Summary
Este manuscrito descreve um método para a rotulagem individual RNA mensageiro (mRNA) transcrições com fluorescente-etiquetadas sondas de DNA, para uso em único-molécula fluorescência em situ (smFISH) as experiências de hibridação em e. coli. smFISH é um método de visualização que permite a deteção simultânea, localização e quantificação de simples moléculas de mRNA em células individuais fixas.
Abstract
Um método é descrito para a rotulagem individual RNA mensageiro (mRNA) transcritos em bactérias fixas para uso em único-molécula fluorescência em situ (smFISH) as experiências de hibridação em e. coli. smFISH permite a medição de célula para célula variabilidade no número de cópia de mRNA de genes de interesse, bem como a Localização subcellular de transcrições. As principais etapas envolvidas são a fixação da cultura de pilha bacteriana, permeabilização de membranas celulares e a hibridação de transcrições o alvo com conjuntos de sondas comercialmente disponível do oligonucleotide fluorescente-etiquetadas curto. smFISH pode permitir que a imagem da transcrição de genes múltiplos na mesma cela, com limitações impostas pela sobreposição espectral entre diferentes marcadores fluorescentes. Após a conclusão do protocolo ilustrado abaixo, células podem ser prontamente fotografadas usando um microscópio acoplado com uma câmera apropriada para fluorescência de baixa intensidade. Estas imagens, juntamente com contornos de células obtidas a partir de segmentação de quadros de contraste de fase ou coloração de membrana celular, permitem o cálculo da distribuição número da cópia do mRNA de uma amostra de células usando o software de código-fonte aberto ou personalizada. O método de rotulagem descrito aqui também pode ser aplicado a transcrições de imagem com microscopia de reconstrução óptica estocástico (Tempestade).
Introduction
Sem rumo é um aspecto fundamental e inevitável da expressão genética e dá origem a célula-célula heterogeneidade1, tanto a nível de proteínas e transcrições de2,3. Quantificar a variabilidade entre as células sob condições bem definidas oferece uma única janela para os processos básicos que fundamentam a expressão dos genes e sua regulação. Uma importante fonte de heterogeneidade celular em bactérias ocorre no nível transcricional. Transcrição de números variam não apenas devido o crescimento da transcrição, mas também para processos pós-transcricional como regulamento por pequenos RNAs e RNAases2. Uma maneira de acessar diretamente esta heterogeneidade de forma quantitativa é por marcação fluorescente transcrições individuais de um determinado gene em smFISH. Esta metodologia permite a detecção e Localização subcellular de moléculas de RNA específicas no fixo, as células bacterianas individuais4. mRNAs são cruzados com um conjunto de fluorescente-etiquetadas ~ 20 base-long oligonucleotides que são projetados para ligar-se selectivamente para transcrições de interesse5,6. Múltiplas rotulagem garante deteção acima da fluorescência do fundo, e moléculas de mRNA individuais aparecem como manchas de difração limitada sob um microscópio de fluorescência7 (Ver Figura 1). Existem outras abordagens para a rotulagem de moléculas de mRNA, em que as sondas complementares oligómero carregam haptens conjugados (por exemplo, biotina ou Digoxigenina) que são detectados usando secundário fluorescente-etiquetadas repórter técnicas8.
Existem outros métodos que fornecem informações quantitativas sobre as transcrições, além de smFISH. Alguns, como a Northern blot ou PCR quantitativo, a maior parte da ponta de prova e, portanto, pode medir o número de cópias do mRNA, nem sua posição em células individuais. Portanto, esses métodos não são adequados para quantificar a variabilidade de célula para célula. Desenvolveu uma técnica baseada em imagem recente que permite a quantificação de tanto o número de cópia de RNAs dentro das células, bem como sua localização intracelular, chamado multiplexado fluorescência erro-robusto em situ da hibridação (MERFISH). MERFISH baseia-se na atribuição de um código de barras exclusivo composto por uma combinação definida de um número fixo de pontas de prova do oligonucleotide fluorescente-etiquetadas. Esses códigos de barras são lidos nas rodadas sequenciais das medições de smFISH, com fotobranqueamento seguinte cada rodada de hibridação, aumentando assim a taxa de transferência por duas ordens de magnitude9,10. Esta técnica exige um fluido automatizado, manipulação de sistema e o projeto apropriado do conjunto de sonda.
