Summary
Dette manuskriptet beskriver en metode for merking personlige budbringer RNA (mRNA) utskrifter med fluorescently-merket DNA sonder, for bruk i enkelt-molekylet fluorescens i situ hybridisering (smFISH) eksperimenter i E. coli. smFISH er en visualisering metode som tillater samtidig deteksjon, lokalisering og kvantifisering av enkelt mRNA molekyler i fast enkeltceller.
Abstract
En metode er beskrevet for merking personlige budbringer RNA (mRNA) utskrifter i fast bakterier for bruk i enkelt-molekylet fluorescens i situ hybridisering (smFISH) eksperimenter i E. coli. smFISH lar måling av celle-til-celle variasjon i mRNA kopien antall gener rundt, samt subcellular plasseringen av transkripsjoner. De viktigste trinnene involvert er fiksering av bakteriell cellekultur, permeabilization av celle membraner og blanding av målet transkripsjoner med sett av kommersielt tilgjengelig kort fluorescently-merket oligonucleotide sonder. smFISH kan tillate avbilding av utskrifter av flere gener i samme celle, med begrensninger pålagt av spectral overlappingen mellom forskjellige fluorescerende markører. Etter at protokollen nedenfor, celler kan lett avbildes bruker et mikroskop kombinert med et kamera som er egnet for lav intensitet fluorescens. Disse bildene, med cellen konturer innhentet fra segmentering av fase kontrast rammer, eller cellemembranen flekker, tillate beregningen av mRNA kopi nummer fordelingen av celler med åpen kildekode eller tilpasset skrevet. Merking metoden beskrevet her kan også brukes på bildet utskrifter med Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM).
Introduction
Stochasticity er en grunnleggende og uunngåelig del av genuttrykk og gir opphav til celle-celle heterogenitet1, både på nivå utskrifter og proteiner2,3. Kvantifisere variasjon mellom celler under veldefinerte forhold tilbyr et unikt vindu i den grunnleggende prosesser underlie genuttrykk og dens regulering. En viktig kilde til celle-celle heterogenitet i bakterier foregår på transcriptional nivå. Transkripsjon tall varierer skyldes stochasticity transkripsjon, men også post-transcriptional prosesser som regulering av små RNAs og RNAases2. En måte å direkte tilgang til denne heterogene i en kvantitativ måte er ved fluorescently merking personlige utskrifter med et gitt i smFISH. Denne metoden gjør at gjenkjenning og subcellular lokalisering av bestemt RNA molekyler i faste, personlige bakterieceller4. mRNAs er hybridiserte med en fluorescently-merket ~ 20 base lange oligonucleotides, som er utformet for å binde selektivt til transkripsjoner interesse5,6. Flere merking sikrer gjenkjenning over bakgrunnen fluorescens og mRNA molekyler vises som Diffraksjon-begrenset flekker under en fluorescens mikroskop7 (se figur 1). Det finnes andre metoder for merking mRNA molekyler, som utfyllende oligomer sonder bære konjugert kan (f.eks, biotin eller digoxigenin) som blir funnet ved hjelp av sekundære fluorescently-merket reporter teknikker8.
Det finnes andre metoder som gir kvantitativ informasjon om transkripsjoner, i tillegg til smFISH. Noen, som nordlige blot eller kvantitativ PCR, undersøke bulk og dermed kan måle verken antall mRNA Kopier eller deres posisjon i enkeltceller. Derfor er disse metodene ikke egnet til å kvantifisere celle til celle variasjon. En siste bilde-basert teknikk som gir mulighet for kvantifisering av både kopien antall RNAs i cellene samt deres intracellulær sted, kalt multiplekset feil-robust fluorescens i situ hybridisering (MERFISH) har blitt utviklet. MERFISH er basert på tildeling av en unik strekkode består av en definert kombinasjon fra et bestemt antall fluorescently-merket oligonucleotide sonder. Disse strekkodene leses i sekvensielle runder med smFISH mål, med photobleaching etter hver runde av hybridisering, og dermed øke gjennomstrømming av to størrelsesordener9,10. Denne teknikken nødvendiggjør en automatisert væske system og skikkelig utformingen av sonden settet.
