Summary
इस पांडुलिपि का वर्णन व्यक्तिगत दूत आरएनए (mRNA) टेप के साथ फ्लोरोसेंट लेबल डीएनए जांच के लिए एक विधि, एकल में उपयोग के लिए अणु प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (smFISH) प्रयोगों में ई. कोलाई. smFISH एक दृश्य विधि है कि एक साथ का पता लगाने, स्थानीयकरण, और स्थिर व्यक्तिगत कोशिकाओं में एकल mRNA अणुओं के ठहराव की अनुमति देता है ।
Abstract
एक विधि एक व्यक्ति दूत आरएनए (mRNA) में एक अणु प्रतिदीप्ति में प्रयोग के लिए फिक्स्ड बैक्टीरिया में टेप लेबलिंग के लिए वर्णित है सीटू संकरण में (smFISH) प्रयोगों में ई. कोलाई. smFISH ब्याज की जीन की mRNA कॉपी संख्या में सेल के लिए सेल परिवर्तनशीलता की माप, साथ ही टेप के सेलुलर स्थान की अनुमति देता है । मुख्य शामिल कदम बैक्टीरियल कोशिका संस्कृति के निर्धारण, सेल झिल्ली के permeabilization, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लघु फ्लोरोसेंट के सेट के साथ लक्ष्य टेप के संकरण-लेबल oligonucleotide जांच कर रहे हैं । smFISH अलग फ्लोरोसेंट मार्करों के बीच वर्णक्रम ओवरलैप द्वारा लगाया सीमाओं के साथ, एक ही सेल में कई जीनों की टेप के इमेजिंग की अनुमति दे सकते हैं. नीचे सचित्र प्रोटोकॉल के पूरा होने के बाद, कोशिकाओं को आसानी से एक कम तीव्रता प्रतिदीप्ति के लिए उपयुक्त कैमरा के साथ युग्मित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि हो सकता है । इन छवियों, एक साथ सेल के दौर के विपरीत फ्रेम के विभाजन से प्राप्त की आकृति के साथ, या सेल झिल्ली धुंधला से, खुले स्रोत या कस्टम-लिखित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कोशिकाओं के एक नमूने के mRNA कॉपी संख्या वितरण की गणना की अनुमति । लेबलिंग विधि यहां भी stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) के साथ छवि टेप करने के लिए लागू किया जा सकता है वर्णित है ।
Introduction
Stochasticity जीन अभिव्यक्ति का एक मौलिक और अपरिहार्य पहलू है और2,3टेप और प्रोटीन के स्तर पर सेल-सेल विविधता1को जंम देता है । अच्छी तरह से परिभाषित शर्तों के तहत कोशिकाओं के बीच परिवर्तनशीलता को बढ़ाता बुनियादी प्रक्रियाओं है कि आबाद जीन अभिव्यक्ति और उसके विनियमन में एक अनोखी खिड़की प्रदान करता है । कोशिका कोशिका विविधता बैक्टीरिया में एक महत्वपूर्ण स्रोत transcriptional स्तर पर जगह लेता है । प्रतिलिपि संख्या न केवल प्रतिलेखन के stochasticity के कारण भिंन है, लेकिन यह भी पोस्ट करने के लिए जैसे छोटे RNAs और RNAases द्वारा विनियमन के रूप में transcriptional प्रक्रियाओं2। सीधे एक मात्रात्मक फैशन में इस विविधता तक पहुंचने का एक तरीका है फ्लोरोसेंट द्वारा smFISH में दिए गए जीन के व्यक्तिगत टेप टैगिंग । इस पद्धति का पता लगाने और निश्चित, व्यक्तिगत बैक्टीरियल कोशिकाओं को4में विशेष रूप से आरएनए अणुओं के सेलुलर स्थानीयकरण की अनुमति देता है । mRNAs फ्लोरोसेंट का एक सेट के साथ संकर-लेबल ~ 20 आधार लंबी oligonucleotides है कि चुनिंदा के लिए ब्याज के टेप को बांध डिजाइन किए है5,6। एकाधिक लेबलिंग पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के ऊपर का पता लगाने सुनिश्चित करता है, और व्यक्तिगत mRNA अणुओं एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत विवर्तन-सीमित स्थानों के रूप में दिखाई देते हैं7 (देखें चित्रा 1). वहां mRNA अणुओं लेबलिंग के लिए अंय दृष्टिकोण हैं, जिसमें पूरक oligomer जांच संयुग्मित haptens ले (जैसे, बायोटिन या digoxigenin) कि माध्यमिक फ्लोरोसेंट लेबल रिपोर्टर तकनीक8का उपयोग कर पता लगाया है ।
वहां अंय तरीकों कि टेप के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान कर रहे हैं, smFISH के अलावा । कुछ, जैसे उत्तरी दाग या मात्रात्मक पीसीआर, जांच थोक और इस तरह के mRNA प्रतियां की संख्या न तो माप सकते है और न ही व्यक्तिगत कोशिकाओं में अपनी स्थिति । इसलिए इन तरीकों कोशिका के लिए सेल परिवर्तनशीलता यों तो उपयुक्त नहीं हैं । हाल ही में एक छवि आधारित तकनीक है कि कोशिकाओं के भीतर RNAs की प्रतिलिपि संख्या दोनों के ठहराव के लिए अनुमति देता है और साथ ही उनके intracellular स्थान, बुलाया मल्टीप्लेक्स त्रुटि-मजबूत प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (MERFISH) विकसित किया गया है । MERFISH फ्लोरोसेंट-लेबल oligonucleotide जांच की एक निश्चित संख्या से एक परिभाषित संयोजन से मिलकर एक अनूठा बारकोड के काम पर आधारित है । इन बारकोड smFISH माप के अनुक्रमिक दौर में बाहर पढ़ रहे हैं, संकरण के प्रत्येक दौर के बाद photobleaching के साथ, जिससे परिमाण9,10के दो आदेश से प्रवाह में वृद्धि । इस तकनीक आवश्यक एक स्वचालित द्रव हैंडलिंग प्रणाली और जांच सेट के उचित डिजाइन ।