A combinação de vários fluorescência rotulagem de transcrições individuais, juntamente com técnicas de super-resolução romance como reconstrução óptica estocástico microscopia (Tempestade)11, permite um aumento de dez vezes na resolução na Localização subcellular das transcrições. Na tempestade, uma combinação adequada de sondas fluorescentes e buffer de imagem permite múltiplos ciclos de emissão de fluorescência por molécula de sonda (piscando). TEMPESTADE também pode ser usado para a imagem da transcriptoma de Escherichia coli e observar a organização espacial de todo o genoma de RNA, pela rotulagem simultaneamente todas as transcrições de interesse12.
Todos os métodos de célula única revistos acima baseiam-se na imagem transcritos em células fixas. Portanto, eles não fornecem todas as informações sobre as propriedades cinéticas de transcrições dentro das células. A seguir transcritos em células vivas13, mRNAs podem ser rotulados pela fusão do gene de interesse para uma matriz de binding sites. Estes últimos são então reconhecidos por uma RNA-proteína, tais como o bacteriófago MS2 proteína de casaco, que é fundido a uma proteína fluorescente, tais como a proteína verde fluorescente (GFP)10,14,15.
Aqui nós descrevemos um método para rotular os mRNAs individuais com um conjunto de fluorescente-etiquetadas sondas de DNA, para uso em experimentos de smFISH, em particular em e. coli. Além disso, mostramos que o mesmo esquema de rotulagem pode ser utilizado para as medições de tempestade com pequenas modificações.
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Protocol
1. sonda Design
Nota: Este protocolo utiliza sondas comercialmente disponível do oligonucleotide já marcadas com fluorophores. As sondas consistem de um conjunto de sequências específicas complementares para um destino de mRNA, cada sonda ser conjugada com uma molécula fluorescente. Alternativamente, é possível anexar marcadores fluorescentes para sondas, conforme descrito em outro lugar5,16.
- Sondas de smFISH de projeto usando o algoritmo de16 sonda Designer desenvolvido por Arjun Raj (van Oudenaarden laboratório, Massachusetts Institute of Technology); sequências de sondas de smFISH usadas neste manuscrito estão listadas na tabela de materiais.
Nota: O número mínimo de testes em um conjunto para um sinal detectável é ~ 30. O número exato pode variar de acordo com o gene de interesse, particularmente se medem-se as transcrições muito curtas. - Escolha uma tintura que se encaixa o setup óptico (ver tabela de materiais).
Nota: A tintura de Cy3 ou uma tinta opticamente equivalente com uma baixa susceptibilidade ao foto-clareamento é altamente recomendada. Um candidato para a rotulagem dual é Cy5 ou um opticamente equivalente tingir (ver tabela de materiais). Corantes adequados para a imagem latente de tempestade de mRNA rotulado caracterizam-se pela capacidade de vários ciclos de emissão de fluorescência. Alguns corantes smFISH podem ser usados para a imagem latente de tempestade (ver tabela de materiais). Para transcrições de dois (ou mais) correspondente aos genes diferentes na mesma célula de imagem, deve-se escolher pontas de prova do oligonucleotide conjugadas com corantes cujos espectros têm pouca ou nenhuma sobreposição.
2. preparação do reagente
Nota: É importante para manter as amostras RNAse-livre utilizando consumíveis RNase-livre como pontas de pipetas filtrada e tubos e de manter qualquer ambiente de trabalho limpo. A fim de evitar a degradação de transcrições do alvo, todos os reagentes utilizados após fixação da pilha devem ser livre de nuclease (ver tabela de materiais) ou diethylpyrocarbonate (DEPC)-tratados e esterilizados.
