Summary
Ce manuscrit décrit une méthode pour l’étiquetage individuel ARN messager (ARNm) transcriptions avec sondes d’ADN marquées fluorescent, pour une utilisation en single-molecule fluorescence in situ (smFISH) expériences d’hybridation chez e. coli. smFISH est une méthode de visualisation qui permet la détection simultanée, de localisation et quantification des molécules d’ARNm uniques dans des cellules individuelles fixes.
Abstract
On décrit une méthode pour l’étiquetage individuel ARN messager (ARNm) transcriptions chez les bactéries fixes pour utilisation en single-molecule fluorescence in situ (smFISH) expériences d’hybridation chez e. coli. smFISH permet la mesure de la variabilité de la cellule-cellule au nombre de copies d’ADN messagère des gènes d’intérêt, ainsi que la localisation subcellulaire des transcriptions. Les principales étapes sont la fixation de la culture de la cellule bactérienne, la perméabilisation des membranes cellulaires et l’hybridation des transcriptions cible avec jeux de sondes oligonucléotidiques fluorescent marqué disponible dans le commerce du court. smFISH peut permettre à l’imagerie de la transcription de gènes multiples dans la même cellule, avec les limitations imposées par le chevauchement spectral de différents marqueurs fluorescents. Après avoir terminé le protocole illustré ci-dessous, les cellules peuvent être facilement photographiées à l’aide d’un microscope couplé avec un appareil photo destiné à faible intensité fluorescence. Ces images, ainsi que de la cellule des contours obtenus de segmentation d’images de contraste de phase, ou de coloration de membrane cellulaire, permettent le calcul de la distribution de nombre de copie ARNm d’un échantillon de cellules à l’aide de logiciels libres ou écriture personnalisée. La méthode étiquetage décrite ici peut également être appliquée aux transcriptions d’image avec la microscopie stochastique reconstruction optique (tempête).
Introduction
Stochasticité est un aspect fondamental et incontournable de l’expression génique et donne naissance à des cellules hétérogénéité1, tant au niveau de transcription et protéines2,3. Quantification de la variabilité entre les cellules dans des conditions bien définies offre un guichet unique dans les processus de base qui sous-tendent l’expression des gènes et son règlement. Une importante source d’hétérogénéité des cellules chez les bactéries se déroule au niveau transcriptionnel. Nombres de transcription varient non seulement en raison de la stochasticité de transcription, mais aussi à des processus tels que la régulation post-transcriptionnelle par petit RNAs et RNAases2. Une façon d’accéder directement à cette hétérogénéité de façon quantitative est de marquage fluorescent des relevés de notes individuels d’un gène donné en smFISH. Cette méthode permet la détection et la localisation subcellulaire de molécules d’ARN particulières en fixe, les cellules bactériennes individuelles4. ARNm est hybridées avec un ensemble d’oligonucléotides de base-long de ~ 20 fluorescent-étiquetés qui visent à lier sélectivement aux transcriptions d’intérêt5,6. Plusieurs étiquetage garantit une détection au-dessus de fluorescence de fond et des molécules d’ARNm individuelles apparaissent comme des taches de diffraction-limited sous un microscope de fluorescence7 (voir Figure 1). Il existe d’autres approches pour l’étiquetage des molécules d’ARNm, dans laquelle les sondes oligomère complémentaire portent des haptènes conjugués (p. ex., biotine ou digoxigénine) qui sont détectés à l’aide de techniques secondaires journaliste fluorescent marqué8.
Il existe d’autres méthodes qui fournissent des informations quantitatives sur les relevés de notes, en plus de smFISH. Certains, comme le Northern blot ou PCR quantitative, la majeure partie de la sonde et ainsi permet de mesurer le nombre de copies d’ADN messagère ni leur position dans des cellules individuelles. C’est pourquoi ces méthodes ne conviennent pas quantifier la variabilité de cellule à cellule. Une technique récente basée sur une image qui permet la quantification des fois le nombre de copies d’ARN dans les cellules ainsi que leur localisation intracellulaire, appelé multiplexés hybridation in situ fluorescence erreur-robuste (MERFISH) a été mis au point. MERFISH est basé sur l’attribution d’un code à barres unique consistant en une combinaison définie d’un nombre fixe de sondes oligonucléotidiques fluorescent marqué. Ces codes barres sont lus en séries séquentielles de smFISH mesures, avec photoblanchiment après chaque ronde de l’hybridation, augmentant ainsi le débit par deux ordres de grandeur9,10. Cette technique nécessite un fluides automatisé système et la conception adéquate de l’ensemble de la sonde.