व्यक्तिगत टेप के एकाधिक प्रतिदीप्ति लेबलिंग के संयोजन, एक साथ उपंयास सुपर संकल्प तकनीकों जैसे stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान)11के साथ, में संकल्प में एक दस गुना वृद्धि सक्षम बनाता है टेप का उपसेलुलर स्थानीयकरण । तूफान में, फ्लोरोसेंट जांच और इमेजिंग बफर का एक उपयुक्त संयोजन जांच अणु (निमिष) प्रति प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के कई चक्र के लिए अनुमति देता है । तूफान भी ई. कोलाई transcriptome छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एक साथ सभी ब्याज की सभी टेप लेबलिंग द्वारा, आरएनए के जीनोम व्यापक स्थानिक संगठन का निरीक्षण12।
सभी एकल कोशिका के ऊपर की समीक्षा की विधि निश्चित कोशिकाओं में इमेजिंग टेप पर आधारित हैं । इसलिए, वे किसी भी सेल के भीतर टेप के काइनेटिक गुण के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते । जीवित कोशिकाओं में टेप का पालन करें13, mRNAs बंधन साइटों की एक सरणी के लिए ब्याज की जीन के फ्यूजन द्वारा लेबल किया जा सकता है । इन बाद तो एक आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे हैं, ऐसे भोजी MS2 कोट प्रोटीन के रूप में, जो एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े हुए है जैसे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP)10,14,15।
यहां हम फ्लोरोसेंट-लेबल डीएनए जांच का एक सेट के साथ व्यक्तिगत mRNAs लेबलिंग के लिए एक विधि का वर्णन, smFISH प्रयोगों में विशेष रूप से ई. कोलाईमें उपयोग के लिए । इसके अलावा, हम बताते है कि एक ही लेबलिंग योजना मामूली संशोधनों के साथ तूफान माप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. जांच डिजाइन
नोट: इस प्रोटोकॉल fluorophores के साथ पहले से ही टैग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध oligonucleotide जांच का उपयोग करता है । जांच विशिष्ट एक लक्ष्य mRNA के पूरक दृश्यों का एक सेट से मिलकर बनता है, प्रत्येक जांच एक फ्लोरोसेंट अणु को संयुग्मित जा रहा है । वैकल्पिक रूप से, यह जांच करने के लिए फ्लोरोसेंट मार्करों संलग्न संभव है, के रूप में5,16कहीं वर्णित है ।
- अर्जुन राज (वान Oudenaarden लैब, मैसाचुसेट्स इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी) द्वारा विकसित जांच डिजाइनर16 एल्गोरिथ्म का उपयोग करते हुए डिजाइन smFISH जांच; इस पांडुलिपि में प्रयुक्त smFISH जांचों का जुगाड़ सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध है ।
नोट: एक जासूसी संकेत के लिए एक सेट में जांच की ंयूनतम संख्या ~ 30 है । सटीक संख्या ब्याज की जीन के अनुसार भिंन हो सकते हैं, विशेष रूप से यदि बहुत कम टेप मापा जाता है । - एक रंग है कि ऑप्टिकल सेटअप फिट बैठता है चुनें (सामग्री की तालिका देखें) ।
नोट: Cy3 डाई या फोटो-ब्लीचिंग के लिए एक कम संवेदनशीलता के साथ एक ऑप्टिकली समकक्ष डाई अत्यधिक की सिफारिश की है. दोहरी लेबलिंग के लिए एक उंमीदवार Cy5 या एक ऑप्टिकली समकक्ष डाई (सामग्री की तालिका देखें) है । लेबल mRNA के तूफान इमेजिंग के लिए उपयुक्त रंजक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के कई चक्रों के लिए उनकी क्षमता की विशेषता है । कुछ smFISH रंजक स्टॉर्म इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (सामग्री की तालिका देखें) । दो छवि (या अधिक) एक ही सेल में अलग जीन के लिए इसी टेप, एक oligonucleotide जांच संयुग्मित का चयन करना चाहिए रंजक जिसका स्पेक्ट्रा कम या कोई ओवरलैप है ।
2. रिएजेंट तैयारी
नोट: यह नमूनों RNAse-मुफ्त RNAse-मुक्त उपभोग्य सामग्रियों जैसे फ़िल्टर पिपेट युक्तियों और ट्यूबों का उपयोग करके रखने के लिए महत्वपूर्ण है, और किसी भी काम कर रहे वातावरण को साफ रखने के लिए । आदेश टेप के क्षरण से बचने के लिए, सेल निर्धारण के बाद इस्तेमाल सभी एजेंट nuclease मुक्त होना चाहिए (सामग्री की तालिका देखें) या diethylpyrocarbonate (DEPC)-इलाज और निष्फल ।
- smFISH के लिए बफ़र्स