Kombinasjonen av flere fluorescens merking av personlige transkripsjoner, sammen med romanen super-oppløsning teknikker som Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM)11, gjør en ti-fold økning i oppløsning i den subcellular lokalisering av transkripsjoner. I STORM gir en passende kombinasjon av fluorescerende sonder og tenkelig buffer flere sykluser av fluorescens utslipp per sonde molekyl (blinker). STORMEN kan også brukes til image E. coli transcriptome og observere genomet hele romlig organisering av ved merking samtidig alle utskrifter av rundt12.
Alle encellede metodene nevnt over er basert på imaging utskrifter i fast celler. Derfor gir de ikke informasjon om egenskapene kinetic utskrifter i celler. For å følge utskrifter i lever celler13, kan mRNAs merkes av sammensmeltingen av genet av interesse for en rekke bindende områder. Disse sistnevnte er så anerkjent av et RNA-bindende protein, som bacteriophage MS2 pels protein, som er sammensmeltet med et fluorescerende protein som grønne fluorescerende protein (GFP)10,14,15.
Her beskriver vi en metode for merking personlige mRNAs med en fluorescently-merket DNA sonder, for bruk i smFISH eksperimenter, spesielt i E. coli. Videre viser vi at samme merking ordningen kan brukes for STORM målinger med mindre modifikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sonde Design
Merk: Denne protokollen bruker kommersielt tilgjengelige oligonucleotide sonder allerede merket med fluorophores. Sonder består av et sett med spesifikke sekvenser komplementære til et mål mRNA, hver probe blir konjugert til en enkelt fluorescerende molekylet. Alternativt er det mulig å knytte fluorescerende markører til sonder, som beskrevet andre steder5,16.
- Design smFISH sonder bruke Probe Designer16 algoritme utviklet av Arjun Raj (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology); sekvenser av smFISH sonder i dette manuskriptet er oppført i tabellen i materialer.
Merk: Minimum antall sonder i et sett for en detectable signal er ~ 30. Hvor mange kan variere genet av interesse, spesielt hvis kort transkripsjoner måles. - Velg en farge som passer optisk oppsettet (se tabell av materialer).
Merk: Cy3 fargestoff eller en optisk tilsvarende farge med en lav mottakelighet for foto-bleking er sterkt anbefalt. En kandidat for dobbel merking er Cy5 eller en optisk tilsvarende farge (se tabell av materialer). Egnet fargestoffer ved STORM avbildning av merket mRNA kjennetegnes ved sin kapasitet for flere sykluser av fluorescens utslipp. Noen smFISH fargestoffer kan brukes for STORM bildebehandling (se tabell av materialer). For å bilde to (eller flere) transkripsjoner tilsvarer ulike gener i samme celle, bør man velge oligonucleotide sonder konjugert til fargestoffer som spectra har liten eller ingen overlapping.
2. forberedelse av reagenser
Merk: Det er viktig å holde prøvene RNAse-fri ved hjelp av RNase-fri forbruksvarer som filtrert pipette-spisser og rør, og å holde noen arbeidsmiljø ren. For å unngå nedbrytning av målet transkripsjoner, alle reagenser som brukes i cellen fiksering må være nuclease-fri (se tabell av materialer) eller diethylpyrocarbonate (DEPC)-behandlet og steriliseres.
- Bufferne for smFISH
- Forberede RNase-gratis 1 x PBS (fosfat bufret saltvann, løsning med en fosfat buffer konsentrasjon av 0,01 M og en natriumklorid konsentrasjon av 0.154 M, (pH 7.4)). Fortynn RNase-gratis 10 x PBS (se tabell av materialer) i nuclease-gratis vann (se tabell av materialer) på en 1:10 v/v forholdet.
- Alternativt forberede DEPC-behandlet 1 x PBS.
- Forberede RNase-gratis 2 x SSC (saltholdig-natriumsitrat buffer, 0,3 M NaCl i 0,03 M natriumsitrat, (pH 7.0)). Fortynn RNase-fri 20 x SSC (se tabell av materialer) i nuclease-fritt vann på en 1:10 v/v forholdet.
- Også forberede DEPC-behandlet 2 x SSC.
- Forberede RNase-gratis 1 x PBS (fosfat bufret saltvann, løsning med en fosfat buffer konsentrasjon av 0,01 M og en natriumklorid konsentrasjon av 0.154 M, (pH 7.4)). Fortynn RNase-gratis 10 x PBS (se tabell av materialer) i nuclease-gratis vann (se tabell av materialer) på en 1:10 v/v forholdet.