- Buffers para smFISH
- Prepare-se livre de RNase 1X PBS (solução salina tamponada fosfato, solução com uma concentração de tampão fosfato 0,01 m e uma concentração de cloreto de sódio de 0,154 M, (pH 7,4)). Diluir o PBS de 10x RNase-livre (veja a tabela de materiais) em nuclease-livre da água (veja a tabela de materiais) em um 01:10 relação v/v.
- Alternativamente, preparar tratada com DEPC 1 x PBS.
- Preparar a RNase-livre 2 x SSC (tampão de citrato de sódio-solução salina, 0,3 M NaCl em citrato de sódio 0,03 M, (pH 7.0)). Diluir a RNase-livre 20 x SSC (ver tabela de materiais) em água livre de nuclease a um 01:10 relação v/v.
- Em alternativa, preparar 2 DEPC tratada x SSC.
- Prepare-se livre de RNase 1X PBS (solução salina tamponada fosfato, solução com uma concentração de tampão fosfato 0,01 m e uma concentração de cloreto de sódio de 0,154 M, (pH 7,4)). Diluir o PBS de 10x RNase-livre (veja a tabela de materiais) em nuclease-livre da água (veja a tabela de materiais) em um 01:10 relação v/v.
- Solução estoque da ponta de prova do oligonucleotide.
- Re-dissolver a mistura de sonda do oligonucleotide secas em 200 µ l de tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) para criar um estoque de sonda de 25 µM. Mix bem por pipetagem para cima e para baixo e então o vórtice e centrífuga brevemente.
- Para evitar o congelamento e descongelamento do tubo solução estoque, fazer várias alíquotas da solução-mãe, correspondente ao montante esperado para ser usado em um único experimental executado. Armazenar a solução estoque a-20 ° C ou abaixo e proteger da luz.
Nota: Um conjunto de sonda de 5 nmol pode fornecer até 250 reacções de hibridização.
- Tampão de hibridização (Skinner et al a seguir 7 ):
- Adicione 5 mL de água livre de nuclease para um tubo de fundo cónico polipropileno de 50 mL. Adicionar 1 g de sulfato de dextran para a água e dissolvê-lo por vigorosa num Vortex. Misture o conteúdo em um agitador orbital até que as bolhas desapareçam (~ 30 min).
- Adicione o μl de solução 3.530 de formamida deionizada, 10 mg de Escherichia coli tRNA, 1 mL de 20x SSC, 100 µ l de 200mm vanadil-ribonucleoside complexo e 40 µ l de 50 mg/mL BSA. Trazer o volume final de 10 mL por adição de água tratada DEPC ou água livre de nuclease e vórtice a solução até que esteja homogêneo.
Nota: Para evitar o congelamento e descongelamento da solução, fazer várias alíquotas da solução-mãe, correspondente ao montante esperado para ser usado em um único experimental executado. Armazenar a solução estoque a-20 ° C. Certifique-se de deixar o formamide quente à temperatura ambiente antes de abrir a garrafa. Para reduzir o plano de fundo, é aconselhável para calibrar a concentração ideal de formamida (proporção de 10-40% v/v).
Atenção: AVISO! Formamida é altamente tóxica e um teratógeno conhecido. Evite contato com os olhos ou pele, inalação ou ingestão. Lidar com isso sob uma coifa, enquanto vestindo um jaleco e luvas protetoras. - Esterilize a solução por passagem através de um filtro de 0,22 µm. Manter em alíquotas e armazenar a-20 ° C até um ano.
- Preparar o tampão de fixação (4,6% de formaldeído em 1X PBS) adicionando formol 37% (v/v) de 1X PBS (ver 2.1.1) em uma relação de v/v de 1:8 e vortex.
ATENÇÃO: AVISO! O formaldeído é altamente tóxico e um conhecido agente cancerígeno. Lidar com isso sob uma coifa, enquanto vestindo um jaleco e luvas protetoras. - Preparar o tampão de lavagem para smFISH (formamida 20% em 2 x SSC), adicionando formamida deionizada para 2 x SSC (Veja 2.1.2) para uma relação de v/v de 1:4 e vórtice.