- तैयार RNase-मुक्त 1x पंजाबियों (फास्फेट खारा, ०.०१ मीटर और ०.१५४ मीटर, (पीएच ७.४) के एक सोडियम क्लोराइड एकाग्रता के एक फॉस्फेट बफर एकाग्रता के साथ समाधान)) । पतला RNase-मुक्त 10x पंजाबियों (सामग्री की तालिका देखें) में nuclease-मुक्त पानी (सामग्री की तालिका देखें) में 1:10 v/
- वैकल्पिक रूप से तैयार DEPC-इलाज 1x पंजाबियों ।
- RNase-मुक्त 2x एसएससी (खारा-सोडियम साइट्रेट बफर, ०.०३ मीटर सोडियम साइट्रेट में ०.३ मीटर NaCl, (पीएच ७.०)) तैयार करें । पतला RNase-मुक्त 20x एसएससी (सामग्री की तालिका देखें) में nuclease-नि: शुल्क पानी में 1:10 v/v अनुपात ।
- वैकल्पिक रूप से, DEPC-इलाज 2x एसएससी तैयार करते हैं ।
- तैयार RNase-मुक्त 1x पंजाबियों (फास्फेट खारा, ०.०१ मीटर और ०.१५४ मीटर, (पीएच ७.४) के एक सोडियम क्लोराइड एकाग्रता के एक फॉस्फेट बफर एकाग्रता के साथ समाधान)) । पतला RNase-मुक्त 10x पंजाबियों (सामग्री की तालिका देखें) में nuclease-मुक्त पानी (सामग्री की तालिका देखें) में 1:10 v/
- Oligonucleotide जांच स्टॉक समाधान ।
- पुन: भंग करने के लिए २०० µ एल में सूखे oligonucleotide जांच मिश्रण ते बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल, 1 मिमी EDTA, पीएच ८.०) के एक जांच स्टॉक बनाने के लिए 25 µ एम. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण, और फिर भंवर और संक्षेप में ।
- फ्रीज और स्टॉक समाधान ट्यूब के गल से बचने के लिए, शेयर समाधान के कई aliquots बनाने के लिए, एक प्रयोगात्मक चलाने में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अपेक्षित राशि के लिए इसी । स्टॉक समाधान पर-20 ° c या नीचे संग्रहीत करें और प्रकाश से सुरक्षित रखें ।
नोट: 5 nmol की एक जांच सेट अप करने के लिए प्रदान कर सकते हैं २५० संकरण प्रतिक्रियाओं.
- संकरण बफर (निम्नलिखित स्किनर एट अल. 7 ):
- 5 मिलीलीटर nuclease जोड़ें-एक ५० मिलीलीटर के लिए मुफ्त पानी शंकु-नीचे ट्यूब । पानी के लिए dextran सल्फेट के 1 जी जोड़ें और यह जोरदार भंवर से भंग । बुलबुले (~ 30 मिनट) गायब जब तक एक कक्षीय शेखर में सामग्री मिक्स ।
- समाधान ३,५३० में जोड़ें µ के formamide, 10 मिलीग्राम के ई. कोलाई tRNA, 1mL 20x एसएससी, १०० µ एल के २०० मिमी vanadyl-ribonucleoside परिसर और ४० µ एल के ५० मिलीग्राम/एमएल BSA के । DEPC-इलाज पानी या nuclease मुक्त पानी के अलावा द्वारा 10 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाओ, और समाधान भंवर जब तक यह समरूप है ।
नोट: फ्रीज और समाधान के गल से बचने के लिए, शेयर समाधान के कई aliquots बनाने के लिए, एक प्रयोगात्मक चलाने में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अपेक्षित राशि के लिए इसी । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान स्टोर । बोतल खोलने से पहले कमरे के तापमान को गर्म formamide जाने के लिए सुनिश्चित करें । पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, यह इष्टतम formamide एकाग्रता जांचने के लिए सुझाव दिया है (10-40% v/v अनुपात) ।
सावधानी: चेतावनी! Formamide अत्यधिक विषाक्त और एक ज्ञात teratogen है । आंखों या त्वचा, साँस लेना या घूस के साथ संपर्क से बचें । यह एक धुएं डाकू के तहत संभाल जबकि एक प्रयोगशाला कोट और सुरक्षात्मक दस्ताने पहने हुए । - यह एक ०.२२-µm फिल्टर के माध्यम से पारित करके समाधान निष्फल । aliquots और स्टोर में रखें-20 ° c एक वर्ष तक ।
- एक 1:8 v/v अनुपात और भंवर पर ३७% formaldehyde (v/v) 1x पंजाबियों को जोड़कर (2.1.1) formaldehyde (1x पंजाब में ४.६%) निर्धारण बफर तैयार करें ।
सावधानी: चेतावनी! Formaldehyde बेहद विषैला और एक जनाना यलो है । यह एक धुएं डाकू के तहत संभाल जबकि एक प्रयोगशाला कोट और सुरक्षात्मक दस्ताने पहने हुए । - smFISH के लिए धो बफर तैयार (2x एसएससी में 20% formamide) formamide 2x एसएससी को जोड़कर (2.1.2 देखें) के लिए एक 1:4 v/
- 5 मिमी cysteamine और ऑक्सीजन मेहतर (7 µ एम ग्लूकोज oxidase, ५६ एनएम catalase, और 10% ग्लूकोज (डब्ल्यू/वी)) बफर धोने के लिए (2x एसएससी में 20% formamide) जोड़कर smFISH के लिए इमेजिंग बफर तैयार
- तूफान के लिए बफ़र्स
- ५० mm Tris-HCl और 10 mm NaCl को nuclease-फ्री वॉटर में जोड़कर बफर A तैयार करें ।
नोट: वर्ष के लिए RT पर स्टोर. - ५० mm Tris-HCl, 10 mm NaCl, और 10% w/v ग्लूकोज को nuclease-मुक्त पानी में जोड़कर बफर बी तैयार करें ।