La combinaison de multiples fluorescence étiquetage des relevés de notes individuels, ainsi que des techniques de Super-résolution roman comme reconstruction optique stochastique microscopie (tempête)11, permet de décupler la résolution dans le localisation sous-cellulaire des transcriptions. Dans la tempête, une combinaison appropriée de sondes fluorescentes et tampon d’imagerie permet de multiples cycles d’émission de fluorescence par molécule de sonde (clignotant). TEMPÊTE peut également être utilisé pour l’image du transcriptome d’e. coli et observer l’organisation spatiale de génome d’ARN, par marquage simultanément toutes les transcriptions d’intérêt12.
Toutes les méthodes unicellulaires examinées ci-dessus reposent sur l’imagerie des transcriptions dans les cellules fixes. Par conséquent, ils ne fournissent pas toutes les informations concernant les propriétés cinétiques des transcriptions dans les cellules. Pour suivre les transcriptions dans des cellules vivantes13, ARNm peut être marqué par la fusion du gène d’intérêt dans un tableau des sites de liaison. Ces derniers sont alors reconnus par une protéine de liaison à l’ARN, tels que le bactériophage MS2 protéine de capside, qui est fusionnée à une protéine fluorescente comme la protéine fluorescente verte (GFP)10,14,15.
Nous décrivons ici une méthode pour l’étiquetage différents mRNAs avec un ensemble de sondes d’ADN marquées fluorescent, pour une utilisation dans des expériences de smFISH, en particulier chez e. coli. De plus, nous montrons que le même schéma d’étiquetage peut-être être utilisé pour les mesures de la tempête avec des modifications mineures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. conception de la sonde
Remarque : Ce protocole utilise des sondes oligonucléotidiques disponibles dans le commerce déjà étiquetés avec des fluorophores. Les sondes sont constitués d’un ensemble de séquences spécifiques complémentaires à une cible ADN messagère, chaque sonde étant conjugué à une seule molécule fluorescente. Alternativement, il est possible d’attacher des marqueurs fluorescents aux sondes, tel que décrit ailleurs5,16.
- Sondes de smFISH de conception en utilisant l’algorithme de16 sonde Designer développé par Arjun Raj (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology) ; séquences de smFISH sondes utilisées dans ce manuscrit sont répertoriés dans la table des matières.
Remarque : Le nombre minimum de sondes dans un ensemble pour un signal détectable est ~ 30. Le nombre exact peut varier selon le gène d’intérêt, surtout si les relevés de notes très courtes sont mesurés. - Choisissez un colorant qui correspond à la configuration optique (voir table des matières).
Remarque : La teinture de Cy3 ou un colorant optiquement équivalent avec une faible sensibilité à la photo-blanchiment est recommandé. Un candidat pour le double étiquetage est Cy5 ou un équivalent optiquement teindre (voir table des matières). Colorants appropriés pour l’imagerie de la tempête du mRNA marquées sont caractérisés par leur capacité de multiples cycles d’émission de fluorescence. Certains colorants smFISH peuvent être utilisés pour l’imagerie de la tempête (voir table des matières). Pour deux (ou plusieurs) relevés de notes correspondant à des gènes différents dans la même cellule de l’image, on devrait choisir des sondes oligonucléotidiques conjugués aux colorants dont les spectres ont peu ou pas de chevauchement.
2. préparation du réactif
Remarque : Il est important de garder les échantillons RNAse-libre à l’aide de RNase-libre consommables tels que les tubes et les pointes de pipette filtrée et de garder n’importe quel environnement de travail propre. Afin d’éviter la dégradation de la transcription de la cible, tous les réactifs utilisés après fixation de la cellule doivent être exempte de nucléase (voir table des matières) ou diéthylpyrocarbonate (DEPC)-traités et stérilisés.
