Summary

Lente-free Video microscopia per la dinamica e analisi quantitativa della coltura delle cellule aderenti

Published: February 23, 2018
doi:

Summary

Lente-libero video microscopia permette di monitorare le colture cellulari direttamente all’interno dell’incubatrice. Qui descriviamo il protocollo completo utilizzato per acquisire e analizzare un’acquisizione di 2,7 giorni lunghi delle cellule coltivate di HeLa, che conduce a un dataset di 2.2 x 106 misurazioni della morfologia delle cellule individuali e ciclo cellulare 10584 tracce.

Abstract

Qui, dimostriamo che lente-libero video microscopia permette di catturare simultaneamente la cinetica di migliaia di cellule direttamente all’interno dell’incubatrice e che è possibile monitorare e quantificare singole cellule lungo diversi cicli cellulari. Descriviamo il protocollo completo utilizzato per monitorare e quantificare una coltura delle cellule HeLa per 2,7 giorni. In primo luogo, acquisizione di cultura cellulare viene eseguita con un microscopio obiettivo-libero video, e quindi i dati vengono analizzati seguendo un processo in quattro fasi: rilevazione delle cellule segmentazione e la divisione cellulare delle cellule-rilevamento, ricostruzione olografica di multi-lunghezza d’onda, algoritmi. Di conseguenza, mostriamo che è possibile raccogliere un dataset con più di 10.000 brani del ciclo cellulare e più di 2 x 106 cella misurazioni morfologiche.

Introduction

Cellule di mammiferi coltivate nel corso di diversi cicli cellulari di monitoraggio e misurazione con precisione dimensioni delle celle e celle massa secca è un compito impegnativo. Diverse tecniche ottiche privo di etichetta sono in grado di eseguire questo compito1,2: uno spostamento di fase interferometria3, microscopia digitale oleografica (DHM)4,5,6, 7, quadriwave laterale taglio interferometria8,9 e fase quantitativa tomografia10,11. Questi metodi hanno portato a molte nuove idee per la comprensione del ciclo cellulare delle cellule di mammiferi. Tuttavia raramente sono accoppiati con cella automatica algoritmi di rilevamento e loro velocità effettiva resta limitato durante la misurazione delle cellule traiettorie massa1 (N < 20 rispettivamente3,4,5 , 6). quindi un nuovo metodo ottico è necessario misurare il traiettorie massa cellulare con grandi statistiche (N > 1000).

In questa carta, dimostriamo la capacità della lente-libero video microscopia di immagine contemporaneamente migliaia di cellule direttamente all’interno dell’incubatrice e quindi quantificare metriche di singola cellula lungo migliaia di tracce individuali ciclo cellulare. Privo di lente la microscopia è una fase quantitativa, tecnica che consente l’acquisizione dell’immagine di fase delle cellule densamente imballate su un campo visivo molto ampio di imaging (in genere diverse decine di mm2, qui 29,4 mm2)12,13 ,14,15. Diversi criteri di misurazione a livello di singola cellula sono determinati, ad es., zona di cella, cellulare massa secca, spessore della cella, lunghezza asse maggiore delle cellule e delle cellule di proporzioni12,15, da ogni immagine. Quindi, applicando un algoritmo di rilevamento delle cellule, queste caratteristiche possono essere tracciate per ogni singola cella come una funzione dell’esperimento tempo14,15. Inoltre, rilevando la presenza di divisioni cellulari nelle tracce delle cellule, è possibile estrarre altre informazioni importanti come la cella iniziale a secco massa (appena dopo la divisione delle cellule), la massa secca di cella finale (appena prima la divisione delle cellule) e la cella ciclo di durata, cioè, il tempo tra due divisioni consecutive15. Tutte queste misure possono essere computate con statistiche molto buone (N > 1000) perché l’ampio campo visivo in genere consentirebbe l’analisi di 200 a 10.000 cellule in una singola acquisizione privo di lente.

Per spiegare questa metodologia basata sulla lente-libero video microscopia, descriviamo il protocollo per monitorare e quantificare una coltura delle cellule HeLa per 2,7 giorni. Analisi dei dati è un processo in quattro fasi basato sulla ricostruzione olografica multi-lunghezza d’onda, cella-rilevamento, segmentazione delle cellule e algoritmi di divisione cellulare. Qui è indicato che la risoluzione spaziale e la frequenza di fotogrammi relativamente veloce (uno acquisizione ogni 10 minuti) ottenuti con questa configurazione obiettivo-libero video microscopia è compatibile con algoritmi di rilevamento delle cellule standard. L’analisi completa di questo dataset deriva nella misurazione di 10.584 cella tracce sopra cicli completi di cella.

Per riassumere, privo di lente video microscopia è un potente strumento per monitorare automaticamente migliaia di senza etichetta, non sincronizzato e le cellule non modificate ogni esperimento; ogni cella monitorata nel corso di diversi cicli cellulari. Le nostre misurazioni forniscono così il valore medio dei diversi parametri di cella, ma ancora più importante, la variabilità inter-cella sopra una grande popolazione di cellule.

Protocol

1. cella cultura monitoraggio acquisizione Crescere le cellule HeLa in DMEM + glutammina (ad es., GlutaMAX) supplementato con 10% (v/v) fetale di vitello inattivato per calore del siero e l’1% penicillina e streptomicina. Cappotto lastre di cultura di fondo 6 pozzetti vetro con fibronectina (25 µ g/mL) per 1 h. Allora seed 2 x 104 cellule per pozzetto. Durante l’acquisizione, cambiare il mezzo ogni 3 giorni. Per l’acquisizione di time-lapse, utilizzare il video…

Representative Results

Per il processo di ricostruzione olografica, il campo di luce è descritta da un campo scalare A (dove è il valore complesso di A sull’aereo a distanza z dalla posizione del campione e laterale e a lunghezza d’onda λ). Propagazione della luce è modellato con la teoria di Huygens-Fresnel che fornisce un kernel propagatore <img…

Discussion

In questa carta, indichiamo che lente-libero video microscopia può essere utilizzato all’interno di un’incubatrice per catturare la cinetica di migliaia di celle. Al fine di descrivere la metodologia globale che abbiamo spiegato come un’acquisizione di time-lapse 2,7 giorno delle cellule HeLa in cultura possa essere analizzati con algoritmi di rilevamento delle cellule standard. Il risultato è un set di dati con 2.2 x 106 cella misure e 10.584 tracce del ciclo cellulare. Le acquisizioni sono state effettuate…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori non hanno nulla a riconoscere.

Materials

Cytonote lens-free video microscope  Iprasense
Horus acquisition software Iprasense
6-well glass bottom culture plates MatTek corporation Part No: P06G-0-14-F 
DMEM + GlutaMAX medium  Gibco
heat-inactivated fetal calf serum  Eurobio
penicillin and streptomycin  Gibco
Fibronectin  Sigma Aldrich
Matlab, image processing toolbox  Mathworks

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Allier, C., Vincent, R., Navarro, F., Menneteau, M., Ghenim, L., Gidrol, X., Bordy, T., Hervé, L., Cioni, O., Bardin, S., Bornens, M., Usson, Y., Morales, S. Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture. J. Vis. Exp. (132), e56580, doi:10.3791/56580 (2018).

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