- Oligonucleotide sonde lagerløsning.
- Nytt oppløse tørket oligonucleotide sonde blandingen i 200 µL av TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) opprette en sonde lager av 25 µM. Bland godt av pipettering opp og ned, og deretter vortex og sentrifuger kort.
- For å unngå freeze- og thaw av lagerløsning rør, gjøre flere dele lager løsningen, tilsvarer beløpet som forventes i en enkelt eksperimentelle kjøre. Lagre lager løsningen på 20 ° C eller under, og beskytte mot lyset.
Merk: En sonde sett med 5 nmol kan gi opptil 250 hybridisering reaksjoner.
- Hybridisering buffer (etter Skinner et al. 7 ):
- Legge til 5 mL nuclease-fritt vann slik 50 mL polypropylen konisk bunn. Legge 1 g av dekstran sulfate vannet og oppløse den av energisk vortexing. Bland innholdet i en orbital shaker til bobler forsvinner (~ 30 min).
- Legg til løsning 3,530 µL av deionisert formamide, 10 mg av E. coli tRNA, 1 mL av 20 x SSC, 100 µL av 200 mM vanadyl-ribonucleoside kompleks og 40 µL av 50 mg/mL BSA. Ta det siste bindet til 10 mL av DEPC-behandlet vann eller nuclease-fritt vann og vortex løsningen til det er homogent.
Merk: For å unngå freeze- og thaw av løsningen, må flere dele lager løsningen, tilsvarer beløpet som forventes i en enkelt eksperimentelle kjøre. Lagre lager løsningen på 20 ° C. Husk å la formamide varm til romtemperatur før åpne flasken. For å redusere bakgrunnen, er det foreslått for å kalibrere den optimale formamide konsentrasjonen (10-40% v/v ratio).
Forsiktig: ADVARSEL! Formamide er svært giftig og en kjent teratogen. Unngå kontakt med øyne eller hud, innånding eller svelging. Håndtere det under avtrekksvifte mens iført en labfrakk og vernehansker. - Sterilisere løsningen ved å passere det gjennom filtere 0.22-µm. Vær dele og lagre på 20 ° C opp til ett år.
- Forberede fiksering buffer (4,6% formaldehyd i 1 x PBS) ved å legge til 37% formaldehyd (v/v) 1 x PBS (se 2.1.1) 1:8 v/v forholdet og vortex.
FORSIKTIG: ADVARSEL! Formaldehyd er svært giftig og et kjent karsinogen. Håndtere det under avtrekksvifte mens iført en labfrakk og vernehansker. - Forberede vaskebuffer smFISH (20% formamide i 2 x SSC) ved å legge til deionisert formamide 2 x SSC (se 2.1.2) til en 1:4 v/v forholdet og vortex.
- Forberede tenkelig buffer for smFISH ved å legge til 5 mM cysteamine og oksygen renovasjonsarbeider (7 µM gluko, 56 nM catalase og 10% glukose (w/v)) å vaske bufferen (20% formamide i 2 x SSC)
- Bufferne for STORM
- Klargjør Buffer A ved å legge til 50 mM Tris-HCl og 10 mM NaCl nuclease-fritt vann.
Merk: Butikken på RT i år. - Forberede Buffer B ved å legge til 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl og 10% w/v glukose til nuclease-fritt vann.
Merk: Butikken på 4 ° C for opp til ett år. - Klargjør MEA buffer ved oppløsning 77 mg cysteamine i 1 mL av buffer A (gjør en 1 M løsning).
Merk: Det kan være lagret på 4 ° C for 1 måned. - Forberede Gloxy buffer ved å legge 8,440 AU (vilkårlig enheter) gluko og 70,200 AU catalase til 1 mL buffer A.
Merk: Gjør 50 x lager løsning, det kan lagres på 4 ° C for 1 måned. - Forberede tenkelig buffer STORM ved å legge til 50 mM MEA buffer og 1 x Gloxy buffer til buffer B.
Merk: Bildebehandling bufferen for STORM består av 5 mM cysteamine og oksygen scavengers (7 µM gluko og 56 nM catalase) i 50 mM Tris med 10 mM NaCl 10% glukose ved pH 8.0. Forberede like før bildebehandling, kan lagres og brukes på RT for ca 2 timer.
- Klargjør Buffer A ved å legge til 50 mM Tris-HCl og 10 mM NaCl nuclease-fritt vann.