- Tampons pour smFISH
- Préparer la RNase-libre 1 x PBS (tamponné phosphate salin, solution avec une concentration de tampon phosphate 0,01 m et une concentration de chlorure de sodium de 0,154 M, (pH 7,4)). Diluer la RNase-libre 10 x PBS (voir table des matières) dans exempte de nucléase l’eau (voir table des matières) à un 01:10 rapport v/v.
- Vous pouvez également préparer traitée DEPC 1 x PBS.
- Préparer la RNase-libre 2 x SSC (tampon citrate de sodium-saline, 0,3 M de NaCl dans le citrate de sodium 0,03 M, (pH 7,0)). Diluer la RNase-libre 20 x SSC (voir la table des matières) dans une eau exempte de nucléase à un 01:10 rapport v/v.
- Vous pouvez également préparer 2 traitée DEPC x SSC.
- Préparer la RNase-libre 1 x PBS (tamponné phosphate salin, solution avec une concentration de tampon phosphate 0,01 m et une concentration de chlorure de sodium de 0,154 M, (pH 7,4)). Diluer la RNase-libre 10 x PBS (voir table des matières) dans exempte de nucléase l’eau (voir table des matières) à un 01:10 rapport v/v.
- Solution mère de sonde oligonucléotide.
- Dissoudre à nouveau le mélange de sonde oligonucléotide séchée dans 200 µL de tampon TE (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 8,0) pour créer un stock de sonde de 25 µM. Mélangez bien en pipetage de haut en bas et puis de vortex et centrifuger brièvement.
- Pour éviter le gel et le dégel du tube de la solution mère, faire plusieurs parties aliquotes de la solution mère, correspondant au montant devrait être utilisé en une seule expérimentation exécute. Conserver la solution stock à-20 ° C ou moins et protéger de la lumière.
Remarque : Un ensemble de sonde de 5 nmol peut fournir jusqu'à 250 réactions d’hybridation.
- Tampon d’hybridation (suite de Skinner et al. ( 7 ) :
- Ajouter 5 mL d’eau exempte de nucléase dans un tube à fond conique polypropylène 50 mL. Ajouter 1 g de sulfate de dextran à l’eau et dissoudre par agitation vigoureuse. Mélanger le contenu dans un agitateur orbital jusqu'à disparaissent des bulles (~ 30 min).
- Ajouter à la µL de solution 3 530 du formamide désionisée, 10 mg d’e. coli ARNt, 1 mL de 20 x SSC, 100 µL de 200 mM de vanadyle-ribonucléosides complexe et 40 µL de 50 mg/mL de BSA. Porter le volume final à 10 mL par addition d’eau traitée DEPC ou eau exempte de nucléase et vortex la solution jusqu'à ce qu’elle soit homogène.
Remarque : Pour éviter le gel et le dégel de la solution, faire plusieurs parties aliquotes de la solution mère, correspondant au montant devrait être utilisé en une seule expérimentation exécute. Conserver la solution stock à-20 ° C. N’oubliez pas de laisser le formamide chaud à température ambiante avant d’ouvrir la bouteille. Pour réduire le fond, il est suggéré de calibrer la concentration optimale de formamide (ratio de 10 à 40 % v/v).
Mise en garde : MISE EN GARDE ! Formamide est hautement toxique et un agent tératogène connu. Éviter tout contact avec les yeux ou la peau, inhalation ou l’ingestion. Le manipuler sous une hotte de laboratoire tout en portant une blouse et des gants de protection. - Stérilisez la solution en le faisant passer à travers un filtre de 0,22 µm. Garder en aliquotes et stocker à-20 ° C jusqu'à un an.
- Préparer, tampon de Fixation (4,6 % de formaldéhyde dans du PBS 1 x) en ajoutant le formaldéhyde 37 % (v/v) de PBS 1 x (voir 2.1.1) à un rapport v/v et un vortex 1:8.
MISE EN GARDE : ATTENTION ! Le formaldéhyde est hautement toxique et cancérogène connu. Le manipuler sous une hotte de laboratoire tout en portant une blouse et des gants de protection. - Préparer le tampon de lavage pour smFISH (20 % formamide dans 2 x SSC) en ajoutant la formamide déionisée à 2 x SSC (voir 2.1.2) à un rapport v/v et un vortex 1:4.
