Summary
Bu el yazması ile DNA probları fluorescently etiketli tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar etiketleme yöntemi açıklar. smFISH eş zamanlı algılama, Yerelleştirme ve miktar tek mRNA molekülleri sabit tek tek hücreleri içinde izin veren bir görselleştirme yöntemidir.
Abstract
Bir yöntem bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için sabit bakterilerde etiketleme için tanımlanır. smFISH mRNA kopya numarası ilgi genlerin hücre hücre değişkenlik ölçümü transkriptleri hücre altı konumunu sağlar. Ana adımları bakteriyel hücre kültürü fiksasyonu, hücre zarları permeabilization ve hedef transkript hibridizasyon setleri ile piyasada kısa Oligonükleotid fluorescently etiketli probları vardır. smFISH farklı floresan işaretleri arasında spektral örtüşme tarafından uygulanan sınırlamaları ile aynı hücrede birden çok gen transkript görüntüleme izin verebilirsiniz. Aşağıda resimli Protokolü tamamlanmasını takiben, hücreleri kolayca düşük yoğunluktaki floresan için uygun bir fotoğraf makinesi ile birleştiğinde bir mikroskop kullanarak yansıması. Bu görüntüler, segmentasyon faz kontrast kare veya hücre zarı boyama, elde edilen hücre dağılımları ile birlikte mRNA kopya numarası dağıtım örneği açık kaynak veya özel olarak yazılmış yazılım kullanarak hücre hesaplama sağlar. Burada açıklanan etiketleme yöntemi Ayrıca resmi transkript Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına) ile uygulanabilir.
Introduction
Stochasticity gen ifadesinin temel ve kaçınılmaz bir unsuru ve hücre-hücre heterojenite1, transkriptler ve proteinler2,3düzeyinde hem de açmaktadır. İyi tanımlanmış koşullar altında hücreler arasında değişkenlik miktarının benzersiz bir pencere gen ekspresyonu ve onun yönetmelik altında yatan temel işlemleri halinde sunmaktadır. Bakterilerde hücre-hücre heterojen bir önemli kaynağı transkripsiyon düzeyinde gerçekleşir. Transkript numaraları sadece stochasticity transkripsiyonu, aynı zamanda düzenleme gibi çoğu işlemleri nedeniyle küçük RNA'ların ve RNAases2tarafından değişir. Doğrudan erişim Bu heterojenlik nicel bir moda bir fluorescently smFISH içinde belirli bir gen bireysel Tutanaklar etiketleyerek yoludur. Bu metodoloji algılama ve belirli RNA molekülleri, hücre altı yerelleştirme sabit, bireysel bakteri hücreleri4sağlar. mRNA'ların seçmeli olarak faiz5,6transkript bağlamak için tasarlanmış fluorescently etiketli ~ 20 Bankası-uzun oligonucleotides bir dizi melezleşmiştir. Birden çok etiket yukarıda arka plan Floresans algılama sağlar ve bireysel mRNA molekülleri kırınım-sınırlı noktalar bir floresan mikroskop altında7 (bkz: şekil 1) olarak görünür. MRNA molekülleri, tamamlayıcı oligomer probları ikincil fluorescently etiketli muhabir teknikleri8kullanarak algılanır konjuge anhidridler (örneğin, biotin veya digoxigenin) taşımak etiketleme için diğer yaklaşım vardır.
Tutanaklar, ek olarak smFISH hakkında kantitatif bilgi başka yöntemleri de vardır. Kuzey gibi bazı leke veya kantitatif PCR, toplu yoklama ve böylece ne mRNA kopya sayısı ne de tek tek hücreler içindeki konumlarını ölçebilirsiniz. Bu nedenle bu yöntemler hücre hücre değişkenlik ölçmek uygun değildir. Hata-sağlam Floresans in situ hibridizasyon (MERFISH) hem RNA'ların kopya numarası hücrelerindeki hem de denilen hücre içi konumlarını miktar multiplexed için izin veren bir son görüntü tabanlı teknik geliştirilmiştir. MERFISH tanımlanmış bir arada sabit sayıda Oligonükleotid fluorescently etiketli sonda gelen oluşan benzersiz bir barkod atama temel alır. Bu barkodları smFISH ölçümleri sıralı tur olarak okunduğu, photobleaching ile hibridizasyon, böylece artan işlem hacmi iki büyüklük9,10tarafından aşağıdaki her yuvarlak. Bu teknik bir otomatik akışkan sistemi ve sonda kümesinin uygun tasarım gerektirir.