नोट: एक साल तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । - एक बफर के 1 मिलीलीटर में ७७ मिलीग्राम cysteamine भंग करके मेे बफर तैयार (एक 1 एम समाधान बनाता है) ।
नोट: यह 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । - ८,४४० au (मनमाना इकाइयां) ग्लूकोज oxidase और ७०,२०० au catalase 1 मिलीलीटर बफर A को जोड़कर Gloxy बफर तैयार करें ।
नोट: 50x स्टॉक समाधान बनाता है, यह 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है । - तूफान के लिए इमेजिंग बफर के ५० mM मेे बफर और 1x Gloxy बफर बी बफर करने के लिए जोड़कर तैयार करें
नोट: इमेजिंग बफर तूफान के लिए 5 मिमी cysteamine, ऑक्सीजन मेहतरों (7 µ एम ग्लूकोज oxidase और ५६ एनएम catalase) में ५० मिमी Tris के साथ 10 मिमी NaCl, और पीएच ८.० पर 10% ग्लूकोज से बना है । बस इमेजिंग से पहले तैयार है, यह और संग्रहीत किया जा सकता है आरटी में लगभग 2 एच के लिए इस्तेमाल किया ।
- ५० mm Tris-HCl और 10 mm NaCl को nuclease-फ्री वॉटर में जोड़कर बफर A तैयार करें ।
3. नमूना निर्धारण
- जीवाणु कोशिकाओं को विकसित (उदा, ई.
नोट: जांच के गैर-विशिष्ट बाइंडिंग के कारण पृष्ठभूमि का निर्धारण करने के लिए, एक तनाव में माप जिसमें ब्याज की जीन हटा दिया गया है आयोजित किया जाना चाहिए, एक ही प्रक्रिया के बाद (देखें Δgalk में चित्रा 1 और ΔsodB में चित्र 2) ।
नोट: चुना माइक्रोस्कोप चरण इसके विपरीत या अंतर हस्तक्षेप विपरीत क्षमताओं नहीं है, तो ई. कोलाई बाहरी झिल्ली 2 माइक्रोन lipophilic फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल किया जा सकता है (सामग्री की तालिका देखें), जो करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए बैक्टीरियल निलंबन 20 मिनट से पहले निर्धारण17। निर्धारण और आगे के उपचार के रूप में नीचे वर्णित पूरा कर रहे हैं । देखभाल के लिए एक अलग उत्सर्जन स्पेक्ट्रम होने एक फ्लोरोसेंट मार्कर का चयन करने के लिए, लेबल जांच सेट के साथ वर्णक्रमीय ओवरलैप को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए ।
4. नमूना Permeabilization
- supernatant को बहुत सावधानी से निकालें । छोटे मात्रा पिपेट का प्रयोग करें, यदि आवश्यक हो, गोली के बाहर सभी तरल को दूर करने के लिए ।
- ३०० µ l DEPC-उपचारित जल या nuclease-मुक्त जल में पुनर्स्थगित । जोड़ें ३५० µ एल उच्च ग्रेड निरपेक्ष इथेनॉल (९९%) और धीरे ट्यूब पलटने से मिश्रण । इथेनॉल और मिश्रण का एक और ३५० µ एल जोड़ें फिर से, ७०% की एक अंतिम इथेनॉल एकाग्रता तक पहुंचने के लिए (v/
सावधानी: चेतावनी! इथेनॉल ज्वलनशील है । - कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 20 rpm पर एक ट्यूब रोटेटर के साथ नमूना घुमाएं (RT), या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर । नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह तक संग्रहित किया जा सकता है ।
5. संकरण
- 7 मिनट, ७५० x g, 4 ° c के लिए केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं । निकाल supernatant.
- नमूने के लिए 1 मिलीलीटर 20% धोने बफर जोड़ें और कई मिनट के लिए खड़े छोड़ दो, या पिपेट पूरी तरह से गोली भंग करने के लिए ।
- 7 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं, ७५० x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
- pipetting द्वारा बहुत धीरे supernatant निकालें । अगर गोली के बाहर सभी तरल को दूर करने के लिए आवश्यक छोटे मात्रा पिपेट का प्रयोग करें ।
- oligonucleotide जांच संकरण बफर aliquot के लिए स्टॉक समाधान सेट जोड़ें ताकि अंतिम oligonucleotide एकाग्रता २५० एनएम है; भंवर जोरदार ।
नोट: एक ही कक्ष में एक बार में दो या अधिक भिंन लक्ष्य mRNAs लेबल कर सकते हैं । संकरण बफ़र के लिए दोनों लक्ष्यों की जांच सेट जोड़ें । देखभाल वर्णक्रमीय ओवरलैप को कम करने के लिए अलग उत्सर्जन स्पेक्ट्रा होने रंजक का चयन करने के लिए लिया जाना चाहिए (उदा., Cy3 और Cy5) । सुनिश्चित करें कि नमूने स्टॉर्म इमेजिंग के लिए इरादा एक oligonucleotide जांच सेट के साथ संकर रहे है तूफान के लिए एक उपयुक्त डाई के साथ संयुग्मित (उदा., सामग्री की तालिका में). - नमूनों को निलंबित (चरण ५.४ देखें) में ५० µ l संकरण बफ़र जिसमें oligonucleotide जांच, बुलबुले की पीढ़ी से परहेज करते हुए (समाधान काफी चिपचिपा है).