- Préparer le tampon d’imagerie pour smFISH en ajoutant 5 mM par la cystéamine et l’oxygène charognards (7 µM glucose oxydase, 56 catalase nM et 10 % de glucose (p/v)) pour le tampon de lavage (20 % formamide dans 2 x SSC)
- Tampons pour STORM
- Préparer les tampons A en ajoutant les Tris-HCl 50 mM et 10 mM NaCl à eau exempte de nucléase.
NOTE : Conserver à RT pour années. - Préparer le tampon B en ajoutant 50 mM Tris-HCl 10 mM NaCl et 10 % p/v glucose à eau exempte de nucléase.
NOTE : Conserver à 4 ° C pendant un an. - Préparer tampon MEA en dissolvant la cystéamine 77 mg dans 1 mL de tampons A (en fait une solution de 1 M).
Remarque : Il peut être stocké à 4 ° C pendant 1 mois. - Préparer Gloxy tampon en ajoutant 8 440 UA (unités arbitraires) glucose oxydase et catalase de AU 70 200 à 1 mL de tampon A.
NOTE : Fait 50 x solution-mère, il peut être stocké à 4 ° C pendant 1 mois. - Préparer le tampon d’imagerie pour STORM en ajoutant 50 mM de tampon MEA et 1 x Gloxy à tampon B.
Remarque : Le tampon d’imagerie pour l’orage est composé de 5 mM cystéamine, oxygène charognards (56 nM catalase et oxydase de glucose 7 µM) en 50 mM Tris avec 10 mM NaCl et 10 % de glucose à un pH de 8,0. Préparer juste avant de l’imagerie, il peut être stocké et utilisé à ta pendant environ 2 h.
- Préparer les tampons A en ajoutant les Tris-HCl 50 mM et 10 mM NaCl à eau exempte de nucléase.
3. échantillon Fixation
- La croissance des cellules bactériennes (p. ex., E.
Remarque : Pour déterminer le fond en raison de la liaison non spécifique des sondes, des mesures dans une souche dont le gène d’intérêt a été supprimé se fasse, suivant les mêmes procédures (voir Δgalk dans la Figure 1 et ΔsodB dans La figure 2).
Remarque : Si le microscope choisi n’a pas de contraste de phase ou de capacités de contraste d’interférence différentielle, e. coli membranes externes peuvent être étiquetés avec le marqueur fluorescent lipophiles de 2 μM (voir table des matières), qui doit être ajoutée à la suspension bactérienne 20 min avant fixation17. Fixation et traitements additionnels sont réalisées comme décrit ci-dessous. Il faut choisir un marqueur fluorescent ayant un spectre d’émission différent, afin de minimiser le chevauchement spectral avec l’ensemble de la sonde marquée.
4. l’échantillon perméabilisation
- Retirez le surnageant avec beaucoup d’attention. Utiliser des pipettes de petit volume, si nécessaire, de retirer tout le liquide à l’extérieur de la pastille.
- Remettre en suspension dans l’eau traitée DEPC µL 300 ou de l’eau exempte de nucléase. Ajouter 350 µL haut grade d’éthanol absolu (99 %) et mélanger doucement en retournant le tube. Ajouter un autre 350 µL d’éthanol et mélanger à nouveau, pour atteindre une concentration finale de l’éthanol 70 % (rapport v/v).
MISE EN GARDE : ATTENTION ! L’éthanol est inflammable. - Faire tourner l’échantillon avec une coiffe de tube à 20 tr/min pendant 1 h à température ambiante (RT), ou à 4 ° C pendant la nuit. Échantillons peuvent être conservés à 4 ° C jusqu'à une semaine.
5. l’hybridation
- Culot de cellules par centrifugation pendant 7 min, 750 x g, 4 ° C. Retirez le surnageant.
- Ajouter 1 mL 20 % tampon aux échantillons de laver et laisser reposer pendant plusieurs minutes, ou pipette pour dissoudre le culot complètement.
- Culot de cellules par centrifugation pendant 7 min, à x 750 g, 4 ° C.
- Retirez le surnageant très doucement en pipettant également. Utiliser des pipettes de petit volume si nécessaire de retirer tout le liquide à l’extérieur de la pastille.