Birden çok floresan Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)11gibi roman süper çözümleme teknikleri ile birlikte bireysel transkript etiketlerine göre ile birlikte çözünürlükte panolarında bir artış sağlar transkript hücre altı lokalizasyonu. FIRTINADA, Floresans emisyon (yanıp sönen) prob molekül başına birden fazla döngüleri için uygun kombinasyonu floresan problar ve görüntüleme arabellek sağlar. Fırtına da E. coli transcriptome görüntü ve aynı anda transkriptlerinizin faiz12etiketleme tarafından RNA, genom çapında mekansal organizasyonu gözlemlemek için kullanılabilir.
Yukarıda gözden tüm tek hücreli yöntemleri sabit hücrelerdeki transkript görüntüleme üzerinde temel alır. Bu nedenle, onlar transkript hücrelerdeki Kinetik özelliklerinin ile ilgili herhangi bir bilgi vermeyin. Transkript canlı hücreleri13izlemek için mRNA'ların ilgi siteleri bağlama, bir dizi gen füzyonu tarafından etiketli. Bu ikinci o zaman bakteriyofaj gibi yeşil flüoresan protein (GFP)10,14,15floresan bir protein için erimiş MS2 kat protein gibi bir RNA-bağlayıcı protein tarafından tanınır.
Burada DNA probları fluorescently etiketli smFISH deneyler, kullanmak için bir dizi bireysel mRNA'ların özellikle E. colietiketleme yöntemi açıklanmaktadır. Ayrıca, aynı etiketleme şeması fırtına ölçümleri ile küçük değişiklikler için kullanılan gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sonda tasarım
Not: Bu protokol piyasada bulunan Oligonükleotid probları zaten fluorophores ile öğesini kullanır. Sondalar belirli dizileri bir hedef için tamamlayıcı bir dizi oluşur mRNA, floresan molekülünü Birleşik her sonda. Alternatif olarak, başka bir yerde5,16açıklandığı gibi probları için floresan işaretleri eklemek mümkündür.
- Tasarım smFISH sondalar Arjun Raj (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology); tarafından geliştirilen Probe Tasarımcısı16 algoritması kullanılarak Bu el yazması kullanılan smFISH sondalar dizisi malzemeleri tabloda listelenir.
Not: Minimum algılanabilir sinyal için bir küme probları ~ 30 sayısıdır. Özellikle çok kısa transkript ölçülür Eğer hassas numarası faiz, gen göre değişebilir. - Optik kurulum uygun bir boya seçin (malzemelerin tabloya bakın).
Not: Cy3 boya veya düşük bir fotoğraf beyazlatma duyarlılık ile optik eşdeğer bir boya önerilir. Çift etiketleme için bir Cy5 ya da bir optik eşdeğer adaydır boya (malzemelerin tabloya bakın). Fırtına görüntüleme etiketli mRNA uygun boyaları kapasitelerini Floresans emisyon birden fazla döngüleri için karakterizedir. Bazı smFISH boya kullanılabilir fırtına görüntüleme için (malzeme tabloya bakın). İki (veya daha fazla) Tutanaklar aynı hücrede farklı genler karşılık gelen görüntü biri olan spectra az veya hiç çakışma var boyalar için Birleşik Oligonükleotid probları seçmelisiniz.
2. reaktif hazırlık
Not: Filtre uygulanmış pipet ipuçları ve tüpler gibi RNase free sarf malzemeleri kullanarak örnekleri RNAse free tutmak için ve herhangi bir çalışma ortamı temiz tutmak için önemlidir. Hedef transkript bozulma önlemek için hücre fiksasyon kullanılan tüm reaktifler nükleaz ücretsiz olması gerekir (malzemelerin tabloya bakın) veya diethylpyrocarbonate (DEPC)-tedavi ve sterilize.
- Arabellekleri için smFISH
- 1 x PBS (fosfat tamponlu tuz, bir fosfat tampon konsantrasyonu 0.01 M ve Sodyum Klorür konsantrasyon 0.154 m, (pH 7,4) ile çözüm) RNase free hazır olun. 10 x PBS RNase free seyreltik (malzemelerin tabloya bakın) nükleaz-serbest su (malzemelerin tabloya bakın) 1:10, v/v oranı.