3. eksempel fiksering
- Vokse bakterielle celler (f.eks E.
Merk: For å finne bakgrunnen på grunn av ikke-spesifikk binding av sonder, mål i en belastning genet av interesse er slettet som skal utføres, følge samme prosedyrer (se Δgalk i figur 1 og ΔsodB i Figur 2).
Merk: Hvis valgt mikroskopet ikke har kontrast eller differensiell forstyrrelser kontrast evner, E. coli ytre membraner kan merkes med 2 μM lipofile fluorescerende markør (se tabell av materialer), som skal legges til i bakteriell suspensjon 20 min før fiksering17. Fiksering og videre behandling er oppnådd som beskrevet nedenfor. Hensyn må tas å velge merketråd fluorescerende har en annen utslipp spektrum, minimere spectral overlapping med merket-sonden satt.
4. prøve Permeabilization
- Fjerne nedbryting nøye. Bruk små Pipetter, om nødvendig, å fjerne alle flytende utenfor pellet.
- Resuspend i 300 µL DEPC-behandlet vann eller nuclease-fritt vann. Legg 350 µL høy klasse absolutt etanol (99%) og bland forsiktig ved å snu røret. Legge til en annen 350 µL av etanol og bland igjen, for å nå en siste etanol konsentrasjon av 70% (v/v ratio).
FORSIKTIG: ADVARSEL! Etanol er brannfarlig. - Roter prøven med et rør rotator 20 RPM 1t ved romtemperatur (RT), eller på 4 ° C over natten. Eksempler kan være lagret på 4 ° C 1 uke.
5. hybridisering
- Pellets celler med sentrifugering for 7 min, 750 x g, 4 ° C. Fjerne nedbryting.
- Legg 1 mL 20% vaske bufferen til prøvene og la stå i flere minutter, eller pipette å oppløse pellet helt.
- Pellet celler med sentrifugering i 7 min, 750 x g, 4 ° C.
- Fjerne nedbryting svært forsiktig ved pipettering. Bruk små volumer Pipetter om nødvendig å fjerne alle flytende utenfor pellet.
- Legge til oligonucleotide sonden angir lagerløsning til hybridisering buffer aliquot slik at den endelige oligonucleotide konsentrasjonen er 250 nM; Vortex kraftig.
Merk: En kan merke to eller flere ulike mRNAs samtidig i samme celle. Legge sonden sett begge målene til hybridisering bufferen. Man må være forsiktig å velge fargestoffer har forskjellige utslipp spectra å minimere spectral overlappingen (f.eksCy3 og Cy5). Kontroller at prøver tiltenkt STORM imaging er hybridiserte med en oligonucleotide sonde satt konjugert med en egnet fargestoff for STORM (f.eksi tabellen materialer). - Avbryte prøver (se trinn 5.4) 50 µL hybridisering buffer som inneholder oligonucleotide sonder, mens du unngår generasjonen av bobler (løsningen er helt tyktflytende).
- La prøver over natten på varme blokk på 30 ° C i mørket.
Merk: Denne-prøver, kan oppbevares i inntil 6 måneder på 4 ° C.
6. vask
- Bruk en ny microcentrifuge tube for hvert utvalg bildet. Legg 1 mL vaskebuffer.
- Legge til 10-15 µL fra hybridisert prøvene i det nye røret som inneholder vaskebuffer og blanding/vortex.
- Pellets celler av sentrifugering i 7 min, 750 x g på 4 ° C. Fjerne nedbryting.
Merk: For å redusere bakgrunn, ruge 1t på 30 ° C. - Vaske to ganger mer (resuspend i 1 mL vaskebuffer, sentrifuge og fjerne pellet).
- Resuspend i 25 µL vaskebuffer.
Merk: For å redusere Foto-bleking en kan legge til vaskebuffer en oksygen scavenging system (2.6) for å forbedre fargestoff stabilitet i enkelt-molekylet fluorescens eksperimenter6.
7. forberedelse av prøver for Imaging
Merk: Celler må bli immobilisert slik at riktig imaging under fluorescens og kontrast mikroskop. Følgende metoder kan brukes til å forberede eksempler der kan forskjellige synsfelt avbildes på ulike fokal fly.
- Agarose gel forberedelse
- Legge til 150 mg agarose 10 mL 2 x SSC buffer. Ikke Legg 2 x SSC til agarose, ellers vil ikke løses riktig.