- Preparar o buffer de imagem para smFISH adicionando 5mm cisteamina e oxigênio necrófagos (7 µM glicose oxidase, catalase de nM 56 e glicose 10% (p/v)) para lavar o tampão (20% formamida em 2 x SSC)
- Amortecedores para a tempestade
- Prepare o tampão A adicionando 50 mM Tris-HCl e 10 mM de NaCl a água livre de nuclease.
Nota: Loja em RT por anos. - Prepare Buffer B, acrescentando 50 mM Tris-HCl 10 mM NaCl e 10% p/v glucose para água livre de nuclease.
Nota: Loja a 4 ° C por até um ano. - Prepare o tampão MEA dissolvendo cisteamina 77 mg em 1 mL de tampão A (faz uma solução 1 M).
Nota: Pode ser armazenado a 4 ° C para 1 mês. - Prepare o buffer de Gloxy, acrescentando 8.440 AU (unidades arbitrárias) glicose oxidase e 70.200 catalase AU a 1 mL de buffer A.
Nota: Faz 50 x solução-mãe, pode ser armazenado a 4 ° C para 1 mês. - Prepare o buffer de imagem para tempestade, acrescentando 50 mM de tampão MEA e 1 x B. buffer para buffer de Gloxy
Nota: O buffer de imagem de tempestade é composto de 5 mM cisteamina, catadores de oxigênio (7 µM glicose oxidase e catalase de nM 56) em 50 mM Tris com 10 mM de NaCl e 10% de glicose em pH 8.0. Prepare-se antes de imagem, pode ser armazenado e usado em RT para aproximadamente 2 h.
- Prepare o tampão A adicionando 50 mM Tris-HCl e 10 mM de NaCl a água livre de nuclease.
3. amostra fixação
- Desenvolvem-se células bacterianas (por exemplo, E.
Nota: Para determinar o fundo devido à ligação não específica das sondas, medições em uma tensão na qual o gene de interesse foi excluído devem ser conduzidas, seguindo os mesmos procedimentos (ver Δgalk na Figura 1 e ΔsodB em A Figura 2).
Nota: Se o microscópio escolhido não tem contraste de fase ou capacidades de contraste de interferência diferencial, membranas externas de e. coli podem ser rotuladas com marcador fluorescente lipofílicos de 2 μM (ver tabela de materiais), que deve ser adicionado para o suspensão bacteriana 20 min antes da fixação17. Fixação e ainda mais o tratamento são realizadas conforme descrito abaixo. Deve ter cuidado para escolher um marcador fluorescente, tendo um espectro de emissão diferente, para minimizar a sobreposição espectral com o conjunto de sonda rotulado.
4. amostra permeabilização
- Remova o sobrenadante com muito cuidado. Use pipetas de volume pequeno, se necessário, para remover todo o líquido fora a pelota.
- Resuspenda em 300 µ l tratada com DEPC água ou água livre de nuclease. Adicione 350 µ l de alto grau etanol absoluto (99%) e misture suavemente por inversão do tubo. Adicione outro 350 μL de etanol e mistura novamente, para chegar a uma concentração final de etanol 70% (relação v/v).
ATENÇÃO: AVISO! Álcool etílico é inflamável. - Girar a amostra com um rotador do tubo a 20 rpm por 1h à temperatura ambiente (RT), ou a 4 ° C durante a noite. As amostras podem ser armazenadas a 4 ° C de uma semana.
5. hibridação
- Pellet de células por centrifugação durante 7 min, 750 x g, 4 ° C. Remova o sobrenadante.
- Adicione 1 mL 20% lavar buffer para as amostras e deixar em repouso durante vários minutos, ou uma pipeta para dissolver o sedimento completamente.
- Pellet de células por centrifugação durante 7 min, a 750 x g, 4 ° C.
- Remova o sobrenadante suavemente pipetando. Use pipetas de pequeno volume, se necessário retirar todo o líquido fora a pelota.