- Alternatif olarak DEPC tedavi 1 hazırlamak PBS x.
- RNase free hazırlamak 2 x SSC (serum sodyum sitrat arabellek, 0,03 M sodyum sitrat, (pH 7,0) 0.3 M NaCl). RNase free seyreltik 20 x SSC (malzemelerin tabloya bakın) nükleaz ücretsiz su 1:10 v/v oranı.
- Alternatif olarak, DEPC tedavi 2 hazırlamak x SSC.
- 1 x PBS (fosfat tamponlu tuz, bir fosfat tampon konsantrasyonu 0.01 M ve Sodyum Klorür konsantrasyon 0.154 m, (pH 7,4) ile çözüm) RNase free hazır olun. 10 x PBS RNase free seyreltik (malzemelerin tabloya bakın) nükleaz-serbest su (malzemelerin tabloya bakın) 1:10, v/v oranı.
- Oligonükleotid sonda hisse senedi çözüm.
- Bir sonda hazır 25 µM. oluşturmak için TE arabelleği (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 200 µL kurutulmuş Oligonükleotid sonda grubunda yeniden dağıtılması Mix de tarafından yukarı ve aşağı, pipetting ve sonra girdap ve santrifüj kısaca.
- Donma ve hisse senedi çözüm tüp tezcan önlemek için karşılık gelen tutarı çalıştırmak tek bir deneysel kullanılacak beklenen stok çözümün birkaç aliquots edin. -20 ° c veya daha düşük stok çözüm depolamak ve ışıktan korumak.
Not: 250 hibridizasyon reaksiyonlar 5 nmol sonda kümesi sağlar.
- Hibridizasyon arabellek (aşağıdaki Skinner vd. 7 ):
- 5 mL su nükleaz ücretsiz 50 mL polipropilen alt konik tüp ekleyin. Dextran sülfat 1 g için su ekleyin ve dinç vortexing tarafından çözülür. Kadar kabarcıklar (~ 30 min) ortadan içeriği bir orbital shaker karıştırın.
- Deiyonize suyla formamide, E. coli tRNA, 10 mg çözüm 3,530 µL 20 SSC x 1 mL, 100 µL 200 mM vanadyl-ribonucleoside kompleks ve 50 mg/ml BSA 40 µL ekleyin. Homojen olana son hacim için 10 mL DEPC tedavi su veya su nükleaz-Alerjik ve girdap eklenmesi tarafından çözüm getirin.
Not: donma ve erime çözüm önlemek için karşılık gelen tutarı çalıştırmak tek bir deneysel kullanılacak beklenen stok çözümün birkaç aliquots olun. Mağaza-20 ° C'de hisse senedi çözüm Şişeyi açmadan önce oda sıcaklığına kadar sıcak formamide bildirin emin olun. Arka plan azaltmak için en uygun formamide konsantrasyonu (% 10-40 hacmen oranı) kalibre için önerilmektedir.
Uyarı: UYARI! Formamide çok zehirli ve bilinen bir teratogen. Gözleri ya da deri, solunum veya sindirim ile temasından sakının. Bir duman başlık altında koruyucu eldiven ve önlük giyerken başa. - Çözüm 0,22-µm filtreden geçirilerek sterilize. Aliquots içinde tutmak ve bir yıl için-20 ° C depolama yapar.
- 1 x PBS'ye % 37 formaldehit (v/v) ekleyerek fiksasyon arabellek (1 x PBS % 4.6 formaldehit) hazırlamak (bkz. 2.1.1) 1:8 v/v oranı ve girdap.
DİKKAT: UYARI! Formaldehit çok zehirli ve bilinen bir kanserojen. Bir duman başlık altında koruyucu eldiven ve önlük giyerken başa. - SmFISH için yıkama arabellek hazırlamak (% 20 formamide 2 x SSC) 2'ye deiyonize suyla formamide ekleyerek x SSC (bkz: 2.1.2) 1:4 v/v oranı ve girdap.
- Görüntüleme arabellek arabellek yıkamak için 5 mM cysteamine ve oksijen gidericiler (7 µM glikoz oksidaz, 56 nM katalaz ve % 10 glikoz (w/v)) ekleyerek smFISH için hazırlamak (% 20 formamide 2 x SSC)
- Fırtına arabellekleri
- Arabellek A 50 mM Tris-HCl ve 10 mM NaCl nükleaz ücretsiz su ekleyerek hazırlayın.