- Mikrobølgeovn for 10-15 s hver gang til store bobler begynner å danne. Avsette avkjøles i noen minutter.
- Plass en skiller silikon ramme på lysbildet slik at lysbildet center forblir synlige.
- Plasser en 10 mm bred (1-2 mm tykk) rigid ring i midten av lysbildet og sette inn litt gel, for tetting. Vent noen minutter for å stivne.
- Legge til mer gel til en høy hjemmemarked skikkelsen er dannet. Vent 10 min for å stivne, og ta ut ringen (med fine pinsett eller noen annen metode).
- Innskudd ~ 10 μL vasket bakterielle celler (se 6.5) gel og segl med en #0 dekkglassvæske.
- Kammeret eksempel forberedelse til smFISH
- Alternativt (til trinn 7.1) forberede prøver bildebehandling ved immobilizing vasket bakterieceller (se 6.5) på poly-D-lysin-belagt glass bunn engangs plast petri retter.
- Inkuber prøvene i mørket, i romtemperatur, natten før visualisering tillate vedheft av cellene til overflaten. Før visualisering vask en gang med vaskebuffer (. 5); holde prøven våt med buffer(2.5) eller imaging vaskebuffer for smFISH (2.6).
- Kammeret eksempel forberedelse til STORM
- Forberede prøver STORM i bildebehandling på poly-D-lysin-belagt glass bunn engangs plast petri retter.
- Inkuber prøvene i mørket, på RT, over natten. Før visualisering vask en gang med vaskebuffer for smFISH (2,5); og legge tenkelig buffer for STORM (2.7.5).
8.Transkripsjon visualisering
- Bilde celler med et bredt felt fluorescens mikroskop utstyrt med en motorisert scene (se tabell av materialer).
Merk: STORM endring, bruke celler merket med en farge kan flere sykluser av fluorescens utslipp. Image utvalget med 3D super-oppløsning tenkelig system (f.eksse tabell av materialer). - Bruk (anbefales) en 60-100 x N.A > 1,3 olje nedsenking fase kontrast linsen med en sterk lyskilde, som kvikksølv eller metall-metallhalid lampe; LED-baserte lyskilder anbefales også.
- Bruk en standard avkjølt CCD kamera, ideelt optimalisert for lite lys nivå tenkelig enn fart (vi bruker et kamera med 16 µm pikselstørrelsen) (se tabell av materialer).
Merk: Bruk av en avkjølt EMCCD (elektron multiplisere kostnad kombinert enhet) kamera CCD kamera er nødvendig å redusere termisk støy som hindrer oppdagelsen, spesielt av enkelt molekyler. - Bruk filter angir passende for fluorophores valgt.
- For å fastslå riktig cellekantlinjene, hente bilder av ulike synsfelt i hver prøve enten fase kontrast optikk eller ved merking fluorescently ytre cellemembranen. Hente bilder på forskjellige fokal fly (z-stack) for alle kanaler (vanligvis 13 skiver atskilt med 250 nm er tatt).
Merk: Motorisert scenen av mikroskopet og filter setter bør kontrolleres av kommersielle (se tabell av materialer) eller internt programvare som kan ta en rekke bilder i sekvens.
9. dataanalyse
- Konvertere bildestakker til et egnet format for dataanalyse.
- Anslå antall kopier av målet mRNA fra total intensiteten av fluorescerende foci i cellen, fremfor teller diskrete "spots" som protokoller tilgjengelig.
- Utføre bildeanalyser med åpen kildekode programvare18 eller med en spesialbygd program. For detaljer om data se bildebehandling og analyse Skinner et al. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har utført smFISH målinger av galK og sodB utskrifter i E. coli celler. Transkripsjoner ble hybridiserte med en bestemt sekvenser komplementære til målet sekvensen, hver probe blir konjugert til en enkelt fluorescerende molekyl (se tabell av materialer). Fluorescens og fase kontrast bilder av MG1655 vill-type E. coli belastning (WT) eller en JW0740 (Keio samling)19 galK slettet belastning (ΔgalK) ble utsatt for 2 mM D-fucose er vist i figur 1A og 1B. Cellene ble løst minst 3 h etter eksponering for D-fucose. Panelene i figur 1A (øverst) viser en ramme av 13, tilsvarer høyden som cellen konturene er i fokus, som angir galK induksjon svar på variabel ekstracellulære D-fucose konsentrasjoner. Flekker i celler i fluorescens bilder tilsvarer enten enkel eller noen galk utskrifter, og fastsettelse av transkripsjon tallet i hver celle er utført av kvantifisere lokaliserte fluorescens. Mange steder er sett i de fleste celler, når 2 mM D-fucose legges til bakteriell kultur, mens noen flekker er sett i fravær av ekstracellulære D-fucose. I ΔgalK belastningen er ikke flekker observert over bakgrunn som forventet. Overflaten merking med lipofile fluorescerende markør er vist i figur 1B (nederst).