- Adicionar a sonda do oligonucleotide conjunto solução para a alíquota de tampão de hibridização, que a concentração final do oligonucleotide é 250 nM; vórtice vigorosamente.
Nota: Um rotular mRNAs de destino diferente dois ou mais de uma vez na mesma cela. Adicione conjuntos de sonda de ambos os alvos para o tampão de hibridização. Deve ter cuidado para escolher corantes tendo diferentes espectros de emissão para minimizar a sobreposição espectral (por exemplo, Cy3 e Cy5). Certifique-se que a colheita de amostras destinadas para a imagem latente de tempestade é hibridizadas com uma ponta de prova do oligonucleotide conjunto conjugada com um corante apropriado para tempestade (por exemplo, na tabela de materiais). - Suspenda as amostras (ver passo 5.4) em 50 µ l tampão que contém as pontas de prova do oligonucleotide, evitando a geração de bolhas (a solução é bastante viscosa).
- Deixe amostras durante a noite em um bloco quente a 30 ° C, no escuro.
Nota: Em seguida, as amostras podem ser armazenadas por até 6 meses a 4 ° C.
6. lavar roupa
- Use um tubo de microcentrifugadora novo para cada amostra a imagem. Adicione 1 mL de tampão de lavagem.
- Adicione 10 a 15 µ l das amostras hibridizadas de para o novo tubo que contém o tampão de lavagem e mistura/vórtice.
- Pellet de células por centrifugação durante 7 min, 750 x g a 4 ° C. Remova o sobrenadante.
Nota: Para reduzir o fundo, incubar durante 1 h a 30 ° C. - Lavar duas vezes mais (Resuspenda em 1 mL de tampão de lavagem, centrifugação e remover pelota).
- Resuspenda em tampão de lavagem 25 µ l.
Nota: Para reduzir uma foto-branqueamento pode adicionar para o tampão de lavagem um oxigênio eliminação sistema (2.6) para melhorar a estabilidade do corante no único-molécula fluorescência experiências6.
7. preparação de amostras para a imagem latente
Nota: As células precisam ser imobilizados para permitir a adequada imagem sob um microscópio de fluorescência e contraste de fase. Os seguintes métodos podem ser usados para preparar amostras em que os diferentes campos de visão pode ser fotografados em diferentes planos focais.
- Preparação do gel do agarose
- Adicione 150 mg agarose a 10 mL 2 x SSC de tampão. Não adicione 2 x SSC de agarose, senão ele não se dissolverá corretamente.
- Microondas por 10-15 s de cada vez, até grandes bolhas começam a se formar. Deixe para esfriar por alguns minutos.
- Coloca uma moldura de silicone a separação do slide para que o centro do slide continua a ser exposto.
- Coloque um anel rígido largo (1-2 mm de espessura) de 10 mm no centro do slide e depositar uma pequena quantidade de gel, para a selagem. Aguarde alguns minutos para a endurecer.
- Adicione mais gel, até que uma forma de alta cúpula é formada. Espere 10 minutos para ele endurecer e remover o anel (usando uma pinça fina ou qualquer outro método).
- Depósito de ~ 10 μL de células bacterianas lavadas (ver 6.5) sobre o gel e o selo com um slide de lamela #0.
- Preparação da amostra de câmara para smFISH
- Como alternativa (ao passo 7.1) preparar amostras para a imagem latente, imobilizando as lavado as células bacterianas (ver 6.5) em poli-D-lisina-revestido de vidro fundo descartável plástico placas de Petri.
- Incube as amostras no escuro, à temperatura ambiente, durante a noite antes de visualização para permitir a aderência das células à superfície. Visualização antes de lavar uma vez com o tampão de lavagem (. 5); manter a amostra molhada com tampão de lavagem buffer(2.5) ou imagens para smFISH (2.6).
- Câmara de preparação de amostras para a tempestade
- Prepare amostras para tempestade para a imagem latente na poli-D-lisina-revestido de vidro fundo descartável plástico placas de Petri.