- अंधेरे में 30 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म ब्लॉक पर रातोंरात नमूने छोड़ दें ।
नोट: इस के बाद, नमूने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
6. धुलाई
- छवि के लिए प्रत्येक नमूने के लिए एक नई microcentrifuge ट्यूब का प्रयोग करें । 1 मिलीलीटर वाश बफ़र जोड़ें ।
- नए ट्यूब कि धोने बफर शामिल करने के लिए संकरे नमूनों से 10-15 µ एल जोड़ें और मिश्रण/
- 7 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर ७५० x g के लिए केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं । निकाल supernatant.
नोट: पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, 30 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन । - धो दो बार अधिक (1 मिलीलीटर धोने बफर में reसस्पेंड, केंद्रापसारक और गोली हटा) ।
- 25 µ एल वॉश बफर में पुनर्स्थगित ।
नोट: फोटो-ब्लीचिंग को कम करने के लिए एक धोने बफर करने के लिए जोड़ सकते हैं एक ऑक्सीजन सफाई प्रणाली (२.६) एकल अणु प्रतिदीप्ति प्रयोगों में डाई स्थिरता में सुधार करने के लिए6.
7. इमेजिंग के लिए नमूनों की तैयारी
नोट: कोशिकाओं को एक प्रतिदीप्ति और चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के अंतर्गत उचित इमेजिंग की अनुमति देने के लिए मैटीरियल की आवश्यकता होती है । निंनलिखित विधियों में अलग फोकल विमानों पर देखने के विभिंन क्षेत्रों में छवि हो सकता है नमूनों को तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- Agarose जेल की तैयारी
- जोड़ें १५० मिलीग्राम agarose 10 मिलीलीटर 2x एसएससी बफर । agarose के लिए 2x एसएससी जोड़ नहीं है, या फिर यह ठीक से भंग नहीं होगा ।
- 10-15 के लिए माइक्रोवेव हर बार जब तक बड़े बुलबुले के लिए फार्म शुरू करते हैं । कुछ मिनट के लिए शांत करने के लिए अलग सेट ।
- स्लाइड पर एक अलग सिलिकॉन फ़्रेम रखें जिससे स्लाइड का केंद्र सामने आ गया है ।
- स्लाइड के केंद्र में एक 10 मिमी चौड़ा (1-2 मिमी मोटी) कठोर अंगूठी प्लेस और यह में जेल की एक छोटी राशि जमा, सीलिंग के लिए । इसके लिए कुछ मिनटों तक कठोर प्रतीक्षा करें.
- एक उच्च गुंबद आकार का गठन किया है जब तक अधिक जेल जोड़ें । यह कठोर करने के लिए 10 मिनट रुको, और अंगूठी को हटाने (ठीक चिमटी या किसी अंय विधि का उपयोग करके) ।
- जमा ~ धो बैक्टीरियल कोशिकाओं के 10 μL (६.५ देखें) जेल पर और एक #0 coverslip स्लाइड के साथ सील ।
- smFISH के लिए चेंबर नमूना तैयार
- वैकल्पिक रूप से (७.१ चरण के लिए) (देखें ६.५) पाली-डी-lysine-लेपित ग्लास नीचे डिस्पोजेबल प्लास्टिक पेट्री व्यंजन पर धोया जीवाणु कोशिकाओं को स्थिर द्वारा इमेजिंग के लिए नमूने तैयार ।
- , कमरे के तापमान पर अंधेरे में नमूनों की मशीन, दृश्य से पहले रातोंरात सतह के लिए कोशिकाओं के आसंजन की अनुमति के लिए । इससे पहले कि दृश्य धोने बफर (.5) के साथ एक बार धोने; smFISH (२.६) के लिए वाश बफ़र (2.5) या इमेजिंग बफ़र के साथ नमूना गीले रखें ।
- तूफान के लिए चैंबर नमूना तैयार
- पाली-डी-lysine-लेपित ग्लास नीचे डिस्पोजेबल प्लास्टिक पेट्री व्यंजन पर इमेजिंग के लिए तूफान के लिए नमूने तैयार करें ।
- आरटी में, रात भर अंधेरे में नमूनों की मशीन । smFISH (२.५) के लिए धोने बफर के साथ दृश्य धोने से पहले एक बार; और तूफान (2.7.5) के लिए इमेजिंग बफर जोड़ें ।
8.प्रतिलिपि विज़ुअलाइज़ेशन
- एक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ छवि कोशिकाओं को एक मोटर चालित चरण के साथ सुसज्जित (सामग्री की तालिका देखें).