Not: RT yıl boyunca dükkanda. - Arabellek B 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl ve % 10 w/v ekleyerek glikoz nükleaz ücretsiz su için hazırlayın.
Not: Mağaza 4 ° C'de için bir yıl kadar. - MEA arabellek 77 mg cysteamine 1 ml (1 M çözüm sağlar) arabelleği A çözülerek hazırlayın.
Not: Bu 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır. - Gloxy arabellek 8,440 AU (rasgele adet) glikoz oksidaz ekleyerek hazırlamak ve 1 ml 70,200 AU katalaz tampon A.
Not: 50 x hisse senedi çözüm, yapar o-ebilmek var olmak stok 4 ° C'de 1 ay için. - MEA arabellek ve 1 Gloxy arabellek arabellek B. x 50 mM ekleyerek fırtına için görüntüleme arabellek hazırlamak
Not: Görüntüleme arabellek fırtına için 5 mM cysteamine, oksijen gidericiler (7 µM glikoz oksidaz ve 56 nM katalaz) 50 mm Tris ile 10 mM NaCl ve % 10 glikoz pH 8.0 oluşur. Sadece görüntüleme önce hazırlamak, saklanır ve RT yaklaşık 2 saat için kullanılır.
- Arabellek A 50 mM Tris-HCl ve 10 mM NaCl nükleaz ücretsiz su ekleyerek hazırlayın.
3. örnek fiksasyon
- Bakteri hücreleri (örneğin, E. büyümek
Not: arka plan sondalar non-spesifik bağlanması nedeniyle belirlemek için faiz gen silinmiş bir yük ölçümlerde, (bkz: şekil 1 ve ΔsodB içinde Δgalk aynı yordamı yapılmalıdır Şekil 2).
Not: Seçilen mikroskop faz kontrast veya fark girişim kontrast yetenekleri varsa, E. coli dış membran 2 mikron lipofilik floresan marker ile Etiketlenmiş (malzemelerin tabloya bakınız), hangi eklenmektedir Bakteriyel süspansiyon 20 dk önce fiksasyon17. Fiksasyon ve daha ileri tedavi aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirilir. Bir farklı emisyon spektral örtüşme etiketli-sonda seti ile en aza indirmek için spektrum, sahip bir floresan işaretçisi seçmeye özen göstermelidir.
4. örnek Permeabilization
- Süpernatant çok dikkatli bir şekilde çıkarın. Küçük hacimli Pipetler, gerekirse, pelet dışında tüm sıvı kaldırmak kullanın.
- 300 µL DEPC tedavi su veya su nükleaz ücretsiz resuspend. 350 µL yüksek dereceli mutlak etanol (% 99) ekleyin ve karışımı yavaşça tüp ters çevirme. Etanol ve mix yeniden, son etanol konsantrasyonu % 70 (v/v oranı) ulaşmak için başka bir 350 µL ekleyin.
DİKKAT: UYARI! Etanol yanıcı. - Örnek 20 rpm (RT) oda sıcaklığında 1 h için bir tüp rotator ile döndürme, veya bir gece 4 ° C'de. Örnekleri 4 ° C'de bir haftaya saklanabilir.
5. hibridizasyon
- Pelet hücreleri tarafından Santrifüjü 7 dk, 750 x g, 4 ° C. Süpernatant kaldırın.
- 1 mL % 20 örnekleri arabelleğe yıkama ve ayakta birkaç dakika veya pipet Pelet tamamen erimesi için bırakın ekleyin.
- Pelet hücreleri Santrifüjü için 750 x g, 4 ° c de 7 min tarafından
- Süpernatant çok yavaşça pipetting tarafından çıkarın. Küçük hacimli Pipetler gerekirse, pelet dışında tüm sıvı kaldırmak kullanın.
- Oligonükleotid sonda ayarla hisse senedi çözüm hibridizasyon arabellek aliquot böylece son Oligonükleotid konsantrasyon 250 eklemek nM; girdap şiddetle.
Not: Bir iki veya daha fazla farklı hedef mRNA'ların aynı hücrede aynı anda etiketleyebilirsiniz. Her iki hedef grupları sonda hibridizasyon arabelleğe ekleyin. Boyalar farklı emisyon spektral örtüşme (örneğin, Cy3 ve Cy5) en aza indirmek için spectra sahip seçmek için özen göstermelidir. Fırtına görüntüleme için amaçlanan örnekleri ayarla (örneğin, tablo malzemelerin) fırtına için uygun bir boya ile konjuge bir Oligonükleotid sonda ile melezleşmiştir emin olun. - (Bkz. Adım 5,4) örnekleri (çözüm oldukça viskoz) kabarcıklar nesil kaçınırken Oligonükleotid probları içeren 50 µL hibridizasyon arabelleği askıya.