- Ajouter la sonde oligonucléotide valeur solution mère l’aliquote de tampon d’hybridation afin que la concentration finale d’oligonucléotide est de 250 nM ; vortex vigoureusement.
Remarque : On peut marquer deux ou plusieurs ARNm cible différents à la fois dans la même cellule. Ensembles de sonde de ces deux objectifs s’ajoute le tampon d’hybridation. Il faut choisir des colorants ayant différents spectres d’émission pour réduire au minimum le chevauchement spectral (p. ex., Cy3 et Cy5). S’assurer que les échantillons destinés à l’imagerie de la tempête sont hybridés avec une sonde d’oligonucléotides conjuguée avec un colorant néc STORM (par exemple, dans la table des matières). - Suspendre les échantillons (voir étape 5.4) dans 50 µL de tampon d’hybridation qui contient les sondes oligonucléotidiques, tout en évitant la production de bulles (la solution est assez visqueuse).
- Laisser une nuit échantillons sur un bloc chaud à 30 ° C dans l’obscurité.
NOTE : Suite à cela, les échantillons peuvent être conservés pendant 6 mois à 4 ° C.
6. laver
- Utiliser un tube de microcentrifuge nouveau pour chaque échantillon d’image. Ajouter 1 mL de tampon de lavage.
- Ajouter 10 à 15 µL des échantillons hybride dans le nouveau tube qui contient le tampon de lavage et de mix/vortex.
- Culot de cellules par centrifugation pendant 7 min, 750 g de x à 4 ° C. Retirez le surnageant.
Remarque : Pour réduire le fond, incuber pendant 1 heure à 30 ° C. - Laver deux fois plus (resuspendre dans 1 mL de tampon de lavage, centrifuger et enlever la pastille).
- Resuspendre dans 25 µL de tampon de lavage.
Remarque : Afin de réduire une photo-blanchiment pouvez ajouter au tampon de lavage un oxygène nettoyage système (2,6) pour améliorer la stabilité de la teinture en single-molecule fluorescence expériences6.
7. préparation des échantillons pour l’imagerie
Remarque : Les cellules ont besoin d’être immobilisé afin de permettre la bonne imagerie sous un microscope à fluorescence et contraste de phase. Les méthodes suivantes peuvent servir à préparer les échantillons dans lesquels les différents champs de vision peut être photographiées à différents plans focaux.
- Préparation du gel d’agarose
- Ajouter 150 mg d’agarose à 10 mL 2 x SSC de tampon. N’ajoutez pas de 2 x SSC sur gel d’agarose, sinon il se dissoudra pas correctement.
- Cuire au four pendant 10-15 s chaque fois jusqu'à ce que les grosses bulles commencent à se former. Mis de côté pour laisser refroidir pendant quelques minutes.
- Poser un cadre de silicone séparant sur la diapositive afin que le centre de la diapositive reste exposé.
- Placez un anneau rigide de 10 mm (1-2 mm d’épaisseur) de l’échelle au centre de la diapositive et déposez une petite quantité de gel dans ce document, pour l’étanchéité. Attendez quelques minutes pour lui à se durcir.
- Ajouter plus de gel jusqu'à forme une forme de dôme élevé. Attendre 10 min pour elle à se durcir et enlever l’anneau (à l’aide de pinces fines ou toute autre méthode).
- Déposer environ 10 μL de cellules bactériennes lavées (voir 6.5) sur le gel et le joint avec une lame de lamelle #0.
- Préparation des échantillons pour smFISH chambre
- Vous pouvez également (à l’étape 7.1) préparer les échantillons pour l’imagerie par les cellules bactériennes lavées (voir 6.5) sur verre enduits poly-D-lysine bas jetable en plastique Pétri de l’immobilisation.
- Incuber les échantillons dans l’obscurité, à température ambiante, pendant la nuit avant la visualisation pour permettre l’adhérence des cellules à la surface. Avant visualisation laver une fois avec le tampon de lavage (. 5) ; conserver l’échantillon humide avec du tampon de lavage buffer(2.5) ou imagerie pour smFISH (2,6).
- Préparation d’échantillons de chambre pour STORM
- Préparer les échantillons pour STORM pour l’imagerie sur verre enduits poly-D-lysine bas jetable en plastique Pétri.