नोट: तूफान संशोधन के लिए, एक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के कई चक्रों में सक्षम डाई के साथ लेबल कोशिकाओं का उपयोग करें । 3 डी सुपर संकल्प इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर नमूना छवि (उदा., सामग्री की तालिका देखें) । - उपयोग (अनुशंसित) a 60-100x N. a & #62; १.३ तेल विसर्जन चरण कंट्रास्ट एक मजबूत प्रकाश स्रोत, जैसे एक पारा या धातु-halide लैंप के साथ उद्देश्य लेंस; एलईडी प्रकाश स्रोतों पर आधारित भी सिफारिश कर रहे हैं ।
- एक मानक ठंडा सीसीडी कैमरा का प्रयोग करें, आदर्श कम प्रकाश स्तर इमेजिंग के लिए अनुकूलित बजाय गति (हम 16 µm पिक्सेल आकार के साथ एक कैमरे का उपयोग करें) (सामग्री की तालिका देखें) ।
नोट: एक ठंडा EMCCD का उपयोग (इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज उपकरण युग्मित) कैमरा सीसीडी कैमरा थर्मल शोर है कि पता लगाने से रोकता है, विशेष रूप से एकल अणुओं के कम करने के लिए आवश्यक है । - चयनित fluorophores के लिए उपयुक्त फ़िल्टर सेट का उपयोग करें ।
- ठीक से सेल सीमाओं का निर्धारण करने के लिए, प्रत्येक नमूने में देखने के विभिंन क्षेत्रों की छवियों को प्राप्त करने के साथ या तो चरण विपरीत प्रकाशिकी, या फ्लोरोसेंट बाह्य कोशिका झिल्ली लेबलिंग द्वारा । सभी चैनलों के लिए अलग फोकल विमानों (जेड-ढेर) में छवियों का अधिग्रहण (आमतौर पर 13 २५० एनएम द्वारा अलग स्लाइस ले रहे हैं) ।
नोट: माइक्रोस्कोप की मोटर चालित चरण और फिल्टर सेट वाणिज्यिक द्वारा नियंत्रित किया जाना चाहिए (सामग्री की तालिका देखें) या में घर सॉफ्टवेयर है कि अनुक्रम में छवियों के ढेर पर कब्जा कर सकते हैं.
9. डेटा विश्लेषण
- डेटा विश्लेषण के लिए छवि स्टैक्स को उपयुक्त स्वरूप में कनवर्ट करें ।
- सेल में फ्लोरोसेंट घावों की कुल तीव्रता से लक्ष्य mRNA की प्रतिलिपि संख्या का अनुमान, बजाय अन्य वर्तमान में उपलब्ध प्रोटोकॉल में के रूप में ' असतत स्पॉट ' गिनती से ।
- खुले स्रोत सॉफ्टवेयर18 के साथ या एक कस्टम-निर्मित कार्यक्रम के साथ छवि विश्लेषण बाहर ले । डेटा इमेजिंग और विश्लेषण के विवरण के लिए देखें स्किनर एट अल. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
हम ई. कोलाई कोशिकाओं में galK और sodB टेप के smFISH माप बाहर किया । टेप विशिष्ट लक्ष्य अनुक्रम के पूरक दृश्यों का एक सेट के साथ, प्रत्येक जांच एक फ्लोरोसेंट अणु को संयुग्मित जा रहा है संकर थे (सामग्री की तालिका देखें) । प्रतिदीप्ति और चरण कंट्रास्ट छवियों के MG1655 वाइल्ड-टाइप ई. कोलाई तनाव (WT) या एक JW0740 (कईयो संग्रह)19 galK-हटाए गए तनाव (ΔgalK) के संपर्क में थे 2 मिमी डी-fucose चित्रा 1a और 1bमें दिखाए जाते हैं । कोशिकाओं को डी-fucose के लिए जोखिम के बाद कम से कम 3 ज तय किया गया । चित्रा 1a (ऊपर) में पैनलों 13 से बाहर एक फ्रेम दिखाने के लिए, जिस पर सेल आकृति ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, इसी ऊंचाई के लिए चर extracellular डी fucose सांद्रता के जवाब में galK प्रेरण के स्तर का प्रतिनिधित्व । प्रतिदीप्ति छवियों में कोशिकाओं के भीतर स्पॉट या तो एकल या कुछ galk टेप के अनुरूप है, और प्रत्येक कोशिका में प्रतिलिपि संख्या के निर्धारण के स्थानीयकृत प्रतिदीप्ति को बढ़ाता द्वारा किया जाता है । कई धब्बे ज्यादातर कोशिकाओं में देखा जाता है, जब 2 मिमी डी-fucose बैक्टीरियल संस्कृति के लिए जोड़ा जाता है, जबकि कुछ स्थानों extracellular डी-fucose के अभाव में देखा जाता है । ΔgalK तनाव में कोई स्पॉट प्रत्याशित के रूप में पृष्ठभूमि पर मनाया जाता है । lipophilic फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ सतह लेबलिंग चित्रा 1b (नीचे) में दिखाया गया है ।
इसके अलावा, हम sodB टेप ई. कोलाई बैक्टीरियल में पौंड मध्यम में उगाया संस्कृति लघुगणकीय विकास चरण में छवि । WT या एक JW1648 (कईयो संग्रह)19 sodB-हटाए गए तनाव (ΔsodB) में smFISH के प्रतिदीप्ति और चरण कंट्रास्ट छवियां चित्रा 2aमें दिखाया गया है । चित्रा 2a (ऊपर) में पैनलों 13 से बाहर एक फ्रेम दिखाने के लिए, जिस पर सेल आकृति ध्यान में हैं, sodBके स्तर का प्रतिनिधित्व करने के लिए इसी ऊंचाई । ΔsodB तनाव में, कोई धब्बे पृष्ठभूमि पर मनाया जाता है, के रूप में प्रत्याशित ।
एक ही संस्कृतियों तूफान द्वारा imaged थे (ऊपर) और कोशिकाओं की परिधि के साथ निर्धारित किया गया सतह लेबलिंग एक lipophilic फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं के भीतर sodB के स्थानीयकरण वर्णन । झिल्ली धुंधला सेल में टेप की सटीक स्थिति की अनुमति देता है (चित्र बीसी) । ΔsodB तनाव पृष्ठभूमि संकेत के रूप में लिया गया था और ंयूनतम क्लस्टर आकार निर्धारित करने के लिए ( चित्रा बीसी देखें) । smFISH2 और तूफान का मतलब है प्रतिलिपि संख्या तुलनीय है ।
