एक मशीन के अंदर इस्तेमाल किया जा सकता है कोशिकाओं के हजारों की कैनेटीक्स कब्जा । आदेश में समग्र पद्धति का वर्णन करने के लिए हम कैसे एक २.७ दिन स…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के पास मानने के लिए कुछ नहीं है.
Materials
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
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