- Incuber les échantillons dans l’obscurité, à la droite, jusqu’au lendemain. Avant lavage visualisation une fois avec le tampon de lavage pour smFISH (2.5) ; et ajouter le tampon d’imagerie pour STORM (2.7.5).
8.Visualisation de la transcription
- Image de cellules avec un microscope à fluorescence grand-angulaire équipé d’une platine motorisée (voir table des matières).
Remarque : Pour la modification de la tempête, utiliser les cellules marqués par un agent capable de multiples cycles d’émission de fluorescence. L’échantillon à l’aide du système d’imagerie 3D Super-resolution d’image (par exemple, voir la table des matières). - Utilisation (recommandée) une 60-100 x N.A > 1,3 huile d’immersion phase contraste lentille d’objectif avec une forte source de lumière, tel qu’un mercure ou la lampe à halogénures métalliques ; Sources lumineuses à base de LED sont également recommandés.
- Utilisation d’une norme refroidi par caméra CCD, idéalement optimisé pour une faible luminosité imagerie niveau plutôt qu’à vitesse (nous utilisons une caméra avec 16 µm taille de pixel) (voir la table des matières).
Remarque : L’utilisation d’une EMCCD refroidi (électrons multipliant à dispositif de couplage de charge) caméra CCD est nécessaire pour réduire le bruit thermique qui empêche la détection, en particulier des molécules simples. - Utiliser le filtre définit approprié pour les fluorophores choisis.
- Pour déterminer correctement les limites d’une cellule, acquérir des images de différents champs de vision dans chaque échantillon avec optique de contraste de phase, soit par marquage fluorescent de la membrane externe de la cellule. Acquisition d’images à différents plans focaux (z-pile) pour tous les canaux (habituellement 13 tranches séparant par 250 nm sont prises).
Remarque : La platine motorisée de la loupe et les jeux de filtres doit être commandé par commercial (voir table des matières) ou un logiciel interne qui permet de capturer une pile d’images dans l’ordre.
9. analyse des données
- Convertir les piles d’image en un format approprié pour l’analyse des données.
- Estimer le nombre de copies de la cible ADN messagère de l’intensité totale des foyers fluorescents dans la cellule, plutôt que de comptage discrets « points » comme dans d’autres protocoles actuellement disponibles.
- Effectuer des analyses de l’image avec le logiciel open-source18 ou avec un programme sur mesure. Pour plus d’informations, de données d’imagerie et d’analyse voir Skinner et al. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nous avons effectué des mesures de smFISH de galK et sodB transcrits en cellules d’Escherichia coli . Les transcriptions ont été hybridées avec un ensemble de séquences spécifiques complémentaires de la séquence cible, chaque sonde étant conjugué à une seule molécule fluorescente (voir table des matières). La fluorescence et la phase de contrastent des images de MG1655 sauvage (WT) de la souche e. coli ou d’une souche de galK-supprimé de JW0740 (collection de Keio)19 (ΔgalK) ont été exposés à 2 mM D-fucose sont indiquées dans la Figure 1 a et 1 b. Les cellules ont été fixées au moins 3 h après l’exposition au D-fucose. Les panneaux à la Figure 1 a (haut) montrent une image sur 13, correspondant à la hauteur au cours de laquelle les contours de la cellule sont en bref, ce qui représente le niveau d’induction galK en réponse à des concentrations variables de D-fucose extracellulaires. Spots à l’intérieur des cellules dans les images de fluorescence correspondent aux deux transcriptions galk simple ou peu, et déterminer le nombre de transcription dans chaque cellule s’effectue en quantifiant la fluorescence localisée. Nombreuses taches sont visibles dans la plupart des cellules, lorsque 2 mM D-fucose est ajoutée à la culture bactérienne, alors que quelques taches apparaissent en l’absence du D-fucose extracellulaire. Dans la souche degalK Δ sans taches sont observées sur le fond comme prévu. Surface de marquage avec le marqueur fluorescent lipophile est montré l' Figure 1 b (en bas).