- Incube as amostras no escuro, em RT, durante a noite. Antes da lavagem de visualização uma vez com tampão de lavagem para smFISH (2.5); e adicionar o buffer de imagem para tempestade (2.7.5).
8.Visualização de transcrição
- Imagem de células com um microscópio de fluorescência de campo amplo, equipado com um palco motorizado (veja a tabela de materiais).
Nota: Para a modificação de tempestade, use células rotuladas com um corante capaz de vários ciclos de emissão de fluorescência. A amostra usando o sistema da imagem latente 3D Super resolução de imagem (por exemplo, veja a tabela de materiais). - Uso (recomendado) um 60-100x N.D. > 1.3 óleo imersão fase contraste da lente objetiva com uma fonte de luz forte, como um mercúrio ou haleto de metal da lâmpada; Fontes de luz LED-baseado também são recomendadas.
- Uso de um padrão de refrigeração câmera CCD, idealmente otimizada para luz baixa nível de imagem ao invés de velocidade (nós usamos uma câmera com tamanho de pixel 16 µm) (ver tabela de materiais).
Nota: O uso de um EMCCD de refrigeração (elétron multiplicando o dispositivo de carga acoplado) câmera CCD da câmera é necessária reduzir o ruído térmico que impede detecção, particularmente de moléculas simples. - Filtro de uso define apropriado para o fluorophores escolhido.
- Para determinar corretamente os limites da célula, adquira imagens de diferentes campos de visão em cada amostra com óptica de contraste de fase, ou através da marcação fluorescente da membrana celular externa. Adquirir imagens em diferentes planos focais (z-pilha) para todos os canais (geralmente 13 fatias separaram por 250 nm são tomadas).
Nota: A fase motorizada do microscópio e os conjuntos de filtro deve ser controlada por comercial (veja a tabela de materiais) ou software in-house que pode capturar uma pilha de imagens em sequência.
9. análise de dados
- Converta as pilhas de imagem em um formato adequado para análise de dados.
- Estimar o número de cópia do destino de mRNA da intensidade total de focos fluorescentes na célula, em vez de contagem discretos 'pontos', como em outros protocolos disponíveis atualmente.
- Realizar análise de imagem com software open-source18 ou com um programa custom-built. Para detalhes de imagem de dados e análise ver Skinner et al 7
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Representative Results
Realizamos medições de smFISH de galK e sodB transcritos em células de Escherichia coli . As transcrições foram hibridizadas com um conjunto de sequências específicas complementares à sequência alvo, cada sonda ser conjugada com uma molécula fluorescente (ver tabela de materiais). Fluorescência e fase de contraste de imagens de MG1655 selvagem-tipo estirpe de Escherichia coli (WT) ou uma JW0740 (coleção de Keio)19 galK-excluído estirpe (ΔgalK) foram expostos a 2 mM, D-fucose são mostrados na figura 1A e 1B. As células foram fixadas pelo menos 3 h após a exposição ao D-fucose. Os painéis na figura 1A (topo) mostram um quadro de 13, correspondente à altura em que célula contornos estão em foco, que representa o nível de indução de galK em resposta a concentrações variáveis de D-fucose extracelulares. Pontos dentro das células nas imagens de fluorescência correspondem a qualquer único ou poucos galk transcrições, e a determinação do número de transcrição em cada célula é realizada através da quantificação da fluorescência localizada. Numerosos pontos são vistos na maioria das células, quando 2 mM D-fucose é adicionado para a cultura bacteriana, Considerando que alguns pontos são vistos na ausência de D-fucose extracelular. O esforço degalK Δ sem manchas são observadas sobre o fundo como antecipado. Superfície de rotulagem com marcador lipofílico fluorescente é mostrada na figura 1B (parte inferior).