I tillegg fotografert vi sodB utskrifter i E. coli bakteriell kultur dyrket i LB medium i logaritmisk vekstfase. Fluorescens og fase kontrast bilder av smFISH i WT eller en JW1648 (Keio samling)19 sodB slettet belastning (ΔsodB) vises i figur 2A. Panelene i figur 2A (øverst) viser en ramme av 13, tilsvarer høyden på hvilken celle konturene er i fokus, som angir sodB. I ΔsodB belastningen, er ingen flekker observert over bakgrunnen, som forventet.
De samme kulturene ble fotografert med STORM (øverst) og perimeters av cellene var bestemt overflate merking med en lipofile fluorescerende markør som illustrerer lokaliseringen av sodB i cellene. Farging membranen lar nøyaktig plassering av utskrifter i cellen (figur 2B). ΔsodB belastningen ble tatt bakgrunn signal og bestemme minimal klyngestørrelsen (se figur 2B). Mener transkripsjon er smFISH2 og STORM sammenlignbare.
Figur 1: effekter av D-fucose i galK utskrifter visualisert bruker smFISH. (A) topp: smFISH bilder av fluorescens av galK mRNA i individuelle E. coli celler. En MG1655 vill-type belastning (WT) eller en JW0740 (Keio samling) galK -slettet belastning (ΔgalK)19 var vokst med eller uten 2 mM D-fucose. GalK utskrifter var hybridiserte til utfyllende sonder konjugert med en fargestoff optisk tilsvarer Cy3 (se tabell av materialer). Bunnen: samme synsfelt i fase kontrast. (B) WT celler ble dyrket med eller uten 2 mM D-fucose som ovenfor og merket med 2 μM av en lipofile membran fargestoff (se tabell av materialer) for 20 min før fiksering. Topp: fluorescens bilder av galK mRNA bruker smFISH. Bildene ble tatt med et mikroskop kontrollert av en kommersiell programvare bruker en 100 × N.A 1.45 olje nedsenking fase kontrast linsen (se tabell av materialer) og et EMCCD kamera (se tabell av materialer). Filtrene brukes var som beskrevet i tabellen av materialer. En fase kontrast bildet ble kjøpt etterfulgt av en z-stabel av 13 skiver og 250 nm avstanden mellom fluorescerende bilder med 2 s integrering tid for hver skive. Midten: samme synsfelt med kontrast imaging. Bunnen: celler merket med lipofile fluorescerende markører, med passende filtre beskrevet i tabellen materialer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Imaging av sodB utskrifter merket med samme sonden satt i smFISH og STORM. (A) topp: smFISH bilder av fluorescens av sodB mRNA i individuelle E. coli celler. En MG1655 vill-type belastning (WT) eller en JW1648 (Keio samling) sodB -slettet belastning (ΔsodB)19 var vokst i LB medium. SodB utskrifter var hybridiserte til utfyllende sonder konjugert med en fargestoff optisk tilsvarer Cy5 (se tabell av materialer). Bunnen: samme synsfelt i fase kontrast. (B) overlegg fluorescerende molekyler (personlige fargede prikker) lokalisert med STORM (670 nm utslipp) og et øyeblikksbilde av celle membraner i samme synsfelt. Cellene ble merket med en lipofile fargestoff, spent med en argon laser på 488 nm 1% maksimal power (0,05 kW/cm2) med et utslipp peak på 510 nm og fotografert med riktig filter (se tabell over materialer). WT og sodB celler ble dyrket som beskrevet ovenfor og merket med en 2 μM lipofile membran fargestoff (se tabell av materialer) for 20 min før fiksering. Super-oppløsning bilder tatt med kommersielle mikroskop (se tabell av materialer). Transkripsjoner merket med et fargestoff optisk tilsvarer Cy5 ble lokalisert bruker en eksitasjon laser på 647 nm i en tenkelig buffer for STORM. Bilder tatt med en 60 x, NA 1.2 vann nedsenking mål (se tabell av materialer) og et EMCCD kamera (se tabell av materialer) med gevinst satt til 50, bildefrekvens på 50 Hz og maksimal kraft 647 og 405 nm lasere satt til 5 og 0,05 kW/cm2 , henholdsvis. Totalt antall rammer kjøpt var 8000. Dataene ble analysert ved hjelp av kommersiell programvare (se materialer tabell). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har målt i vårt laboratorium transkripsjon antall ulike gener i E. coli celler ved hjelp av smFISH metoden2. I korthet, denne prosedyren består av følgende trinn: cellen fiksering, permeabilization av membraner å tillate sonde penetrasjon, undersøke hybridisering og prøve bildevisning standard fluorescens mikroskop. Denne fremgangsmåten er basert på tidligere publiserte de med noen modifikasjoner6,7,16. Det har tidligere vært rapportert at smFISH krever at antall oligonucleotide sonder ligger innenfor 48-72, for å oppnå et signal ligger godt over bakgrunnen7. Vi har vist at dette nummeret kan være faktisk mindre20, avhengig av genet sekvensen av interesse, optisk oppsettet og bestemt eksperimentelle forhold.