En outre, nous imagés les transcriptions sodB en culture bactérienne Escherichia coli cultivées dans un milieu LB dans la phase de croissance logarithmique. Fluorescence et des images de contraste de phase de smFISH WT ou une souche de sodB-supprimé JW1648 (collection de Keio)19 (ΔsodB) sont indiquées dans la Figure 2 a. Les panneaux l' Figure 2 a (haut) montrent une image sur 13, correspondant à la hauteur à laquelle cellule contours sont en discussion, représentant le niveau de sodB. Dans la lignée desodB Δ, aucuns taches ne sont observées sur le fond, comme prévu.
Les cultures de mêmes ont été photographiés par STORM (en haut) et les périmètres des cellules ont été déterminés avec surface de marquage à l’aide d’un marqueur fluorescent lipophile pour illustrer la localisation de sodB dans les cellules. La coloration de la membrane permet un positionnement précis des transcriptions dans la cellule (Figure 2 b). La souche desodB Δ a été prise que le signal de fond et pour déterminer la taille de cluster minimale (voir la Figure 2 b). Le nombre moyen de transcription de smFISH2 et de la tempête est comparable.
Figure 1 : effets du D-fucose sur galK transcriptions visualisées à l’aide de smFISH. (A) haut de la page : smFISH images de fluorescence de galK ARNm chez les e. coli cellules. Une souche MG1655 de type sauvage (WT) ou une JW0740 (collection de Keio) galK -supprimé souche (ΔgalK)19 ont été cultivées avec ou sans 2 mM D-fucose. Les transcriptions de galK ont été hybridées à sondes complémentaires conjugués avec un colorant optiquement équivalent à Cy3 (voir table des matières). En bas : même champs de vision en contraste de phase. (B) les cellules WT ont été cultivées avec ou sans 2 mM D-fucose comme ci-dessus et étiquetées avec 2 μM d’une membrane lipophile colorant (voir table des matières) pendant 20 min avant la fixation. Haut : images de fluorescence de galK ARNm en utilisant smFISH. Des images ont été prises avec un microscope contrôlé par un logiciel commercial à l’aide d’une lentille d’objectif 100 × 1,45 N.A huile d’immersion phase contraste (voir table des matières) et une caméra EMCCD (voir table des matières). Les filtres utilisés étaient tel que décrit dans le tableau des matériaux. Une image de contraste de phase a été acquis suivie d’une z-pile de 13 tranches et espacement des 250 nm d’images fluorescentes avec 2 temps d’intégration de s pour chaque tranche. Au milieu : même champs de vision avec l’imagerie de contraste de phase. En bas : cellules marquées avec des marqueurs fluorescents lipophiles, avec des filtres appropriés décrits dans le tableau des matériaux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : imagerie de sodB transcriptions étiquetées avec la même sonde figurant aux smFISH et tempête. (A) haut de la page : smFISH images de fluorescence du sodB ARNm chez les e. coli cellules. Une souche MG1655 de type sauvage (WT) ou une JW1648 (collection de Keio) sodB -supprimé souche (ΔsodB)19 ont été cultivées dans un milieu LB. Les transcriptions sodB ont été hybridées à sondes complémentaires conjugués avec un colorant optiquement équivalent à Cy5 (voir table des matières). En bas : même champs de vision en contraste de phase. (B) superposition de molécules fluorescentes (points colorés individuels) localisée par la tempête (émission de 670 nm) et une capture instantanée des membranes cellulaires dans le même champ de vision. Les cellules sont marquées avec un colorant lipophile, excité par un laser à argon à 488 nm à 1 % de la puissance maximale (0,05 kW/cm2) avec un pic d’émission à 510 nm et imagés avec le filtre (voir la table des matières). Les cellules WT et sodB étaient cultivés comme décrit ci-dessus et étiquetés avec un 2 membrane lipophiles μM teindre (voir table des matières) pendant 20 min avant la fixation. Super-résolution images ont été enregistrées avec un microscope commercial (voir table des matières). Transcriptions étiquetées avec un colorant optiquement équivalent à Cy5 ont été localisées à l’aide d’un laser d’excitation à 647 nm dans un tampon d’imagerie pour l’orage. Des images ont été enregistrées à l’aide d’un 60 x, objectif à immersion d’eau NA 1.2 (voir table des matières) et une caméra EMCCD (voir table des matières) avec gain fixé à 50, fréquence à 50 Hz et la puissance maximale de 647 et 405 nm lasers fixé à 5 et 0,05 kW/cm2 d’image , respectivement. Le nombre total d’images acquises était de 8 000. Données ont été analysées à l’aide d’un logiciel commercial (voir Table des matières). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans notre laboratoire, nous avons mesuré le nombre de transcription des gènes dans les cellules d’Escherichia coli à l’aide de la méthode de smFISH2. En bref, cette procédure se compose des étapes suivantes : fixation cellulaire, perméabilisation des membranes permettant la pénétration de la sonde, sonde d’hybridation et déguster d’imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence standard. Cette procédure est basée sur celles déjà publiées avec quelques modifications6,7,16. Il a été précédemment signalé que cette smFISH requiert que le nombre de sondes oligonucléotidiques se situent dans la gamme de 48-72, afin d’obtenir un signal située bien au-dessus du fond7. Nous avons démontré que ce nombre peut être effectivement plus petite20selon la séquence du gène d’intérêt, la configuration optique et des conditions expérimentales spécifiques.