Além disso, nós fotografaram as transcrições de sodB em e. coli cultura bacteriana crescida em meio LB na fase logarítmica de crescimento. Fluorescência e imagens de contraste de fase de smFISH em WT ou uma JW1648 (coleção de Keio)19 sodB-excluído estirpe (ΔsodB) são mostradas na Figura 2A. Os painéis na Figura 2A (topo) mostram um quadro de 13, correspondente à altura em que cela contornos estão em foco, que representa o nível de sodB. Na tensão desodB a Δ, sem manchas são observadas sobre o fundo, como antecipado.
As mesmas culturas foram pelo STORM (topo) e os perímetros das células foram determinados com superfície rotulagem usando um marcador fluorescente lipofílico para ilustrar a localização do sodB dentro das células. Coloração da membrana permite o posicionamento exato de transcritos na célula (Figura 2B). A tensão desodB Δ foi tomada como o sinal de fundo e para determinar o tamanho do cluster mínimo (ver Figura 2B). O número médio de transcrição de smFISH2 e tempestade é comparável.
Figura 1: efeitos do D-fucose na galK transcrições visualizado usando smFISH. (A) Top: smFISH imagens de fluorescência de galK mRNA em individuais de e. coli células. Uma estirpe do selvagem-tipo MG1655 (WT) ou um JW0740 (coleção de Keio) galK -excluído estirpe (ΔgalK)19 foram cultivadas com ou sem 2 mM D-fucose. As transcrições de galK foram hibridizadas com sondas complementares, conjugadas com uma tinta opticamente equivalente a Cy3 (ver tabela de materiais). Fundo: mesmo campos de visão em contraste de fase. (B) células WT foram cultivadas com ou sem 2 mM D-fucose como acima e rotuladas com 2 μM de membrana lipofílica tingir (veja a tabela dos materiais) por 20 min antes da fixação. Top: imagens de fluorescência de galK mRNA usando smFISH. Imagens foram tiradas com um microscópio, controlado por um software comercial usando uma lente 100 × N.D. 1.45 óleo imersão fase contraste objetiva (ver tabela de materiais) e uma câmera EMCCD (ver tabela de materiais). Os filtros usados foram conforme descrito na tabela de materiais. Uma imagem de contraste de fase foi adquirida, seguido por uma z-pilha de 13 fatias e espaçamento de 250 nm de imagens fluorescentes com 2 s tempo de integração para cada fatia. Médio: mesmo campos de visão com imagens de contraste de fase. Fundo: células rotuladas com marcadores fluorescentes lipofílicos, com filtros adequados descritos na tabela de materiais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: imagem de sodB transcrições rotuladas com a mesma sonda definida em smFISH e STORM. (A) Top: smFISH imagens de fluorescência de sodB mRNA em individuais de e. coli células. Uma estirpe do selvagem-tipo MG1655 (WT) ou um JW1648 (coleção de Keio) sodB -excluído estirpe (ΔsodB)19 foram cultivadas em meio LB. As transcrições de sodB foram hibridizadas com sondas complementares, conjugadas com uma tinta opticamente equivalente a Cy5 (ver tabela de materiais). Fundo: mesmo campos de visão em contraste de fase. (B) sobreposição de moléculas fluorescentes (pontos coloridos individuais) localizados pela tempestade (emissão de 670 nm) e um instantâneo das membranas celulares no mesmo campo de visão. As células foram rotuladas com um corante lipofílico, animado com um laser de argônio em 488 nm a 1% da potência máxima (0,05 kW/cm2), com um pico de emissão em 510 nm e fotografada com o apropriado filtro (ver tabela de materiais). WT e sodB células foram crescidas como descrito acima e rotuladas com um 2 membrana lipofílicos μM tingir (veja a tabela dos materiais) por 20 min antes da fixação. Super-resolução imagens foram gravadas com um microscópio comercial (veja a tabela de materiais). Transcrições rotuladas com uma tinta opticamente equivalente a Cy5 foram localizadas usando um laser de excitação em 647 nm em um buffer de imagem para a tempestade. Imagens foram gravadas usando um x 60, at 1.2 objectivo de imersão de água (ver tabela de materiais) e uma câmera EMCCD (ver tabela de materiais) com ganho de 50, frame taxa em 50 Hz e potência máxima de 647 e 405 nm laser fixado em 5 e 0,05 kW/cm2 , respectivamente. O número total de quadros adquiridos foi 8.000. Dados foram analisados utilizando o software comercial (veja a tabela de materiais). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Medimos em nosso laboratório o número de transcrição de diferentes genes em células de Escherichia coli usando o smFISH método2. Em breve, este procedimento consiste das seguintes etapas: fixação da pilha, permeabilização de membranas para permitir a penetração da sonda, sonda de hibridização e amostra de imagem usando um microscópio de fluorescência padrão. Este procedimento baseia-se os publicados anteriormente, com algumas modificações6,7,16. Tem sido relatado anteriormente que o smFISH requer que o número de pontas de prova do oligonucleotide mentir na faixa de 48-72, para alcançar um sinal de mentir bem acima do fundo7. Mostramos que esse número pode ser realmente menor20, dependendo da sequência do gene de interesse, a configuração óptica e as condições experimentais específicas.