चित्रा 1: डी के प्रभाव-fucose पर galK टेप smFISH का उपयोग कर visualized. (A) Top: smFISH images of प्रतिदीप्ति of galK mRNA in वैयक्तिक ई. कोलाई प्रकोष्ठ. एक MG1655 जंगली-प्रकार तनाव (WT) या एक JW0740 (कईयो संग्रह) galK-हटाए गए तनाव (ΔgalK)19 के साथ या बिना 2 मिमी डी-fucose बड़े हो गए थे । galK टेप पूरक ऑप्टिकली Cy3 के बराबर डाई के साथ संयुग्मित जांच करने के लिए संकरे थे (सामग्री की तालिका देखें) । नीचे: चरण-कंट्रास्ट में देखने के समान फ़ील्ड्स । (ख) WT कोशिकाओं के साथ या बिना 2 मिमी डी-fucose के रूप में ऊपर और एक lipophilic झिल्ली डाई के 2 माइक्रोन के साथ लेबल (सामग्री की तालिका देखें) 20 मिनट के लिए निर्धारण से पहले हो गए थे । Top: प्रतिदीप्ति images of galK mRNA का उपयोग smFISH. छवियां एक १०० × N. a १.४५ तेल विसर्जन चरण कंट्रास्ट उद्देश्य लेंस का उपयोग कर एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित माइक्रोस्कोप के साथ ले जाया गया (सामग्री की तालिका देखें) और एक EMCCD कैमरा (सामग्री की तालिका देखें) । इस्तेमाल किया फिल्टर सामग्री की तालिका में वर्णित के रूप में थे । एक चरण इसके विपरीत छवि एक z-13 स्लाइस और 2 के साथ फ्लोरोसेंट छवियों के २५० एनएम रिक्ति के ढेर के बाद अधिग्रहीत किया गया था प्रत्येक स्लाइस के लिए s एकीकरण समय । मध्य: चरण-कंट्रास्ट इमेजिंग के साथ दृश्य के समान फ़ील्ड्स । नीचे: lipophilic फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ लेबल कोशिकाओं, उपयुक्त सामग्री तालिका में वर्णित फिल्टर के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: smFISH और तूफान में सेट एक ही जांच के साथ लेबल sodB टेप की इमेजिंग । (A) Top: smFISH images of प्रतिदीप्ति of sodB mRNA in वैयक्तिक ई. कोलाई प्रकोष्ठ. एक MG1655 वाइल्ड-टाइप तनाव (WT) या एक JW1648 (कईयो collection) sodB-मिटे तनाव (ΔsodB)19 पौंड मीडियम में उगाए गए थे । sodB टेप पूरक ऑप्टिकली Cy5 के बराबर डाई के साथ संयुग्मित जांच करने के लिए संकरे थे (सामग्री की तालिका देखें) । नीचे: चरण-कंट्रास्ट में देखने के समान फ़ील्ड्स । (ख) फ्लोरोसेंट अणुओं के ओवरले (व्यक्तिगत रंग का डॉट्स) तूफान द्वारा स्थानीय (६७० एनएम उत्सर्जन) और देखने के एक ही क्षेत्र में कोशिका झिल्ली का एक स्नैपशॉट । कोशिकाओं को एक lipophilic डाई के साथ लेबल किया गया था, ४८८ एनएम पर एक आर्गन लेजर के साथ उत्साहित 1% से अधिक शक्ति (०.०५ किलोवाट/सेमी2) ५१० एनएम पर एक उत्सर्जन चोटी के साथ और उपयुक्त फिल्टर के साथ imaged (सामग्री की तालिका देखें) । WT और sodB कोशिकाओं के रूप में ऊपर वर्णित है और एक 2 माइक्रोन lipophilic झिल्ली डाई (सामग्री की तालिका देखें) 20 मिनट के लिए निर्धारण करने से पहले के साथ लेबल के रूप में विकसित किया गया । सुपर संकल्प छवियों को एक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप के साथ दर्ज किया गया (सामग्री की तालिका देखें). टेप एक रंग के साथ लेबल ऑप्टिकली Cy5 के बराबर तूफान के लिए एक इमेजिंग बफर में ६४७ एनएम पर एक उत्तेजना लेजर का उपयोग स्थानीयकृत थे । छवियां एक 60x का उपयोग कर दर्ज की गई, NA १.२ जल विसर्जन उद्देश्य (सामग्री की तालिका देखें) और एक EMCCD कैमरा (देखें सामग्री की तालिका) लाभ पर सेट के साथ ५०, फ्रेम दर पर ५० हर्ट्ज, और अधिकतम शक्ति ६४७ और ४०५ एनएम पराबैंगनीकिरण पर सेट 5 और ०.०५ किलोवाट/ क्रमश. प्राप्त किए गए फ़्रेंस की कुल संख्या ८,००० थी । डेटा वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था (सामग्री तालिका देखें) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हम अपनी प्रयोगशाला में smFISH विधि2का उपयोग कर ई. कोलाई कोशिकाओं में अलग जीन की प्रतिलिपि संख्या मापा है । संक्षेप में, इस प्रक्रिया में निंनलिखित कदम होते हैं: कोशिका निर्धारण, झिल्ली की permeabilization जांच प्रवेश, जांच संकरण के लिए अनुमति देने के लिए, और नमूना इमेजिंग एक मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर । यह प्रक्रिया कुछ संशोधनों6,7,16के साथ पहले से प्रकाशित लोगों पर आधारित है । यह पहले की सूचना दी है कि smFISH की आवश्यकता है कि oligonucleotide जांच की संख्या 48-72 रेंज में झूठ है, ताकि एक संकेत प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से पृष्ठभूमि से ऊपर झूठ बोल रहा है7। हमें पता चला है कि यह संख्या वास्तव में छोटे हो सकता है20, ब्याज की जीन अनुक्रम पर निर्भर करता है, ऑप्टिकल सेटअप, और विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियों ।