Chaque sonde devrait être 17-22 nucléotides de long, avec une séparation inter-sonde d’au moins deux nucléotides et un contenu en GC de ~ 45 %, afin de réduire les effets non spécifiques, hors cible obligatoire. Certaines sondes risquent de ne pas se lier à une cible, et l’efficacité globale de liaison peut être optimisée par des modifications de procédures expérimentales telles que les conditions de fixation et l’hybridation21. Un facteur important qui doit être pris en compte est le choix des fluorophores. Il est fortement recommandé d’étiqueter les sondes avec un colorant présentant une sensibilité faible au photo-blanchiment. Photo-blanchiment minimisation est possible par l’optimisation du temps d’exposition, les sources d’illumination et temps d’intégration d’acquisition d’images et par l’addition d’un oxygène nettoyage système.
L’étendue de liaison non spécifique des événements doit être évaluée en réalisant des expériences de smFISH avec des cellules souches à quelle cible gènes sont supprimés, par exemple de la collection de Keio19. Si le signal de fond est élevé, le nombre et la durée des étapes de lavage doivent être augmentés, ou cellules doivent être incubés dans le tampon de lavage à 30 ° C pendant 1 h et ensuite lavés deux fois. En outre, pour réduire le fond, il est suggéré d’optimiser la concentration de formamide (ratio de 10 à 40 % v/v) dans l’hybridation et les tampons de lavage. Augmentation de la concentration de formamide réduit la liaison non spécifique, mais peut aussi réduire la liaison des sondes à la cible ADN messagère. Durant l’étape d’hybridation, il est important d’éliminer le surnageant entièrement ; un tampon d’hybridation diluées peut-être entraîner diminue l’efficacité de l’étiquetage. En outre, les ARN cibles doit être suffisamment longue afin d’obtenir un endroit bien localisé au-dessus de fond. Des améliorations récentes dans signal bruivent ratio et contraignant spécificité par modification de la colonne vertébrale des sondes maintenant faire il est possible de détecter l’ARN plus court fragments, comme microARN eucaryotes ou bactérienne petite non-codage RNAs2, 10. nous recommandons que le nombre de copies moyennes obtenu par smFISH doit être validé par quantitative PCR7,16.
Dans ce manuscrit, nous avons montré que cette méthode peut être modifiée avec des modifications mineures d’étudier la localisation des transcriptions chez e. coli avec une résolution optique supérieure à l’aide de reconstruction optique stochastique microscopie (tempête)11.
En résumé, le smFISH est une méthode polyvalente pour l’éclairage de RNA qui permet la mesure directe de la variabilité de la cellule-cellule nombre de transcription et de la localisation des transcriptions de la cible dans la cellule, les eucaryotes et les procaryotes. Il fournit des renseignements quantitatifs sur les processus fondamentaux d’expression de gène et peut être facilement mis en œuvre pour l’imagerie de la tempête.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation Science Israël 514415 (à J.S.) et une subvention de la BSF-NSF (MCB) 2016707 (à J.S.). Support de Siegfried et Irma Ullman chaire professorale (à J.S.) est également reconnu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker - Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen - Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 - 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24x60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa | |||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa |
References
- Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601 (2014).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
- van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
- Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628 (2014).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
- van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
- Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
- Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
- So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
- Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
- Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).