Cada sonda deve ser 17-22 nucleotídeos de comprimento, com uma separação de sonda Inter de pelo menos dois nucleotídeos e um conteúdo GC de ~ 45%, a fim de reduzir os efeitos da não-específica, o alvo vinculação. Alguns testes podem falhar vincular a um alvo, e a eficiência global de vinculação pode ser otimizada por modificações de procedimentos experimentais, tais como as condições de fixação e hibridação21. Um fator importante que deve ser levado em conta é a escolha de fluorophores. É altamente recomendável para rotular as sondas com um corante com baixa susceptibilidade ao foto-clareamento. Minimização de foto-branqueamento pode ser alcançada pela otimização de tempos de exposição, fontes de iluminação e momentos de integração, de aquisição de imagem e pela adição de um sistema de eliminação de oxigênio.
A extensão dos eventos de ligação não-específica deve ser avaliada por realizar experiências smFISH com células de tensões no qual destino genes são excluídos, por exemplo a coleção de Keio19. Se o sinal de fundo é alto, o número e a duração das etapas de lavagem devem ser aumentados, ou células devem ser incubadas em tampão de lavagem a 30 ° C, durante 1 h e então lavadas duas vezes. Além disso, para reduzir o plano de fundo, sugere-se para otimizar a concentração de formamida (proporção de 10-40% v/v) na hibridização e os buffers da lavagem. Aumentando a concentração de formamida reduz a ligação não específica, mas também pode reduzir a ligação de sondas para o destino de mRNA. Durante a etapa de hibridação, é importante remover o sobrenadante inteiramente; um tampão diluído pode levar à diminuição da eficiência de rotulagem. Além disso, o destino RNAs deve ser suficientemente longo para se obter um ponto bem localizado acima do fundo. Recentes melhorias no sinal-ruídom rácios e vinculação especificidade através da modificação de espinha dorsal das sondas agora fazem possível detectar o RNA mais curto fragmentos, como microRNAs eucarióticas ou bacterianas pequenas não-codificantes RNAs2, 10. recomenda-se que o número de cópia média obtido por smFISH deve ser validado com quantitativo PCR7,16.
Mostramos neste manuscrito que este método pode ser modificado com pequenas alterações para estudar a localização de transcrições em e. coli com maior resolução óptica usando estocástico reconstrução óptica microscopia (Tempestade)11.
Em resumo, o smFISH é um método versátil para iluminação de RNA que permite a medição directa da variabilidade no número de transcrição celular e a localização de transcrições de alvo na célula, em procariontes e eucariontes. Fornece informações quantitativas sobre processos básicos de expressão de gene e pode ser facilmente implementado para a imagem latente de tempestade.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por um Israel Science Foundation grant 514415 (J.S.) e uma subvenção de BSF-NSF (MCB) 2016707 (a J.S.). Suporte de Siegfried e Irma Ullman professoral cadeira (J.S.) também é reconhecida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker - Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen - Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 - 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24x60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
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| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
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References
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