- Örnekleri gece karanlıkta 30 ° C sıcak bir blok üzerinde bırakın.
Not: Bu örnekleri 6 ay 4 ° C'de depolanmış olabilir
6. çamaşır
- Görüntü için her örnek için bir yeni microcentrifuge tüp kullanın. 1 mL yıkama arabellek ekleyin.
- 10-15 µL melezleşmiştir örneklerinden yıkama tamponu ve mix/girdap içeren yeni tüp ekleyin.
- Pelet hücreleri tarafından 7 dakika aralıklarla, 750 x g 4 ° C'de Süpernatant kaldırın.
Not: arka plan azaltmak için 30 ° C'de 1 h için kuluçkaya - İki kez daha fazla yıkamak (1 mL yıkama arabellekte resuspend, santrifüj kapasitesi ve Pelet kaldırın).
- 25 µL yıkama arabellekte resuspend.
Not: bir fotoğraf beyazlatma azaltmak için yıkama arabelleğe tek molekül Floresans deneyler6boya kararlılığını artırmak için sistem (2,6) atma bir oksijen ekleyebilirsiniz.
7. görüntüleme için örnek hazırlanması
Not: Hücreleri floresan ve faz kontrast mikroskop altında uygun görüntüleme izni vermesi için immobilize gerekir. Hangi bakış farklı alanları farklı odak uçaklar yansıma örnekleri hazırlamak için aşağıdaki yöntemleri kullanılabilir.
- Özel jel hazırlık
- 150 mg özel 10 mL 2 x SSC arabelleğe ekleyin. 2 eklemek değil x SSC için özel, ya da o değil düzgün dağıtılması.
- Mikrodalga fırında 10-15 s her zaman-e kadar büyük kabarcıklar oluşmaya başlar. Birkaç dakika soğuması için bir kenara koyun.
- Böylece slaytın Merkezi maruz kalır ayıran bir silikon çerçeve slayt üzerinde yer.
- Bir 10 mm çapında (1-2 mm kalınlığında) katı halka slaytın ortasına yerleştirin ve jel küçük bir miktar, sızdırmazlık için mevduat. Sertleşmesine o için birkaç dakika bekleyin.
- Yüksek kubbe şekli kurdu kadar daha jöle ekleyin. Sertleşmesine bunun için 10 dakika bekleyin ve (iyi cımbız veya başka bir yöntemi kullanarak) yüzük kaldırın.
- (Bkz: 6.5) yıkanmış bakteriyel hücre jel ve mühür #0 coverslip slayt ile ~ 10 μL Kasası.
- Odası numune hazırlama smFISH için
- Alternatif olarak (için adım 7.1) örnekleri (bkz: 6.5) yıkanmış bakteri hücreleri Poli-D-lizin-kaplı cam alt tek kullanımlık plastik petri yemekleri immobilizing tarafından görüntüleme için hazır olun.
- Karanlık gecede görselleştirme hücre yüzeyine yapışma sağlamak için önce oda sıcaklığında örneklerinde kuluçkaya. Görselleştirme daha önce bir kez yıkama arabellek ile yıkayın (. 5); smFISH (2,6) için yıkama buffer(2.5) veya görüntüleme arabellek ile ıslak örnek tutmak.
- Fırtına için odası numune hazırlama
- Örnekleri fırtına için Poli-D-lizin-kaplı cam alt tek kullanımlık plastik petri yemekler üzerinde görüntüleme için hazır olun.
- Örnekleri, RT, karanlık gecede kuluçkaya. Görselleştirme yıkama daha önce bir kez ile yıkama arabellek için smFISH (2.5); ve görüntüleme arabellek fırtına (2.7.5) ekleyin.
8.Transkript görselleştirme
- Görüntü hücre motorlu bir sahne ile donatılmış geniş alanlı floresan mikroskop ile (malzemelerin tabloya bakın).