Hver probe skal 17-22 nukleotider lang, med en Inter sonde separasjon av minst to nukleotider og en GC innholdet i ~ 45%, for å redusere virkningene av ikke-spesifikk, off-målet bindende. Noen sonder kan mislykkes å binde et mål, og den generelle effektiviteten av binding kan optimaliseres av modifikasjoner av eksperimentelle prosedyrer som de fiksering og hybridisering21. En viktig faktor som må tas i betraktning er valg av fluorophores. Det anbefales å merke sonder med en farge med lav mottakelighet for foto-bleking. Foto-bleking minimering oppnås ved optimalisering av ganger eksponering, belysning kilder og integrasjon tider bildeopptak og tillegg av en oksygen scavenging systemet.
Omfanget av ikke-spesifikk bindende hendelser skal vurderes ved smFISH eksperimenter med celler fra stammer i hvilke mål gener slettes, for eksempel fra Keio samling19. Hvis bakgrunnen signalet er høyt, antall og varighet vaske trinnene bør økes, eller celler skal ruges i vaskebuffer ved 30 ° C i 1 time og deretter vasket to ganger. Videre, for å redusere bakgrunnen, er det foreslått for å optimalisere formamide konsentrasjon (10-40% v/v ratio) i hybridization og vaskebuffere. Øker formamide konsentrasjonen reduserer uspesifikke binding, men kan også redusere binding av sonder til målet mRNA. Under det hybridisering trinnet er det viktig å fjerne nedbryting helt; fortynne hybridisering bufferen kan føre til redusert merking effektivitet. Målet RNAs må i tillegg være langt nok for å få et godt lokaliserte sted over bakgrunnen. Siste forbedringer i signal til støy forhold og bindende spesifisitet gjennom ryggraden endring av sonder nå gjør det mulig å oppdage kortere RNA fragmenter, for eksempel eukaryote microRNAs eller bakteriell små ikke-koding RNAs2, 10. vi anbefaler at hvor betyr kopi ved smFISH skal valideres med kvantitative PCR7,16.
Vi har vist i dette manuskriptet at denne metoden kan endres med mindre endringer å studere lokalisering av utskrifter i E. coli med høyere optisk oppløsning ved hjelp av Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM)11.
I sammendraget er smFISH en allsidig metode for RNA belysning som tillater direkte måling av celle-celle variasjon i transkripsjon nummer og lokalisering av målet utskrifter i cellen i prokaryoter og eukaryoter. Det gir kvantitativ informasjon om grunnleggende prosesser av genuttrykk og lett implementert for STORM bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en Israel Science Foundation stipend 514415 (til js) og BSF-NSF (kalt MCB) stipend 2016707 (til js). Støtte fra en Siegfried og Irma Ullman professorkompetanse stol (til js) er også anerkjent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker - Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen - Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 - 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24x60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa | |||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa |
References
- Tsimring, L. S.
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
- van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
- Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628 (2014).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
- van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
- Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
- Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
- So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
- Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
- Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).