प्रत्येक जांच 17-22 न्यूक्लियोटाइड लंबे समय तक होना चाहिए, एक अंतर की जांच जुदाई के साथ कम से कम दो न्यूक्लियोटाइड और ~ ४५% की एक GC सामग्री, ताकि गैर के प्रभाव को कम करने के लिए विशिष्ट, बंद लक्ष्य बंधन । कुछ जांचें किसी लक्ष्य को बाइंड करने में विफल हो सकती हैं, और बाइंडिंग की समग्र दक्षता को प्रायोगिक प्रक्रियाओं के संशोधनों जैसे निर्धारण और संकरण21की शर्तों के अनुसार ऑप्टिमाइज़ किया जा सकता है । एक महत्वपूर्ण कारक है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए fluorophores की पसंद है । यह अत्यधिक फोटो-ब्लीच करने के लिए कम संवेदनशीलता के साथ एक डाई के साथ जांच लेबल करने के लिए सिफारिश की है । फोटो ब्लीचिंग ंयूनतम जोखिम बार, रोशनी सूत्रों का अनुकूलन, और छवि अधिग्रहण के एकीकरण के समय से प्राप्त किया जा सकता है, और एक ऑक्सीजन सफाई प्रणाली के अलावा द्वारा ।
गैर विशिष्ट बाध्यकारी घटनाओं की हद तक जो लक्ष्य जीन हटा रहे है उपभेदों से कोशिकाओं के साथ smFISH प्रयोगों को ले द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए कईयो संग्रह19से । पृष्ठभूमि संकेत उच्च है, तो संख्या और धुलाई चरणों की अवधि बढ़ाई जानी चाहिए, या कोशिकाओं 1 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर धोने बफर में मशीन किया जाना चाहिए और फिर दो बार धोया. इसके अलावा, पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, यह सुझाव दिया है formamide एकाग्रता का अनुकूलन करने के लिए (10-40% v/v अनुपात) संकरण और धोने बफ़र्स में । formamide एकाग्रता को बढ़ाना, विशिष्ट बाइंडिंग को कम करता है, लेकिन यह लक्ष्य mRNA करने के लिए जांचों के बंधन को भी कम कर सकता है । संकरण कदम के दौरान, यह supernatant पूरी तरह से दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है; एक पतला संकरण बफ़र कम लेबलिंग दक्षता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, लक्ष्य RNAs पर्याप्त लंबे समय के लिए पृष्ठभूमि के ऊपर एक अच्छी तरह से स्थानीयकृत स्थान प्राप्त करने के लिए होना चाहिए । जांच की रीढ़ संशोधन के माध्यम से संकेत करने के लिए शोर अनुपात और बंधन विशिष्टता में हाल ही में सुधार अब यह युकेरियोटिक microRNAs या बैक्टीरियल छोटे गैर कोडिंग RNAs के रूप में छोटा आरएनए टुकड़े, का पता लगाने के लिए संभव बनाने के2, 10. हम अनुशंसा करते हैं कि smFISH द्वारा प्राप्त निकृष्ट प्रतिलिपि संख्या को मात्रात्मक पीसीआर7,16के साथ मान्य किया जाना चाहिए.
हम इस पांडुलिपि में दिखाया गया है कि इस पद्धति के छोटे परिवर्तन के साथ संशोधित किया जा सकता है के लिए उच्च ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान)11का उपयोग कर stochastic के साथ ई. कोलाई में टेप के स्थानीयकरण का अध्ययन ।
सारांश में, smFISH आरएनए रोशनी के लिए एक बहुमुखी विधि है कि सेल सेल की प्रतिलेखन संख्या में परिवर्तनशीलता के प्रत्यक्ष माप और कक्ष में लक्ष्य टेप के स्थानीयकरण, दोनों eukaryotes और prokaryotes में अनुमति देता है । यह जीन अभिव्यक्ति की बुनियादी प्रक्रियाओं के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है और आसानी से स्टॉर्म इमेजिंग के लिए कार्यांवित किया जा सकता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम एक इसराइल विज्ञान फाउंडेशन अनुदान ५१४४१५ (जे) और एक बीएसएफ-NSF (म्क्ब) अनुदान २०१६७०७ (जे करने के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था । एक Siegfried और जेनिंग्स Ullman प्रोफेसरी कुर्सी (जे) से समर्थन भी स्वीकार किया है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker - Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen - Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 - 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24x60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa | |||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa |
References
- Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601 (2014).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
- van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
- Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628 (2014).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
- van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
- Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
- Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
- So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
- Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
- Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).