Not: Bir boya ile floresan emisyon birden fazla döngüleri yetenekli etiketli hücreleri fırtına değiştirilmek üzere kullanın. 3D süper çözünürlük görüntüleme sistemi kullanarak örnek resim (örneğin, malzemelerin tabloya bakın). - (Önerilen) kullan bir 60-100 x N.A > 1.3 yağı daldırma faz kontrast objektif lens cıva veya metal halide lamba; gibi güçlü bir ışık kaynağı ile LED tabanlı ışık kaynakları da önerilir.
- Bir standart soğutmalı CCD kamera, ideal olarak düşük ışık düzeyi görüntüleme hızı (biz kullanmak yerine bir kamera ile 16 µm piksel boyutu) için optimize edilmiş kullanımı (malzeme tabloya bakın).
Not: Kullanım bir soğutulmuş EMCCD (elektron birleştiğinde şarj cihaz çarparak) kamera CCD kamera algılama, özellikle tek moleküllerin engeller termal gürültü azaltmak gereklidir. - Filtresi kullan seçilen fluorophores için uygun ayarlar.
- Düzgün hücre sınırlarını belirlemek için her örnek faz kontrast optik ile veya dış hücre membran fluorescently etiketleme görünümünde farklı alanları görüntülerini elde etmek. Görüntüleri tüm kanallar için farklı odak uçaklar (z-yığın), (genellikle 13 dilimleri ayırarak tarafından 250 nm alınır).
Not: Mikroskop ve filtre setleri, motorlu sahne ticari tarafından kontrol edilmelidir (malzemelerin tabloya bakın) ya da bir yığın görüntülerin sırayla yakalayabilir şirket içi bilgisayar yazılımı.
9. veri analizi
- Görüntü yığınları veri analizi için uygun bir biçime dönüştürme.
- Hedef kopya sayısını tahmin mRNA floresan foci hücrede toplam yoğunluğunu, yerine ayrık 'noktalar' şu anda mevcut diğer iletişim kuralları olduğu gibi sayma.
- Görüntü analizi ile açık kaynak yazılım18 veya özel olarak oluşturulmuş bir program ile yerine getirir. Veri ayrıntıları için bkz: görüntüleme ve analiz Skinner vd. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz smFISH ölçümleri galK ve sodB transkript E. coli hücrelerdeki yürüttü. Transkript belirli dizileri için hedef sıra, floresan molekülünü Birleşik her sonda tamamlayıcı bir dizi melezleşmiştir (malzemelerin tabloya bakın). Floresan ve faz kontrast görüntüleri MG1655 vahşi-tip e.coli suşu (WT) veya bir JW0740 (Keio koleksiyon)19 galK silinmiş yük (ΔgalK) 2 mm D-fucose şekil 1A ve 1Bgösterilir maruz. Hücreleri en az 3 h D-fucose maruz kaldıktan sonra tespit edildi. Şekil 1A (üst) panellerinde hücre kontür galK indüksiyon yanıt olarak değişken ekstraselüler D-fucose konsantrasyonları düzeyini temsil eden odakta olan yüksekliğine karşılık gelen 13, dışarı bir çerçeve göster. Ya tek veya birkaç galk transkript noktalar hücreleri floresan görüntü içinde karşılık gelen ve her hücredeki transkript numarasını belirlenmesi yerelleştirilmiş Floresans miktarının tarafından gerçekleştirilir. Birkaç noktalar ekstraselüler D-fucose yokluğunda görülür ise 2 mM D-fucose bakteri kültürü için eklendiğinde çok sayıda noktalar en hücreler görülür. ΔgalK zorlanma yok noktalar üzerinde arka plan olarak beklenen gözlenir. Lipofilik floresan marker ile etiketleme yüzey şekil 1B adımında (alt) gösterilir.
Buna ek olarak, E. coli bakteri kültürü Logaritmik büyüme aşamasında LB ortamda yetiştirilen sodB transkript görüntüsü. Floresan ve faz kontrast görüntüleri smFISH WT veya bir JW1648 (Keio koleksiyon)19 sodB-silindi yük (ΔsodB) şekil 2Agösterilir. Şekil 2A (üst) panelleri bir çerçeve hangi hücre, kontür sodBdüzeyini temsil eden odakta olan yüksekliğine karşılık gelen 13, dışarı göster. ΔsodB zorlanma yok noktalar üzerinde arka plan olarak beklenen gözlenir.
Aynı kültürler tarafından fırtına (üst) görüntüsü ve parametreleri hücrelerin sodB hücrelerde lokalizasyonu göstermek için bir lipofilik floresan işaretleyici kullanarak etiketleme yüzeyi ile belirlenmiştir. Membran boyama transkript (şekil 2B) hücresindeki doğru konumlandırma sağlar. ΔsodB zorlanma arka plan sinyal olarak ve en az küme boyutu olarak alınmıştır (bkz. şekil 2B). Ortalama transkript, smFISH2 ve fırtına karşılaştırılabilir sayısıdır.
Şekil 1: D-fucose etkilerini galK transkript görselleştirildiği smFISH kullanarak. (A) Top: galK floresan smFISH görüntülerini bireysel E. coli mRNA hücreleri. Bir MG1655 vahşi tipi yük (WT) veya bir JW0740 (Keio koleksiyon) silinmiş galK -gerilim (ΔgalK)19 veya 2 mM D-fucose olmadan büyüdü. GalK transkript tamamlayıcı probları optik Cy3 için eşdeğer bir boya ile Birleşik melezleşmiştir (malzemelerin tabloya bakın). Alt: aynı alanları görmek faz kontrast. (B) ile WT hücreleri yetiştirilmiştir veya 2 mM D-fucose yukarıdaki ve 2 mikron lipofilik bir membran ile Etiketlenmiş olarak 20 dk önce fiksasyon için boya (malzemelerin tabloya bakın). Top: floresan görüntüleri galK mRNA smFISH kullanarak. Görüntüleri bir 100 × N.A 1,45 yağı daldırma faz kontrast objektif lens kullanarak ticari yazılım tarafından kontrollü bir mikroskop ile alınmıştır (malzemelerin tabloya bakın) ve bir EMCCD kamera (malzemelerin tabloya bakın). Kullanılan filtreler malzemeleri tabloda açıklandığı gibi idi. Bir faz kontrast görüntü z yığını 13 dilimleri ve 250 nm aralığı her dilim için 2 s Tümleştirme zamanla floresan görüntülerin ardından satın alınmıştır. Orta: faz kontrast görüntüleme aynı alanları elde edersiniz. Alt: hücreler uygun filtre malzemeleri tabloda açıklanan lipofilik floresan işaretleri ile Etiketlenmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: sodB of Imaging Tutanaklar ile aynı prob etiketli smFISH ve fırtına ayarlayın. (A) Top: sodB floresan smFISH görüntülerini bireysel E. coli mRNA hücreleri. Bir MG1655 vahşi tipi yük (WT) veya bir JW1648 (Keio koleksiyon) silinmiş sodB -gerilim (ΔsodB)19 LB ortamda yetiştirilen. SodB transkript tamamlayıcı probları optik Cy5 için eşdeğer bir boya ile Birleşik melezleşmiştir (malzemelerin tabloya bakın). Alt: aynı alanları görmek faz kontrast. (B) kaplama, floresan moleküllerin (bireysel renkli noktalar) fırtına lokalize (670 nm emisyon) ve hücre zarlarında aynı görüş alanı içinde bir görüntüsüdür. Hücreleri lipofilik bir boya, 488 bir argon lazer ile heyecanlı etiketlenmiş 510 emisyon zirve ile maksimal güç (0.05 kW/cm2) % 1 nm nm ve uygun görüntüsü (malzemelerin tabloya bakın) filtre. WT ve sodB hücreleri yukarıda açıklandığı gibi büyüdü ve bir 2 ile etiketli mikron lipofilik membran boya (malzemelerin tabloya bakın) için 20 dk fiksasyon için önceden. Süper çözünürlük fotoğraf ticari mikroskopla kaydedildi (malzemelerin tabloya bakın). Optik Cy5 için eşdeğer bir boya ile etiketli transkript lokalize bir uyarma lazer 647 kullanarak nm içinde fırtına için görüntüleme bir tampon. Görüntüleri kullanarak bir 60 x, NA 1.2 su daldırma amaç kaydedildi (malzemelerin tabloya bakın) ve bir EMCCD kamera (malzemelerin tabloya bakın) 50, ayarla kazanç ile kare hızı 50 Hz ve 5 ve 0.05 kW/cm2 adlı ayarla 647 ve 405 nm lazer maksimal güç , sırasıyla. Toplam alınan çerçeve sayısı 8.000 yapıldı. Veri ticari yazılım kullanarak analiz (malzeme tabloya bakın). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
E. coli hücrelerdeki smFISH yöntem2kullanarak farklı genler transkript sayısı bizim laboratuvar olarak ölçülen var. Kısacası, bu yordamı aşağıdaki adımlardan oluşur: hücre fiksasyon, membranlar sonda penetrasyon için izin vermek için permeabilization sonda hibridizasyon ve örnek bir standart floresan mikroskop kullanarak görüntüleme. Bu yordam önceden yayınlanmış olanlar bazı değişiklikler6,7,16ile temel alır. Daha önce bu smFISH Oligonükleotid probları sayısı aralığında 48-72, iyi arka plan7yalan bir sinyal elde etmek için yalan gerektirir bildirilmiştir. Biz bu sayı aslında daha küçük20, faiz, optik kurulum ve belirli deneysel koşullar Gen dizisi bağlı olarak olabilir göstermiştir.
Her sonda 17-22 nükleotit bir arası sonda ayrılması en az iki ile uzun olmalıdır nukleotid ve non-spesifik, etkilerini azaltmak için % ~ 45, GC içeriğini kapalı-hedef bağlama. Bazı probları bir hedef bağlamak başarısız olabilir ve bağlama genel verimliliğini fiksasyon ve hibridizasyon21şartları gibi deneysel prosedürler değişiklikler tarafından optimize edilebilir. Dikkate alınması gereken önemli bir faktör fluorophores seçimdir. Düşük duyarlılık fotoğraf beyazlatma ile bir boya ile probları etiketlemek için önerilir. Fotoğraf ağartma minimizasyonu pozlama süreleri, aydınlatma kaynakları ve resim alma zamanlarında Tümleştirme duruma getirilmesi ve bir oksijen sistemi atma eklenmesiyle elde edilebilir.
Non-spesifik bağlama olayları kapsamını smFISH deneyler ile hangi hedef genlerin, örneğin Keio koleksiyonu19silinir suşları hücrelerden gerçekleştirerek değerlendirilmesi. Arka plan sinyal yüksek ise, numarası ve adımları yıkama süresi artırılmalıdır veya hücreleri yıkama arabellek için 1S 30 ° C'de inkübe ve sonra iki kez yıkanmış. Ayrıca, arka plan azaltmak için bu hibridizasyon ve yıkama arabellekleri formamide konsantrasyonu (% 10-40 hacmen oranı) en iyi duruma getirmek için önerilmektedir. Formamide konsantrasyonu artan nonspesifik bağlama azaltır, ancak Ayrıca hedef sonda bağlama azaltabilir mRNA. Hibridizasyon adımı sırasında süpernatant tamamen kaldırmak önemlidir; seyreltik hibridizasyon bellek için verimliliği etiketleme azalma neden olabilir. Buna ek olarak, hedef RNA'ların arka plan üzerinde iyi yerelleştirilmiş bir yer elde etmek için yeterince uzun olmalıdır. Sinyal son gelişmeler-oranları gürültü ve özgüllük modifikasyonu omurga sondalar şimdi aracılığıyla yapmak bağlama kısa RNA tespit etmek mümkün ökaryotik mikroRNA'lar veya bakteriyel küçük kodlamayan RNA'ların2, gibi parçaları, 10. smFISH tarafından elde edilen ortalama kopya numarası ile kantitatif PCR7,16doğrulanması gerektiğini tavsiye ediyoruz.
Bu el yazması bu yöntem E. coli transkript lokalizasyonu daha yüksek optik çözünürlük Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)11kullanarak eğitim için küçük değişiklikler ile değiştirilebilir göstermiştir.
Özetle, smFISH hücre-hücre değişkenlik transkript numarasında doğrudan ölçülmesi ve hedef transkript Ökaryotlar ve prokaryot hücre yerelleştirme sağlar RNA aydınlatma için çok yönlü bir yöntemdir. Bu gen ekspresyonu kantitatif bilgi temel işlemler hakkında sağlar ve kolayca olabilir fırtına görüntüleme için uygulanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser bir İsrail Bilim Vakfı Hibe 514415 (js) ve bir BSF-NSF (MCB) hibe 2016707 (js) tarafından desteklenmiştir. Destek Siegfried ve Irma Ullman ne bağlı elektrikli sandalyeye (js) da kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker - Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen - Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 - 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24x60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa | |||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa |
References
- Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601 (2014).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
- van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
- Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628 (2014).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
- van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
- Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
- Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
- So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
- Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
- Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).
